三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測純培養(yǎng)物和環(huán)境水體中霍亂弧菌方法的建立及應(yīng)用*

麻麗丹，王殿夫，王多春，曹際娟

（1.丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東，118000；2.遼東學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，遼寧 丹東，118000；3.國家疾控中心腹瀉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102206；4.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連，116001）

霍亂是一種急性腸道傳染病，對一些亞洲和非洲國家來說目前仍是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，霍亂弧菌主要通過受污染的水和食物傳播，與不嚴(yán)格的環(huán)境管理密切相關(guān)。因此，加強(qiáng)霍亂弧菌環(huán)境水體監(jiān)測，可提供環(huán)境污染危險(xiǎn)性的評價(jià)及對傳播來源的分析，為制定霍亂防控對策提供科學(xué)依據(jù)，是霍亂防治工作的重要組成部分，同時(shí)，對環(huán)境水體的霍亂弧菌的監(jiān)測可作為霍亂流行的預(yù)警指標(biāo)［1－4］。水體中的霍亂弧菌檢測通常是采用傳統(tǒng)的濃縮堿性蛋白胨增菌法。國家衛(wèi)生部編制的《霍亂防治手冊》及GB15984－1995《霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》首選方法也是此法（以下簡稱常規(guī)法）。但在霍亂的非流行期，霍亂弧菌在外環(huán)境水體中自然生存狀態(tài)下菌量較少，同時(shí)由于外環(huán)境水體中存在大量其它雜菌，會(huì)對霍亂弧菌的分離鑒定產(chǎn)生干擾；另外，霍亂弧菌可以以活的非可培養(yǎng)及生物膜狀態(tài)存在，常規(guī)培養(yǎng)無法檢測到，對監(jiān)測技術(shù)研發(fā)提出了更高的要求。并且研究顯示，非O1群和非O139群霍亂弧菌也能引起霍亂的爆發(fā)，造成在疫情監(jiān)測和調(diào)查中產(chǎn)生誤差，不適應(yīng)烈性傳染病的監(jiān)測需要［5－12］。

針對這些不足，為了提高外環(huán)境水體中霍亂弧菌的檢出率，減少漏檢的可能性，在確保標(biāo)本采集和增菌的技術(shù)質(zhì)量前提下，作者將實(shí)時(shí)熒光PCR（real time fluorecent PCR）運(yùn)用于對霍亂弧菌的快速篩選。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測是近幾年發(fā)展起來的PCR技術(shù)，具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)，可對樣品進(jìn)行精確定量。本研究以霍亂弧菌（O1群和O139群）O抗原編碼基因（rfb）和特異性的溶血素基因（hlyAA）序列為靶序列［13－14］，建立三重實(shí)時(shí)熒光 PCR的實(shí)驗(yàn)方法，為水體標(biāo)本霍亂弧菌的初篩與純培養(yǎng)物鑒定提供了一條可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

霍亂弧菌國際標(biāo)準(zhǔn)菌株N16961（O1群）、MO45（O139群）、O1群 El Tor型霍亂弧菌30株（2002—2008年分離），O139群霍亂弧菌5株（2003—2006年分離），非O1／非O139群霍亂弧菌25株（2007—2008年分離）以及O22和N53、以及擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、麥?zhǔn)匣【⒑踊【?、?chuàng)傷弧菌、弗尼斯弧菌、嗜水氣單胞菌等8種環(huán)境水體中能分離到的弧菌。實(shí)驗(yàn)菌株均經(jīng)過血清或生化鑒定，本室保存。

1.2 引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)O1群和O139群霍亂弧菌O抗原編碼基因rfb序列和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）序列，使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)并合成針對O1群和O139群特異性rfb和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）的PCR引物和探針（見表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR所用引物和探針Table 1 Primers and probes for real－time fluorecent PCR assay

1.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將N16961、O22和MO45標(biāo)準(zhǔn)菌株于選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，測OD600nm值估計(jì)細(xì)菌數(shù)，將菌液倍比稀釋到10－7，取10－4、10－5、10－6、10－7菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，各稀釋度重復(fù)3個(gè)，按照相應(yīng)的方法培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)取平均值確定其真實(shí)的菌密度。同時(shí)每個(gè)稀釋液各取1mL菌液于2mL離心管中并作3管重復(fù)，用于提取DNA測其OD260nm／OD280nm值并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，確定反應(yīng)體系的靈敏度。

1.4 單重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件

實(shí)時(shí)熒光PCR采用20μL反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)中含10μL通用 PCR 反應(yīng)預(yù)混液（TaqMan Gene Expression Master Mix（2×），ABI 產(chǎn) 品）；引 物 對（10μmol／L）各0.4μL、探針（10μmol／L）0.2μL、滅菌蒸餾水7μL、模板2μL。反應(yīng)條件為第一步：預(yù)變性，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)：95℃10min；第二步：PCR反應(yīng) 共40個(gè)循環(huán)，95℃15s；60℃1min。

1.5 三重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件

實(shí)時(shí)熒光PCR采用20μL反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)中含10μL 通用 PCR 反應(yīng)預(yù)混液（TaqMan Gene Expression Master Mix（2×），ABI產(chǎn) 品）、O1 引 物 對（20μmol／L）各 0.25 μL、O1 探 針 （20 μmol／L）0.125μL、O139引物對（20μmol／L）各1μL、O139探針（20μmol／L）0.5μL 、hlyA 引物對（20μmol／L）各0.5μL、hlyA 探針（20μmol／L）0.4μL、滅菌蒸餾水3.15μL、模板2μL。反應(yīng)條件為第一步：預(yù)變性，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)：95℃10min；第二步：PCR反應(yīng) 共40個(gè)循環(huán)，95℃15s；60℃1min。

