線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的實(shí)踐探討

劉國軍，溫世斌

（酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000）

線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的實(shí)踐探討

劉國軍，溫世斌

（酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000）

目的 觀察不同線栓頭端處理方法及不同插線深度對線栓法制作成年Wistar大鼠大腦中動脈阻斷再灌注模型（MCAO/R）造模效果及大鼠存活率的影響。方法 依據(jù)改良Longa線栓法制作MCAO/R模型，插入不同深度尼龍線制作模型。于24小時、48小時后測定神經(jīng)功能缺損評分并觀察各組大鼠存活率。比較線栓頭端蘸蠟處理法和熏香燒灼處理頭端法制作MCAO/R模型48小時存活率及神經(jīng)功能缺損評分。結(jié)果 第二組、第三組、第四組大鼠24小時和48小時的存活率和神經(jīng)功能缺損評分與第一組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中大鼠存活率第一組最高，第四組最低；神經(jīng)功能缺損評分第一組最低，第四組最高。兩種線栓頭端處理方法在相同插線深度（1.8 cm、2.0 cm、2.2 cm）的存活率和神經(jīng)功能缺損評分方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 蘸蠟法與熏香燒灼法處理線栓頭端對造模成功率無明顯影響。線栓插入越深，神經(jīng)功能缺損評分越高，存活率越低。線栓插入深度2.0 cm更適用于建立大鼠MCAO/R模型。

線栓法；大鼠；局灶性腦缺血再灌注模型

線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型（MCAO/R）被普遍認(rèn)為是腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動物模型，特別適合于局部腦損傷后神經(jīng)功能改變及治療藥物評價等實(shí)驗(yàn)研究［1-2］。不同線栓頭端處理方法及不同插線深度對線栓法制作MCAO/R模型影響的相關(guān)研究較少，因此，本研究觀察不同線栓頭端處理方法及插線深度對線栓法制作MCAO/R模型造模效果及大鼠存活率的影響，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料

SPF級成年Wistar大鼠56只，體質(zhì)量（300±20）g，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。直徑0.26 mm尼龍線。

1.2 MCAO/R模型制作

1.2.1 分組 大鼠適應(yīng)環(huán)境7天后隨機(jī)分成7組，每組8只。第一、二、三組均設(shè)模型組及對照組，這6個組線栓插入深度分別為1.8 cm，1.8 cm；2.0 cm，2.0 cm；2.2 cm，2.2 cm。第四組線栓插入深度至最大，直至遇到較大阻力且大鼠出現(xiàn)深呼吸為止（約2.4～2.5 cm）。

1.2.2 模型制作 第一、二、三組中的模型組采用熏香燒灼頭端，第一、二、三組中的對照組采用蘸蠟法處理線栓頭端。（1）線栓及線栓頭端的處理。將直徑0.26 mm的尼龍線剪成5 cm長的小段，60℃～70℃加熱2小時制作成外切角約為30°左右的弧形，頭端用熏香快速燒灼，使一端熔化成球形，然后打磨并用75%的酒精浸泡處理備用。另選尼龍線小段，將頭端蘸蠟后倒垂，待頭端凝固成球形，保持頭端直徑均為0.30 mm且包被多聚賴氨酸。

（2）插入深度依據(jù)及線栓標(biāo)記。依據(jù)崔龍等“同身寸”法估算大鼠局灶性腦缺血模型線栓深度。用血管鉗夾標(biāo)記等長度對比（血管鉗內(nèi)面作為測量標(biāo)準(zhǔn)）以及使用0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm、3.0 mm粗細(xì)不同的記號筆標(biāo)記預(yù)插線栓深度，并分組比較其印記標(biāo)記及同組誤差。

（3）模型制作過程。采用改良Longa線栓法［3］，以10%水合氯醛麻醉，術(shù)區(qū)常規(guī)剃毛消毒，頸部右側(cè)旁正中切開，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動脈（CCA），并于CCA掛手術(shù)線備用。在頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）掛線。分離暴露ECA主干，在其根部打結(jié)。小動脈夾夾閉CCA近心端，夾閉ICA。在CCA近頭端距分叉部5 mm處斜行剪一小口，導(dǎo)入線栓進(jìn)入ICA。移開夾在ICA的小動脈夾，將線栓插入至設(shè)計(jì)深度，遇阻力停止。結(jié)扎切口處CCA掛線，去除CCA的血管夾。確認(rèn)無出血后縫合皮膚，皮膚外留線頭約0.5 cm，術(shù)后2小時抽出線栓形成再灌注。

