流式細(xì)胞儀篩選環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的技術(shù)方法

劉仕杰，方展強

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室，廣州 510631)

微核實驗作為一種檢測遺傳毒物的短期測試法，已在細(xì)胞遺傳學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。但長期以來，微核檢測一直是由人工完成。由于微核在骨髓細(xì)胞以及外周血細(xì)胞中含量極少，一般要求計數(shù)數(shù)千個細(xì)胞，才能得到一個比較準(zhǔn)確的微核率，這樣導(dǎo)致人工閱片工作量太大且敏感性較低，并能導(dǎo)致一些樣本的漏檢或出現(xiàn)一些假陽性。80年代，Hutter和Stohr［1］最先應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了小鼠外周血中的紅細(xì)胞微核率。流式細(xì)胞儀在短時間內(nèi)能檢測大量的嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocytes，PCE)，與傳統(tǒng)的人工顯微鏡計數(shù)法相比，將其用于微核實驗，可使檢測更加快速、簡單，結(jié)果更加客觀可靠［2－3］。本實驗利用環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠和大鼠，染毒24 h后取骨髓細(xì)胞，經(jīng)過吖啶橙(acridine orange，AO)熒光染色，采用單激光流式細(xì)胞儀檢測骨髓細(xì)胞的含微核的嗜多染紅細(xì)胞(micronucleated PCE，MNPCE)和含微核的成熟紅細(xì)胞(micronucleated NCE，MNNCE)，比較兩者的量效關(guān)系，力圖建立一種基于單激光流式細(xì)胞儀的微核自動化檢測方法，初篩化合物誘導(dǎo)微核作用的毒性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠16只，體重18～22 g，1.5月齡;SPF級雄性SD大鼠16只，體重150～250 g，1.5月齡。均購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心【SCXK粵2006-0015】。小鼠和大鼠的組織取材于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部動物實驗設(shè)施內(nèi)進行【SYXK粵2006-0015】。實驗小鼠和大鼠分別稱重，編號，隨機分為4組，每組4只動物。實驗動物的使用及實驗過程“參照實驗動物使用的3R原則進行”［4］。

1.2 主要試劑及配置方法

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP);吖啶橙(acriding organe，AO)(北京索萊寶科技有限公司);TritonX-100(美國Sigma公司);固定液:含 SDS 30 μg/mL，1%(v/v)戊二醛的 Sorensen’s緩沖液(0.05 mol/L，pH6.8);溶液 A:0.1 mL Triton X-100+8 mL 1.0 mol/L HCl+0.877g NaCl，加蒸餾水至100 mL;溶液B:37 mL 0.1 mol/L無水檸檬酸 +63 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉 +0.877 g NaCl+34 mg EDTA-Na2+0.6 mL 1mg/mL AO水溶液;0.067 mol/L，pH7.2 Sorensen’s緩沖液。

1.3 主要儀器

離心機、流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡。

1.4 藥物處理

環(huán)磷酰胺用生理鹽水配制。設(shè)置4個劑量組:0、10、20 及 40 mg/kg。注射體積為 0.25 mL/100g體重。單次腹腔注射。給藥后24 h后取樣。

1.5 骨髓懸液的制備

小鼠骨髓懸液的制備:斷頸處死小鼠，分離雙側(cè)股骨，用1 mL注射器吸取400 μL小牛血清將骨髓沖出，反復(fù)吹打過濾制成懸液。大鼠骨髓懸液的制備:斷頸處死大鼠，分離雙側(cè)股骨，用1 mL注射器吸取400 μL小牛血清將骨髓沖出，反復(fù)吹打過濾制成懸液。

1.6 細(xì)胞固定與染色

取5 mL固定液，一邊劇烈振蕩，一邊加入200 μL 細(xì)胞懸液，固定5 min，1650 r/min離心5 min，去上清，細(xì)胞沉淀重新混懸于0.2 mL 0.067 mol/L，pH7.2 Sorensen’s緩沖液中。溶液A與溶液B在使用前置于冰上暗處，加入400 μL溶液A與1.2 mL溶液B，輕輕混勻，細(xì)胞于冰上暗處染色30 min。1650 r/min離心5 min，去上清，細(xì)胞沉淀重新混懸于 0.5 mL 0.067 mol/L，pH7.2 Sorensen’s緩沖液中。

