海產(chǎn)品中霍亂弧菌實時濁度LAMP檢測方法的應(yīng)用

梁華麗

（汕尾出入境檢驗檢疫局，廣東汕尾516600）

·應(yīng)用研究·

海產(chǎn)品中霍亂弧菌實時濁度LAMP檢測方法的應(yīng)用

梁華麗*

（汕尾出入境檢驗檢疫局，廣東汕尾516600）

通?；【惖募?xì)菌不但能夠在動物中傳播，而且還能夠傳染給人類。病原性的弧菌則是在海水養(yǎng)殖類動物體內(nèi)很常見的細(xì)菌性病原體，它的流行速度非?？?，傷害也非常大，嚴(yán)重影響了包括海水魚、貝殼類生物養(yǎng)殖業(yè)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)?；魜y弧菌擁有高度的致病性，海產(chǎn)品如果被霍亂弧菌感染，細(xì)菌就可能會在其體內(nèi)長時間留存，還會隨著生物的活動污染水資源，最后還會通過寄生體傳染給人類，形成非常嚴(yán)重的疾病泛濫，歷史上曾經(jīng)有過多次關(guān)于霍亂災(zāi)難的記載。由此，在對海水產(chǎn)品進(jìn)行養(yǎng)殖的過程中，絕對不能放松對霍亂弧菌進(jìn)行檢測和控制的力度，必須建立起具有高度時效性以及高度敏感性的檢測判斷方法，借此大大減少檢測時間，進(jìn)而盡可能降低其對養(yǎng)殖業(yè)的傷害以及對人們身體健康乃至于生命的威脅。

1 霍亂弧菌以及當(dāng)前檢測情況概述

霍亂弧菌是造成霍亂在人類群體中大面積傳播的罪魁禍?zhǔn)?，在歷史記載當(dāng)中，霍亂是大量非常古老并且流行起來范圍很廣、傷害性很高的烈性傳染病之一，曾經(jīng)是一種“不治之癥”，引起過多次大面積騷亂，其主要病癥表現(xiàn)為嘔吐以及腹瀉，最終脫水致死，死亡率極高，國際檢疫部門將其認(rèn)為是一種嚴(yán)重的傳染疾病?；魜y弧菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，在菌體表面存在單鞭毛以及菌毛，有一部分存在莢膜，大量的細(xì)菌群當(dāng)中，01細(xì)菌群以及0139細(xì)菌群有高度致病性，一旦擴(kuò)散就很可能會造成嚴(yán)重的霍亂。

通常人類感染霍亂弧菌的途徑是被感染的水下生物傳染造成的飲水傳染?；蛘呤峭ㄟ^食物直接入口感染。在條件滿足的情況下，霍亂弧菌會迅速進(jìn)入生物體的小腸部分，并且能夠依靠其鞭毛自主運(yùn)動，可以靈活地越過機(jī)體黏膜表面自帶的粘液層，同時還可能會借助菌毛運(yùn)動與腸壁細(xì)胞相粘合，一旦尋找到適合其生存繁衍的“沃土”就會迅速繁殖，產(chǎn)生具有強(qiáng)烈毒性的腸毒素?；魜y弧菌的潛伏期極短，但是發(fā)病極快，患者往往措手不及。在發(fā)病后，患者會出現(xiàn)上吐下瀉的癥狀，這也是這種疾病典型的特點?？梢钥隙ǖ氖牵瑹o論哪種傳播途徑，霍亂弧菌的傳播都和海產(chǎn)品或者淡水產(chǎn)品的感染有關(guān)，因此對海產(chǎn)品以及淡水產(chǎn)品進(jìn)行霍亂弧菌的檢測是非常重要的。