1.3 觀察指標(biāo)與測定方法

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 建模成功表現(xiàn)：左前肢持續(xù)屈曲，提尾實(shí)驗(yàn)陽性。側(cè)推抵抗力減弱，轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)陽性。采用Longa評分標(biāo)準(zhǔn)，1～4分為造模成功。0分：無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀，活動正常；1分：輕微神經(jīng)功能缺損，對側(cè)前肢不能完全伸展；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時身體向偏癱側(cè)傾倒；4分：不能自主行走，意識喪失；5分：死亡［4-6］。期間注意觀察大鼠呼吸及心率變化。

1.3.2 存活率 術(shù)后24小時及48小時統(tǒng)計(jì)動物存活數(shù)，計(jì)算存活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠24小時、48小時存活率和神經(jīng)功能缺損評分（見表1）

表1 各組大鼠24小時、48小時存活率和神經(jīng)功能缺損評分（±s，分）

表1 各組大鼠24小時、48小時存活率和神經(jīng)功能缺損評分（±s，分）

注：與第一組比較，＊P＜0.05

組別第一組第二組第三組第四組插線深度（cm）1.8 2.0 2.2 2.5存活率（%）24小時48小時100.0 87.5 62.5 37.5＊＊＊100.0 75.0 50.0 25.0＊ ＊＊神經(jīng)功能缺損評分1.0±0.0 1.9±0.7＊2.8±0.8＊3.6±0.6＊

第二、三、四組大鼠24小時和48小時存活率與第一組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中第一組最高，第四組最低；不同組神經(jīng)功能缺損評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中第一組最低，第四組最高。

2.2 不同線栓頭端處理方法對模型的影響（見表2）

表2 不同線栓頭端處理方法對模型的影響（±s，分）

表2 不同線栓頭端處理方法對模型的影響（±s，分）

組別第一組第二組第三組插線深度1.8 cm 2.0 cm 2.2 cm P模型組對照組模型組對照組模型組對照組48小時存活率（%）100.0 100.0 75.0 75.0 50.0 50.0神經(jīng)功能缺損評分1.0±0.0 1.0±0.2 2.0±0.5 2.2±0.6 2.8±0.8 2.7±0.6＞0.05＞0.05＞0.05

將熏香燒灼頭端的設(shè)為模型組，將蘸蠟法處理頭端的設(shè)為對照組。頭端大小均勻一致且均需經(jīng)過多聚賴氨酸處理。

2.3 不同粗細(xì)記號筆尖與血管鉗夾標(biāo)記印記的區(qū)別（見表3）

表3 不同粗細(xì)記號筆尖標(biāo)記印記與血管鉗夾標(biāo)記印記的區(qū)別（±s，mm）

表3 不同粗細(xì)記號筆尖標(biāo)記印記與血管鉗夾標(biāo)記印記的區(qū)別（±s，mm）

同組誤差（mm）記號筆標(biāo)記血管鉗夾標(biāo)記筆尖粗細(xì)（mm）0.5 1.0 1.5 3.0 -印記寬度0.5±0.10 1.0±0.15 1.5±0.20 3.0±0.30 -＜0.1 0.1±0.0 0.2±0.1 0.3±0.1 0.0

不同粗細(xì)筆尖標(biāo)記印記組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5～1.0 mm印記細(xì)，需要仔細(xì)辨認(rèn)，3.0 mm印記易擴(kuò)大，同組誤差大而使插入深度無法精確。調(diào)查顯示，血管鉗夾標(biāo)記與不同粗細(xì)記號筆尖標(biāo)記誤差比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

線栓法制作MCAO/R模型因易于操作且損傷小、可重復(fù)性高而應(yīng)用廣泛［7］。但是線栓直徑、線栓頭端直徑及頭端有無包被多聚賴氨酸、術(shù)中出血量、線栓留置時間、線栓插入深度及血管解剖等因素均可影響MCAO/R模型制作的成功率和可重復(fù)性［8-9］。