1.7 流式細(xì)胞儀分析

儀器設(shè)置的參數(shù)包括:前置角散射光(forward angle scatte，F(xiàn)SC)，刻度設(shè)置為線性;DNA熒光(FL1，525 nm)，刻度設(shè)置為對數(shù)。分析速度為大約1000個細(xì)胞/秒。每個樣本檢測不少于200，000個細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀分析軟件 WinMDI進行分析。

1.8 人工顯微鏡檢測

同時采用顯微鏡進行人工鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測對小鼠骨髓各細(xì)胞群的區(qū)分效果

聯(lián)合使用前置角散射光(forward angle scatter，F(xiàn)SC)和DNA熒光(DNA fluorescence，F(xiàn)L1)作圖，可以明顯地區(qū)分小鼠骨髓樣本中5個細(xì)胞群的分布區(qū)域:嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocytes，PCE)(R1)，含微核的嗜多染紅細(xì)胞(micronucleated polychromatic erythrocytes，MNPCE)(R2)，成熟紅細(xì)胞(mormochromatic erythrocytes，NCE)(R3)，含微核的成熟紅細(xì)胞(micronucleated normochromatic erythrocytes，MNNCE)(R4)和有核細(xì)胞(nucleated cells，NC)(R5)(圖1A～D)。圖1所示，有核細(xì)胞和紅細(xì)胞區(qū)分界清楚，嗜多染紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞分界也較為清楚，含微核的紅細(xì)胞和不含微核的紅細(xì)胞分界雖有一定形態(tài)，但不是特別明顯，一方面流式細(xì)胞儀的分界本來就帶有一定主觀性，另一方面也提示我們是否可以改進試驗方法，使圖形更為明了。

2.2 不同劑量環(huán)磷酰胺染毒對小鼠24 h后的影響

彩插8圖1A～D顯示0，10，20和40 mg/kg不同劑量環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)處理24 h后，小鼠骨髓樣本各細(xì)胞群的分布及流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果。經(jīng)吖啶橙(acriding organe，AO)染色后，細(xì)胞形態(tài)完好，嗜多染紅細(xì)胞發(fā)出桔紅色熒光，所含微核為圓形，發(fā)出黃綠色熒光，易于分辨;成熟紅細(xì)胞無熒光，顯示為暗影?？梢?，在488 nm激發(fā)光下，AO熒光和DNA結(jié)合，發(fā)出黃綠色熒光，通過FL1通道檢測，以FL1為縱軸，有核細(xì)胞DNA含量最多，在最上方，嗜多染紅細(xì)胞其次，在縱軸的中間，成熟紅細(xì)胞在最下方;因CP毒性作用阻礙了DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞生長不平衡。而RNA的復(fù)制不受影響，因此，細(xì)胞分裂的延遲導(dǎo)致胞漿成分，尤其是血紅蛋白的生成增加，從而使含微核的細(xì)胞較正常細(xì)胞略大［5］，前置散射光FSC作為橫軸，指示了細(xì)胞的大小，含微核的細(xì)胞較大在橫軸的右邊，不含微核的細(xì)胞其左邊。圖1所示，有核細(xì)胞的DNA熒光強度最強，其細(xì)胞大小跨度也最大，而嗜多染紅細(xì)胞的DNA光強度則界于有核細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞之間。鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有微核的紅細(xì)胞比正常紅細(xì)胞要略大些，在二維等高圖上位于相應(yīng)正常紅細(xì)胞的右側(cè);與對照組(彩插8圖1A)相比，經(jīng)不同濃度CP處理后的各試驗組(彩插8圖1B～D)中，含微核的嗜多染紅細(xì)胞以及含微核的成熟紅細(xì)胞所在區(qū)域的細(xì)胞密度都有不同程度的增加。