對于傳統(tǒng)的檢測霍亂弧菌的方法，存在操作繁瑣的弊端，且檢測需要的周期非常長，不能同時進(jìn)行大批量的樣品檢測。近幾年發(fā)展起來的檢測方法，如免疫學(xué)方法以及熒光定量法等檢測成本偏高，并不適合在基層檢測部門及單位進(jìn)行推廣和使用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（LAMP）是近幾年發(fā)展起來的一種新的檢測技術(shù)，這種方法可以在恒溫環(huán)境中很好地識別靶DNA中的特定區(qū)域，引物和DNA聚合酶擴(kuò)增的核酸，并且擁有高度的靈敏性以及特殊性，實際操作起來也十分有效且便捷。在當(dāng)前的科技環(huán)境下，這種技術(shù)逐漸開始在食源性致病菌的檢測中得到應(yīng)用，不過對于霍亂弧菌實時濁度LAMP試驗所擁有的技術(shù)效果還沒有系統(tǒng)的研究分析報告。因此，本研究將對霍亂弧菌中的ctrA基因進(jìn)行LAMP引物的設(shè)計，建立起適合霍亂弧菌檢測的LAMP檢測辦法，可以有效且迅速地降低對霍亂弧菌進(jìn)行檢測所要花費的時間和精力，并且為未來控制或預(yù)防霍亂弧菌大面積傳染打下良好的理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、非致病性霍亂弧菌分離菌株、擬態(tài)弧菌分離菌株、創(chuàng)傷弧菌，北京陸橋股份有限公司。

試劑：緩沖蛋白胨水、堿性蛋白胨水，北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；DNA抽取提取試劑盒、熒光定量測試試劑盒、霍亂弧菌致病性組DNA、擴(kuò)增試劑盒、反應(yīng)管，北京藍(lán)譜生物科技有限公司。

設(shè)備：實時濁度儀，日本榮研公司；分光光度計，日本島津公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 提取細(xì)菌基因組DNA

把供試驗的菌株放置在增菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，需要注意的是弧菌選擇堿性蛋白胨水來進(jìn)行培養(yǎng)，其他的菌株則選擇緩沖蛋白胨水來進(jìn)行培養(yǎng)，依照試劑盒提供的說明書來進(jìn)行細(xì)菌基因組的提取，建立起供參考的菌株DNA模板庫，并且將其置于-20℃左右的環(huán)境中，隨時備用。

2.2.2 設(shè)計LAMP引物，計算長度

對比霍亂弧菌的基因序列，對于霍亂弧菌中包含的ctxA基因使用pr軟件進(jìn)行引物設(shè)計，設(shè)計數(shù)量為3組，分別命名A、B、C組，并且由專門的單位完成合成的步驟，其具體長度情況見表1。

表1 霍亂弧菌中的ctxA基因擴(kuò)增后LAMP引物的序列長度

2.2.3 篩選LAMP引物

對ctxA基因進(jìn)行有針對性設(shè)計出的3組引物實時進(jìn)行同步擴(kuò)增，并且使用濁度儀來對其擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測，并且在這之后有限選擇其中擴(kuò)增效率最高并且沒有出現(xiàn)明顯的非特殊性擴(kuò)增的一組。

2.2.4 擴(kuò)增

實時擴(kuò)增反應(yīng)表現(xiàn)在濁度儀上，具體反應(yīng)體系是25 μL，具體情況見表2。

表2 濁度儀中表現(xiàn)的實時擴(kuò)增反應(yīng)

除此之外，引物混合液在PM中的反應(yīng)引物（反應(yīng)條件：溫度65℃，反應(yīng)時間：60 min）所具備的濃度情況見表3。

表3 引物混合液在PM中的反應(yīng)引物所具備的濃度表

2.2.5 判別試驗結(jié)果

察濁儀器，濁度如果超過0.1，則認(rèn)為是陽性。此處需要注意的是，將霍亂弧菌性基因組DNA認(rèn)定為陽性組，同時將雙蒸水作為空白組進(jìn)行對照，其他菌株作陰性對照組，同時開始LAMP擴(kuò)增的操作。

2.2.6 擴(kuò)增具備的靈敏性

通過分光光度計來對霍亂弧菌致病性基因組進(jìn)行DNA含量的測定，原液稀釋，按照模板進(jìn)行擴(kuò)增操作，對其靈敏度進(jìn)行總結(jié)記錄。

2.2.7 對海產(chǎn)品當(dāng)中是否含有霍亂弧菌進(jìn)行檢測

選取若干海產(chǎn)品，約100份，進(jìn)行同樣的前處理后，進(jìn)行預(yù)增菌，并進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取，通過LAMP檢測方法以及采用SN/T 1022—2010進(jìn)出口食品霍亂弧菌檢測進(jìn)行對比操作，證實LAMP檢測法擁有可靠的實用性。