（1）線栓的制備至關(guān)重要，包括匹配體重大鼠線栓直徑的選擇、線栓頭端的科學(xué)處理及其弧度和插入線栓深度的精確標(biāo)記。線栓加熱制作成外切角約為30°左右的弧形，可確保線栓弧度與大鼠頸內(nèi)動脈走行一致，插入線栓時更容易調(diào)整角度和方向使其準(zhǔn)確進(jìn)入ICA。本研究表明，只要操作準(zhǔn)確，線栓頭端蘸蠟法與頭端熏香燒灼法處理對造模效果影響不大。具體插線直徑的選擇應(yīng)根據(jù)大鼠體質(zhì)量進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。研究證明，體質(zhì)量為（280±20）g的大鼠更適合造模。

（2）插線深度對造模結(jié)果的影響：本研究表明，隨著線栓插入深度增加，大鼠神經(jīng)功能缺損評分增高，說明腦梗死體積不斷增大，但是大鼠存活率明顯降低。當(dāng)線栓插入深度最深（2.4～2.5 cm）時，死亡率過大而影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，死亡原因可能是腦梗死面積過大而癥狀過重，或?qū)е轮刖W(wǎng)膜下腔出血，或線栓穿破血管致腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血而加重腦卒中癥狀。當(dāng)線栓插入深度為2.0 cm時，神經(jīng)功能缺損評分適合且術(shù)后存活率較高，術(shù)后48小時大鼠存活率可達(dá)75.0%。因此，建議建立（280±20）g實(shí)驗(yàn)性Wistar大鼠MCAO/R模型的插入線栓深度為2.0 cm。

（3）插線深度的準(zhǔn)確標(biāo)記：目前報道MCAO/R模型制備的線栓多采用記號筆標(biāo)記尼龍線刻度，筆者經(jīng)過多次反復(fù)實(shí)踐認(rèn)為該方法存在缺陷，即記號筆細(xì)則容易模糊標(biāo)記點(diǎn)，而記號筆粗則容易使標(biāo)記印過大甚至超過0.3 cm，以致誤差較大，插入深度無法精確。血管鉗夾標(biāo)記誤差幾乎為0，因此，應(yīng)將線栓統(tǒng)一剪成5 cm小段并用小的血管鉗夾在預(yù)插線深度，通過比較插線長度的方法來判斷插入的深度，既可保證插入深度精確，又可節(jié)省線栓處理時間。

綜上所述，正確處理線栓和選擇插入線栓的合適深度是保證線栓法制備大鼠MCAO/R模型成功的關(guān)鍵。血管鉗夾標(biāo)記插線深度的誤差小，節(jié)省了操作時間，并使插線的插入深度更加精準(zhǔn)。

［1］包新杰，趙浩，趙英杰，等.線栓法插線深度對大鼠腦梗死模型制備的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報，2011，19（3）：233-236.

［2］Wang Z，F(xiàn)ukuda T，Azuma T，et al.Safety of low-frequency ranscranial ultrasound in permanent middle cerebral artery occulusion spontaneously hypertensive rats［J］.Cerebrovasc Dis，2012，33（1）：23-29.

［3］馬賢德，孫宏偉，柴紀(jì)嚴(yán)，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（6）：1200-1201.

［4］張瑩，舒兆瑞，沈梅紅.線栓法制備腦缺血再灌注的影響因素及探討［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14（12）：80-83.

［5］王橋生，符暉，曾紅科.線栓法大鼠局灶腦缺血模型的改進(jìn)與評價［J］.中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2012，40（3）：291-294.

［6］Jokivarsi K T，Liimatainen T，Kauppinen R A，et al.Relaxation along afictitious field（RAFF）and zspectroscopy using alternating phaseirradiation（zAPI）in permanent focal cerebral ischemia inrat［J］.PLOS One，2013，8（7）：69157.

［7］陳東麗，陳旭東，夏翠英.天麻對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（3）：148-150.

［8］張亞敏，徐虹，孫華，等.線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的研究及體會［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2014（1）：27-30.

［9］康濤，張洪.經(jīng)頸總動脈和經(jīng)頸外動脈制作大鼠MCAO模型的比較［J］.中華腦血管病雜志，2013，7（3）：29-32.

G424.31

B

1671-1246（2015）14-0075-02