根據(jù)分界進行窗口GATE設(shè)置，利用WinMDI軟件計算各細(xì)胞群的比例，結(jié)果如表1所示，隨著CP濃度的增高，含微核的嗜多染紅細(xì)胞也逐步增多，在CP到達40 mg/kg的時候，出現(xiàn)了細(xì)胞抑制(PCE/NCE＜1)。經(jīng)不同劑量CP處理24 h后，流式細(xì)胞儀檢測的小鼠骨髓樣本fMNPCE與fMNNCE隨著處理劑量由0 mg/kg增至40 mg/kg，fMNPCE平均值由5.79‰增至20.19‰，而fMNNCE平均值則由2.62‰增至3.36‰。圖2顯示了含微核的嗜多染紅細(xì)胞隨著CP濃度增高而增多，一元回歸方程顯示量效存在的關(guān)系(R=0.917)。

表1 環(huán)磷酰胺處理24 h后流式細(xì)胞儀檢測KM小鼠的骨髓fMNPCE與fMNNCE(‰)Tab．1 The fMNPCE and fMNNCE(‰)of KM mice bone marrow collected 24h after injection of cyclophosphamide by flow cytometry

圖2 環(huán)磷酰胺處理KM小鼠24 h后fMNPCE和環(huán)磷酰胺濃度的量效關(guān)系Fig．2 Dose-effect relationship of Cyclophosphamide(CP)concentrations and fMNPCE in KM mice exposed to CP after 24 h

2.3 流式細(xì)胞儀檢測對大鼠骨髓各細(xì)胞群的區(qū)分效果

與2.1相同，聯(lián)合使用FSC和FL1作圖，也可以明顯地區(qū)分大鼠骨髓樣本中5個細(xì)胞群的分布區(qū)域:嗜多染紅細(xì)胞(PCE)(R1)，含微核的嗜多染紅細(xì)胞(MNPCE)(R2)，成熟紅細(xì)胞(NCE)(R3)，含微核的成熟紅細(xì)胞(MNNCE)(R4)和有核細(xì)胞(NC)(R5)(圖3 A～D)。彩插9圖3所示，有核細(xì)胞和紅細(xì)胞區(qū)分界清楚，嗜多染紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞分界也較為清楚，含微核的紅細(xì)胞和不含微核的紅細(xì)胞分界雖有一定形態(tài)，但不是特別明顯。

2.4 不同劑量環(huán)磷酰胺染毒對大鼠24h后的影響

圖3A～D顯示使用0～40 mg/kg CP劑量處理24 h后，大鼠骨髓樣本各細(xì)胞群的分布及流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果。經(jīng)AO染色后，細(xì)胞形態(tài)完好，嗜多染紅細(xì)胞發(fā)出桔紅色熒光，所含微核為圓形，發(fā)出黃綠色熒光;成熟紅細(xì)胞無熒光，顯示為暗影。在488 nm激發(fā)光下，AO熒光和DNA結(jié)合，發(fā)出黃綠色熒光，通過FL1通道檢測，以FL1為縱軸，有核細(xì)胞在最上方，嗜多染紅細(xì)胞在縱軸的中間，成熟紅細(xì)胞在最下方;前置散射光FSC作為橫軸，指示了細(xì)胞的大小，含微核的細(xì)胞較大在橫軸的右邊，不含微核的細(xì)胞其左邊。彩插9圖3所示，有核細(xì)胞的DNA熒光強度最強，其細(xì)胞大小跨度也最大，而嗜多染紅細(xì)胞的DNA光強度則界于有核細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞之間。鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有微核的紅細(xì)胞比正常紅細(xì)胞要略大些，在二維等高圖上位于相應(yīng)正常紅細(xì)胞的右側(cè);與對照組(圖3A)相比，經(jīng)5～40 mg/kg不同濃度CP處理后的各試驗組(圖3B～D)中，含微核的嗜多染紅細(xì)胞以及含微核的成熟紅細(xì)胞所在區(qū)域的細(xì)胞密度都有不同程度的增加。

表2 環(huán)磷酰胺處理24 h后流式細(xì)胞儀檢測SD大鼠的骨髓fMNPCE與fMNNCE(‰)Tab．2 The fMNPCE and fMNNCE(‰)of SD rat bone marrow collected 24 h after injection of cyclophosphamide by flow cytometry