3 結(jié)果與分析

3.1 篩選引物試驗結(jié)果

將3組引物依照霍亂弧菌DNA作為基礎(chǔ)模板同時進(jìn)行LAMP反應(yīng)測試，并分別設(shè)置空白組進(jìn)行對照，試驗擴(kuò)增情況見圖1。由圖1可知，這3組引物都可以發(fā)生一定的反應(yīng)，而空白組并沒有發(fā)生任何DNA擴(kuò)增現(xiàn)象，其中A組引物組的擴(kuò)增最快，同時也是出峰的時間最早一組。因此，選擇A組作為本次研究的最優(yōu)組。

圖1 3組引物以及空白組引物擴(kuò)增情況曲線圖

3.2 擴(kuò)增靈敏性試驗結(jié)果

在基因組DNA含量測試結(jié)果中，霍亂弧菌致病組的DNA含量是8 ng/μL，稀釋之后進(jìn)行了檢測，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 靈敏性擴(kuò)增情況曲線圖

在發(fā)生反應(yīng)的60 min之內(nèi)，6份樣品的濁度基本上都呈現(xiàn)出了陽性，同時，隨著模板不斷降低的濃度，反應(yīng)的速率依然保持基本不變的狀態(tài)，反應(yīng)的峰值出現(xiàn)的具體時間逐漸延遲，但是始終保持有效擴(kuò)增，說明霍亂弧菌可以不斷地擴(kuò)增稀釋。在此次反應(yīng)當(dāng)中，從產(chǎn)物的量來看，可以說明臨近值判定成陽性花費的時間只有4 min，證明這種方法對于基因擴(kuò)增有很高的效率。

3.3 對海產(chǎn)品當(dāng)中是否含有霍亂弧菌進(jìn)行檢測的結(jié)果使用建立起的LAMP方法來對選取的100份海產(chǎn)品進(jìn)行了檢測，其中有1份被檢測出霍亂弧菌呈現(xiàn)陽性（檢出概率為1%），這一結(jié)果和通過采用SN/T1022—2010標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測結(jié)果保持一致，具體情況見表4。

表4 含有ctxA基因的海產(chǎn)品進(jìn)行檢測后的結(jié)果對比

經(jīng)過總結(jié)對比，說明LAMP檢測法是可靠的。

4 討論分析

經(jīng)過本文的研究和分析，說明LAMP檢測法是可靠的。在當(dāng)前的技術(shù)水平環(huán)境下，大部分建立起的LAMP檢測法只能使用在糖凝膠電泳當(dāng)中進(jìn)行結(jié)果判定，存在比較嚴(yán)重的安全隱患。同時，由于缺少對實時反應(yīng)的監(jiān)控能力，因此很難對假陽性以及非特殊反應(yīng)的干擾因素進(jìn)行準(zhǔn)確的排除，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。本文借助實時渾濁儀來具體分析LAMP反應(yīng)的實際結(jié)果，能夠直觀地對反應(yīng)進(jìn)行觀察，并且可以借助設(shè)置分析排除一些曾經(jīng)無法進(jìn)行排除的干擾因素。

對引物進(jìn)行合理的優(yōu)化和適當(dāng)?shù)暮Y選能夠在短時間內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測，本次研究借助LAMP研究技術(shù)對霍亂弧菌ctxA基因序列進(jìn)行了一次完整的設(shè)計，并且得到了3組具有特殊性的引物，在LAMP擴(kuò)增的結(jié)果當(dāng)中明顯地顯示出來，這3組引物都能夠在ctxA基因的檢測當(dāng)中進(jìn)行使用，通過進(jìn)一步的篩選之后，最終選擇了A組作為本次研究的最優(yōu)組。

在本次LAMP高效率的反應(yīng)中，對目的序列進(jìn)行一定擴(kuò)增，并且讓其達(dá)到了一定的臨界值之后，將會進(jìn)入到一個高反應(yīng)速率的階段當(dāng)中，并且反應(yīng)峰值也達(dá)到了一定高度，對模板進(jìn)行稀釋只會對反應(yīng)開始點的具體出現(xiàn)時間產(chǎn)生一定影響，并不會影響到整體反應(yīng)的速度。在本次研究當(dāng)中，稀釋到一定程度，花費了比較長的時間，這和反應(yīng)起始的時候DNA的模板總量有所關(guān)聯(lián)，但是在擴(kuò)增的產(chǎn)物量到達(dá)了臨界值之后，卻只花費了4min就達(dá)到了反應(yīng)最高峰值，并且和其他的反應(yīng)樣本達(dá)到的峰值基本一致，也說明這一方法具有極高的擴(kuò)增速度。