1.6 河口水標(biāo)本的檢測和霍亂弧菌的分離

2007年3月～2008年6月間，對丹東市區(qū)的鴨綠江河段及其入?？谔?，采集水體標(biāo)本共計(jì)252份。每份采集450mL，回實(shí)驗(yàn)室后加入50mL 10倍濃縮的堿性蛋白胨增菌液，置37℃增菌6h，取其中1mL提取細(xì)菌DNA（ABI公司）做模板，按實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件檢測O1、O139、非O1和非O139群霍亂弧菌，另分別取10μL涂TCBS平板分離霍亂弧菌，對生長的可疑菌落進(jìn)行O1群及O139群霍亂診斷血清玻片凝集試驗(yàn)和霍亂弧菌生化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度分析

采用 N16961（O1 群；1.9×107cfu／mL）、MO45（O139群；2.2×107cfu／mL）、O22（非O1／O139群；1.7×107cfu／mL）進(jìn)行靈敏度和定量實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)時(shí)熒光PCR可檢測出至10－6，對應(yīng)的菌落數(shù)分別為19cfu／mL、22cfu／mL和 17cfu／mL。定量關(guān)系式分別為：y＝－3.122 9 x＋37.814，R2＝0.998 8；y＝－3.206 6 x＋41.526，R2＝0.995；y＝ －3.657 7 x＋40.882，R2＝0.996 6。式中x分別表示O1群霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)、O139群霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)和O22霍亂弧菌起始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)，y表示CT值。靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果和定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1～3。

圖3 O22群霍亂弧菌定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Quantity amplified curve for Vibrio cholerae O22serogroups assay

2.2 特異性分析

用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR分別檢測不同年代分離、不同型別的霍亂弧菌DNA（31株O1群、27株非O1／O139群和5株O139群）以及其它水體中能分離出的8種常見弧菌。分別進(jìn)行單重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測O1群、O139群霍亂弧菌和所有血清型的霍亂弧菌，均表現(xiàn)出了100%的特異性。當(dāng)模板中同時(shí)存在O1群、非O1／O139群和O139群DNA時(shí)，采用三重實(shí)時(shí)熒光PCR法時(shí)3種目的片段均獲得擴(kuò)增（見圖4），并且結(jié)果互不干擾，并且能夠與其它弧菌和細(xì)菌相區(qū)別。說明O1群、O139群特異性rfb基因和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）共同檢測時(shí)特異性高，沒有交叉反應(yīng)和干擾現(xiàn)象。

圖4 霍亂弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線Fig.4 Specific amplified curve for Vibrio cholerae three multiplex Real－Time Fluorescent PCR

2.3 水體標(biāo)本的檢測

本研究在丹東市鴨綠江水體的市區(qū)河段以及入?？谔幉杉怂w進(jìn)行霍亂弧菌的監(jiān)測，對252份水體樣本進(jìn)行霍亂弧菌的增菌后分離，同時(shí)用建立的O1群、非O1／O139群和O139群霍亂弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測增菌液DNA。常規(guī)分離菌株份數(shù)為14份O1群、149份非O1／O139群和2份O139群，而利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，陽性份數(shù)為29份O1群、165份非O1／O139群和6份O139群。其中，所有常規(guī)分離方法陽性的標(biāo)本，其實(shí)時(shí)PCR檢測也均為陽性，同時(shí)血清群檢測結(jié)果也一致。

表2 三重實(shí)時(shí)熒光PCR對水體標(biāo)本中霍亂弧菌的檢測Table 2 Vibrio cholerae detected by three multiplex Real－Time Fluorescent PCR in Water samples

3 討論

熒光定量PCR已被應(yīng)用于檢測水體環(huán)境中的霍亂弧 菌 等 病 原 菌［15－17］，Lyon 等［14］采 用 溶 血 素 基 因（hlyA）做探針，使用TaqMan PCR法檢測O1群、O139群以及非O1群和非O139群霍亂弧菌，獲得較高的靈敏度。本研究建立了基于熒光探針的實(shí)時(shí)熒光PCR法，用于水體增菌標(biāo)本中快速檢測O1群、O139群、非O1和非O139群霍亂弧菌的方法，檢測的目標(biāo)基因是O1群和O139群霍亂弧菌的O抗原特異的rfb基因片段和霍亂弧菌特異性的溶血素基因（hlyA）為靶序列，如果擴(kuò)增出hlyA基因片段而未檢出O1群和O139群霍亂弧菌，則可認(rèn)為檢出非O1和非O139群霍亂弧菌。實(shí)時(shí)熒光PCR法具有高特異性和高靈敏度并且快速可用于水體中霍亂弧菌的篩選。

本研究顯示，對標(biāo)本第一次增菌液使用商品化試劑盒提取DNA標(biāo)本，對于一份樣品，從DNA提取到實(shí)時(shí)熒光PCR檢測時(shí)間在2h以內(nèi)，由于不需要對擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分離，因此縮短了對樣品的檢測周期。另外實(shí)時(shí)熒光PCR比分離培養(yǎng)有明顯的高靈敏性，因此在處理標(biāo)本時(shí)，可以先進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，然后僅對陽性標(biāo)本的增菌液進(jìn)行后續(xù)分離鑒定，這樣能夠明顯增加監(jiān)測工作中處理的標(biāo)本量，從而明顯提高監(jiān)測工作的靈敏性和工作效率。需注意的是水體中常能檢測到霍亂弧菌，但在非流行期，環(huán)境中常能檢到非產(chǎn)毒的霍亂弧菌，這類菌株有報(bào)道能引起輕微的腹瀉。

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