根據(jù)分界進行窗口GATE設(shè)置，利用WinMDI軟件計算各細(xì)胞群的比例，結(jié)果如表2所示，隨著CP濃度的增高，含微核的嗜多染紅細(xì)胞也逐步增多，在CP到達40 mg/kg的時候，出現(xiàn)了細(xì)胞抑制(PCE/NCE＜1)。經(jīng)不同劑量CP處理24 h后，流式細(xì)胞儀檢測的大鼠骨髓樣本fMNPCE與fMNNCE隨著處理劑量由0 mg/kg增至40 mg/kg，fMNPCE平均值由1.23‰增至7.33‰，而fMNNCE平均值則由2.44‰增至10.58‰。圖4顯示了含微核的嗜多染紅細(xì)胞隨著CP濃度增高而增高，明顯存在量效關(guān)系(R=0.977)。

圖4顯示了MNPCE隨著CP濃度增高而增多的量效關(guān)系，而且一元回歸方程顯示量效的存在一定的關(guān)系，這有待進一步研究。

圖4 環(huán)磷酰胺(CP)染毒SD大鼠24 h后fMNPCE和CP濃度的量效關(guān)系Fig．4 Dose-effect relationship of Cyclophosphamide(CP)concentrations and fMNPCE in SD rat exposed to CP after 24 h

3 討論

Hutter和Stohr［1］利用單激光流式細(xì)胞儀成功地檢測了小骨髓紅細(xì)胞微核，但這一方法尚不能區(qū)分嗜多染紅細(xì)胞(PCE)和成熟紅細(xì)胞(NCE)。Grawe等［6］則用噻唑橙染 RNA，Hoechst 33342染 DNA，成功地用雙激光流式儀將去除有核細(xì)胞后的小鼠外周血區(qū)分為4個細(xì)胞群:嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，含微核的嗜多染紅細(xì)胞(MNPCE)，成熟紅細(xì)胞(NCE)以及含微核的成熟紅細(xì)胞(MNNCE)。Cao等［7－8］隨后發(fā)展了該技術(shù)，使小鼠外周血嗜多染紅細(xì)胞微核流式儀自動化檢測技術(shù)達到實用化水平。孫立平等［3］又進一步建立了吖啶橙AO染色結(jié)合單激光流式細(xì)胞儀的大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率自動化檢測的方法，由于操作更為簡單，應(yīng)用更為普及，使其較基于雙激光流式細(xì)胞儀的微核自動化檢測方法具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

吖啶橙(AO)是一種異染性熒光染料，它對DNA和RNA均有很強的親和力。當(dāng)AO以插入方式與雙鏈核酸結(jié)合后，經(jīng)488 nm激發(fā)，530 nm處發(fā)黃綠色熒光，指示DNA;當(dāng)與單鏈核酸結(jié)合后，640 nm處發(fā)橘紅色熒光，指示 RNA。應(yīng)用乙二胺四乙酸(EDTA)能選擇性變性RNA，從而保證雙鏈RNA不會干擾DNA。酸性條件能夠促進核蛋白從DNA解離，從而使AO更加容易與DNA結(jié)合，進一步提升AO染 DNA 的能力［9－10］。理論上，可利用 FL1(黃綠色熒光，指示 DNA)或者 FL4(紅色熒光，指示RNA)區(qū)分嗜多染紅細(xì)胞(PCE)與成熟紅細(xì)胞(NCE)，然而，本實驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)L4根本不能區(qū)分PCE與NCE，而用FL1則能很好地對其區(qū)分，但FL1不能區(qū)分含微核的細(xì)胞和不含微核的細(xì)胞，如果利用FL1并結(jié)合 FSC(指示細(xì)胞大小)，則能區(qū)分PCE、含微核的嗜多染紅細(xì)胞(MNPCE)、NCE、含微核的成熟紅細(xì)胞(MNNCE)以及有核細(xì)胞(nucleated cell)。我們認(rèn)為，可能因為PCE含有較多的殘留細(xì)胞器—核糖體及線粒體，而RNA含量極少，所以利用FL4反而不能區(qū)分PCE和NCE，而利用FL1則更為合適區(qū)分 PCE和 NCE，同時，也正因為線粒體DNA干擾了FL1對含微核的細(xì)胞與不含微核的細(xì)胞的區(qū)分。