在本次研究當(dāng)中，建立起的霍亂弧菌濁度LAMP檢測法作用于全部的菌株之后，除了致病性霍亂弧菌之外，其他的菌株都呈現(xiàn)了明顯的陰性，說明使用的A組引物擁有針對霍亂弧菌高度的特異性以及敏感性。借助這一檢測方法，對選取的100份海產(chǎn)品進(jìn)行了檢測，并且和采用SN/T 1022—2010中方法所檢測的結(jié)果進(jìn)行了對比，得到了同樣的1%檢出概率，二者保持完全一致。但是根據(jù)研究前調(diào)查，傳統(tǒng)檢測辦法從對海產(chǎn)品的樣本收集開始算起，到最終得到完整準(zhǔn)確的檢測結(jié)果都花費了5 d～10 d，甚至更久，但是檢測法卻僅僅花費了1 d時間，這對于需要高效率的檢測行業(yè)來說具有極大的優(yōu)勢。

5 結(jié)語

研究結(jié)果表明，在對海水產(chǎn)品進(jìn)行養(yǎng)殖的過程中，絕對不能放松對霍亂弧菌進(jìn)行檢測和控制的力度，必須建立起具有高度時效性以及高度敏感性的檢測判斷方法，借此大大降低對該細(xì)菌檢測花費的時間，進(jìn)而盡可能降低其對養(yǎng)殖業(yè)的傷害以及對人們的身體健康乃至于生命安全的威脅。LAMP檢測法不但操作簡便，結(jié)果也十分可靠，因此可以進(jìn)行更廣泛地推廣和使用。

［1］胡興娟，沈飚，江玲麗，等.海產(chǎn)品中霍亂弧菌實時濁度LAMP檢測方法的建立［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（10）：127-130.

［2］張曉君，白雪松，畢可然，等.泥鰍（Misgurnusanguillicaudatus）病原霍亂弧菌（Vibriocholerae）PCR與LAMP檢測方法的比較研究［J］.海洋與湖沼，2013，44（1）：213-218.

［3］薛超波，黃朱梁，孫瑛，等.海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌實時濁度LAMP檢測方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013，35（11）:53-56.

［4］黃朱梁，薛超波，孫瑛，等.食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌實時濁度（LAMP）檢測方法的建立［J］.食品工業(yè)，2015（1）：288-291.

［5］程晉霞，曾靜，張西萌，等.海產(chǎn)品中霍亂弧菌免疫磁分離和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法的建立［J］.中國食品學(xué)報，2015，15（2）：174-179.

［6］封立平，孔德英，孫濤，等.柑橘潰瘍病菌LAMP實時濁度檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.熱帶作物學(xué)報，2015，36（6）:1 153-1 160.

App lication of real-time turbidity LAMP test on vibrio cholera in seafood

LIANGHuali*
（Shanwei entry-exit inspection and quarantine bureau，Guangdong Shanwei 516600，China）

為了建立起一種同時具備快速、特殊、敏感以及有效的對霍亂弧菌進(jìn)行檢測的辦法，并且借此來控制或預(yù)防該細(xì)菌造成大面積感染的可能性，對這種實際存在的霍亂弧菌中存在的ctxA基因所擁有的保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計，通過實時濁度儀來進(jìn)行LAMP檢測，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增研究法，對其所具備的特性以及敏感性進(jìn)行研究分析，并且通過這一方法對極高可能存在海產(chǎn)品中的霍亂弧菌進(jìn)行檢測。

海產(chǎn)品；霍亂弧菌；實時濁度；LAMP檢測

In order tocreate a rapid,specific,sensitive and effective detection ofvibriocholera,and thereby to control or prevent extensive infection caused by the bacteria,the conservative area of ctxA gene that exist in the vibrio cholerae have were primer designed,and LAMP detection was done by real-time turbidity instrument,named ring mediated isothermal amplification method.Its characteristics and sensitivity analysis were studied,and through the method the vibriocholera with high existence in seafood was detected.

seafood；vibrio cholerae；real-time turbidity；LAMP test

TS207.4

A

1673-6044（2015）04-0025-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2015.04.008

*梁華麗，女，1982年出生，2004年畢業(yè)于湛江海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)，助理工程師。

2015-09-11