環(huán)磷酰胺(CP)是經(jīng)典染色體斷裂劑，在微核實驗中經(jīng)常被用作陽性對照試劑。在本實驗中，無論是CP誘導(dǎo)的小鼠骨髓fMNPCE還是大鼠骨髓fMNPCE都呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中CP誘導(dǎo)小鼠骨髓MNPCE在高濃度組(40 mg/kg)出現(xiàn)了骨髓抑制(PCE/NCE＜1)。正常情況下，紅血球的有絲分裂是一個同步化過程，從骨髓有規(guī)律地釋放大小均一的紅細(xì)胞進入外周血。微核，在血液學(xué)中又被稱為 Howell-Jolly小體，常見于巨幼細(xì)胞貧血［11］。可見，一般含有微核的紅細(xì)胞體積都較平常細(xì)胞大，這是因為CP毒性作用阻礙了DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞生長不平衡。由于RNA的復(fù)制不受影響，因此，細(xì)胞分裂的延遲導(dǎo)致胞漿成分，尤其是血紅蛋白的生成增加。從而使含微核的細(xì)胞較正常細(xì)胞略大［5］。本實驗正是利用這個特點，采用前置散射光FSC為橫坐標(biāo)，標(biāo)示細(xì)胞的大小，以區(qū)分含微核和不含微核的紅細(xì)胞，這同時要求我們尋找良好的細(xì)胞固定方法，以保證紅細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定。長期以來，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測微核往往包括較長時間的細(xì)胞固定，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生萎縮，以至細(xì)胞間大小的這種細(xì)微改變不能被檢出。本文參考了胡冰冰的實驗研究［12］，確定固定細(xì)胞的優(yōu)化條件為:戊二醛pH4.0～5.0;緩沖液為0.06 mol/L，pH7.2的索倫森緩沖液，并加入30 ug/mL SDS以防止紅細(xì)胞聚集成團。該實驗僅對細(xì)胞進行5 min固定，固定后的細(xì)胞形態(tài)非常規(guī)則，有利于流式細(xì)胞儀檢出細(xì)胞間在大小上的細(xì)微區(qū)別。

關(guān)于利用流式細(xì)胞儀自動化檢測外周血紅細(xì)胞MNPCE 的方法，Dertinger［13］提出利用CD71-FITC 標(biāo)記PCE的方法，并稱此方法簡單可信。他們采用－70℃至－90℃的甲醇固定紅細(xì)胞，再用重碳酸鹽緩沖液沖洗，細(xì)胞可以在4℃環(huán)境中保存至少1個星期。在染色上，因為PCE細(xì)胞膜表面上都有CD71受體(轉(zhuǎn)鐵蛋白)，他們采用CD71-FITC標(biāo)記PCE，再經(jīng)核糖核酸酶處理細(xì)胞，消化RNA后，加入PI熒光試劑，標(biāo)記微核，利用單激光流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)光，2500個細(xì)胞/秒速度檢測，很清楚將紅細(xì)胞區(qū)分為PCE，MNPCE，NCE和MNNCE 4個群。他們同時利用AO熒光染色，在顯微鏡下進行手工計數(shù)以作比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法數(shù)值相近，統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著差異，流式細(xì)胞儀因為可以計數(shù)整個樣本的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果更為靈敏，而且重復(fù)試驗比較，流式細(xì)胞儀自動化方法比手工計數(shù)方法變異性更小。

骨髓細(xì)胞相對于外周血細(xì)胞有其特殊性，骨髓懸浮液含有數(shù)量更大的有核細(xì)胞和相當(dāng)量的細(xì)胞碎片，這些都會干擾MN的正確計數(shù)，傳統(tǒng)的方法是利用Percoll離心或者纖維素柱分餾除去有核細(xì)胞、凋亡細(xì)胞或者細(xì)胞碎片［14－16］，即使這樣，運用流式細(xì)胞儀自動化檢測MNPCE還需加入更多條件來補償實驗方法的缺陷才得以更加準(zhǔn)確計數(shù)MNPCE［15］。Dertinger［17］使用和檢測小鼠外周血同樣的方法對小鼠骨髓細(xì)胞進行檢測分析，驗證此方法是否能夠同樣簡單有效地分析小鼠骨髓MNPCE。他們對實驗進行了2處略微地調(diào)整:1)延長RNase處理細(xì)胞時間，2)增加PI的濃度。結(jié)果表明，實驗?zāi)芎芎玫貙⒓t細(xì)胞分開 PCE，MNPCE，NCE，MNNCE 4個群，和AO染色的手工計數(shù)比較，具有很高的直線相關(guān)性(r=0.954)，他們得出流式細(xì)胞儀自動化檢測MNPCE起碼具有3個方面的優(yōu)勢:1)處理樣本比較容易，不需要特殊純化過程，2)分析效率高，可以達到8000 cells/s，1個樣本，流式細(xì)胞儀只需數(shù)小時分析，而手工方法需要1天時間，3)提高靈敏度，每個樣本可計數(shù)成千上萬個PCE，而不是手工方法只計數(shù) 1000～2000個 PCE。Dertinger［18］并利用單激光流式細(xì)胞儀成功檢測了人外周血的MNPCE。

Criswell［5］利用更簡單的吖啶橙(AO)熒光染色，單激光流式細(xì)胞儀成功檢測了大鼠骨髓的MNPCE。AO是一種異染性熒光染料，它對DNA和RNA均有很強的親和力。當(dāng)AO以插入方式與雙鏈核酸結(jié)合后，經(jīng)488 nm激發(fā)，530 nm處發(fā)黃綠色熒光，指示DNA;當(dāng)與單鏈核酸結(jié)合后，640nm處發(fā)橘紅色熒光，指示RNA。環(huán)磷酰胺(CP)是經(jīng)典染色體斷裂劑，CP毒性作用阻礙了DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞生長不平衡。由于RNA的復(fù)制不受影響，因此，細(xì)胞分裂的延遲導(dǎo)致胞漿成分，尤其是血紅蛋白的生成增加。從而使含微核的細(xì)胞較正常細(xì)胞略大。實驗采用了加入SDS和戊二醛的索倫式緩沖液固定細(xì)胞，固定時間僅5 min，而且保全了紅細(xì)胞的完整形態(tài)，固定后的細(xì)胞經(jīng)AO染色后，單激光流式細(xì)胞儀的FL1通道(綠光，指示DNA)區(qū)分PCE和NCE，利用FSC(指示細(xì)胞大小)區(qū)分含微核和不含微核的紅細(xì)胞，成功檢測了大鼠骨髓的MNPCE，結(jié)果和賴特吉姆薩染色手工計數(shù)相比，線性關(guān)系良好，沒有統(tǒng)計學(xué)上的差別。另外，他們同時還檢測了脾臟血的MNPCE發(fā)現(xiàn)，盡管用本實驗的方法檢測大鼠脾臟血的MNPCE有良好的量效和關(guān)系，但是MNPCE的本底數(shù)較手工計數(shù)要明顯增高，建議還是采用骨髓檢測。

為了能快速而簡單初篩化合物誘導(dǎo)微核的作用，本實驗采用了AO染色的單激光流式細(xì)胞儀方法檢測微核，實驗證明，此方法速度較快，僅用一種染料染色，不需要任何抗體標(biāo)記，細(xì)胞固定時間5 min即可;實驗靈敏度高，用很簡單的單激光流式細(xì)胞儀對整個樣本進行細(xì)胞技術(shù)。但是，實驗也存在不穩(wěn)定性，部分個體的MNPCE變化較大，甚至導(dǎo)致實驗組的標(biāo)準(zhǔn)差很高，這一方面說明體內(nèi)實驗的變異性較大，更能反應(yīng)個體差異，另外也提示應(yīng)用流式細(xì)胞儀界定細(xì)胞群的閾值是帶有一定主觀性，細(xì)胞群分界不一定十分明顯。這也提示我們實驗方法還存在一定的缺陷，從其他學(xué)者的實驗來分析，是否應(yīng)該使用虐原蟲感染的紅細(xì)胞做標(biāo)準(zhǔn)［19］，是否在固定液和染色方法上能進一步改善以使結(jié)果更為穩(wěn)定。總之，通過本實驗可為進一步研究快速自動化檢測化合物誘導(dǎo)微核作用的研究提供參考。

［1］ Hutter KJ，Stohr M．Rapid detection of mutagen induced micronucleated erythrocytes by flow cytometry［J］．Histochemistry，1982，75:353－362．

［2］ Abramsson-Zetterberg L，Zetterberg G，Bergqvist M，et al．Human cytogenetic biomonitoring using flow-cytometric analysis of micronuclei in transferrin-positive immature peripheral blood reticulocytes［J］．Environ Mol Mutagen，2000;36(1):22－31．

［3］ 孫立平，李德志，劉志謀，等．人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞的流式細(xì)胞儀自動化檢測［J］．癌變．畸變．突變，2004，16(3):159－162．

［4］ 賀爭鳴，李冠民，邢瑞昌．3R理論的形成、發(fā)展及在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用［J］．實驗動物科學(xué)與管理，2000，17(3):43－47．

［5］ Criswell KA，Krishna G，Zielinski D，et al．Use of acridine orange in:flow cytometric assessment of micronuclei induction［J］．Mutat Res，1998，414:63 －75．

［6］ Grawe J，Zetterberg G，Amneus H，et al．Flow_cytometric enumeration of micronucleated polychromatic erythrocytes in mouse peripheral blood［J］．Cytometry，1992，13:750 －758．

［7］ Cao J，Beisker W，Nusse M，et al．Flow cytometric detection of micronuclei induced by chemicals in poly_and normochromatic erythrocytes of mouse peripheral blood［J］．Mutagenesis，1993，8:533－541．

［8］ 曹佳，Nusse M，Beisker W，等．流式細(xì)胞術(shù)對小鼠外周血紅細(xì)胞微核自動化檢測的研究［J］．癌變·畸變·突變，1994，6(6):11－17．

［9］ Darzynkiewicz Z，Traganos F，Sharpless T，et al．Conformation of RNA in situ as studied by acridine orange staining and automated cytofluorometry［J］．Exp Cell Res，1975，95(1):143－153．

［10］ Darzynkiewicz Z，Traganos F，Sharpless T，et al．Lymphocyte stimulation，a rapid multiparameter analysis［J］．Proc Natl Acad Sci，1976，73(8):2881 －2884．

［11］ Hoagland HC，Gastineau DA．Hematologic complications of cancer chemotherapy［D］，in:M．C．Perry(Ed．)，The Chemotherapy Source Book．Williams ＆ Wilkins，Baltimore，MD，1992，pp．559－569．

［12］ 胡冰冰，楊錄軍，周燕虹，等．小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核單激光流式細(xì)胞儀自動化檢測［J］．癌變．畸變．突變，2006，18(1):19－22．

［13］ Dertinger SD，Dorothea K Torous，Kenneth Tometsko R．Simple and reliable enumeration of micronucleated reticulocytes with a single-laser flow cytometer［J］．Mutat Res，1996，371:283－292．

［14］ Romagna F， Staniforth CD． Theautomated bonemarrow micronucleus test［J］．Mutation Res，1989，213:91 －104．

［15］ Grawe J，Zetterberg G，Amneus H．Effects of extended low-doserate exposure to 137Cs detected by flowcytometric enumeration of micronucleated erythrocytes in mouse peripheral blood［J］．Int J Radiat Biol，1993，63:339 －347．

［16］ Krishna GD， UrdaBG， McKeelM， etal． Comparative micronucleus quantitation in pre-and post-column fractionated mouse bone marrow by manual and flow methods［J］．Mutation Res，1993，302:119－127．

［17］ Dertinger SD．Dorothea K，Torous NE，et al．Flow cytometric analysis of micronucleated reticulocytes in mouse bone marrow［J］．Mutat Res，1997，390:257 －262．

［18］ Dertinger SD， Dorothea K Torous， Nikki E Hall， et al．Enumeration of micronucleated CD71-positive human reticulocytes with a single-laser flow cytometer［J］．Mutat Res，2002，515:3－14．

［19］ Tometsko A，Torous D，Dertinger S．Analysis of micronucleated cells by flow cytometry:1．Achieving high resolution with a malaria model［J］．Mutat Res，1993，292:129 －135．