石油污染對(duì)膠州灣沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能影響的模擬研究*

李新偉，趙陽(yáng)國(guó)，2＊＊，王千里，陳 敏

（中國(guó)海洋大學(xué)1.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266100）

近年來(lái)，隨著海上運(yùn)輸以及沿海煉油工業(yè)的發(fā)展，溢油和漏油事故逐年增多，使受污染的海域范圍不斷擴(kuò)展，給自然海洋生態(tài)環(huán)境安全帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。石油泄漏和烴類污染物的排海處置會(huì)直接導(dǎo)致近岸海域環(huán)境質(zhì)量的嚴(yán)重下降，對(duì)水產(chǎn)和旅游業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1－3］。已有研究證實(shí)［4－6］，石油降解中間產(chǎn)物由于其潛在毒性和生物積累效應(yīng)還會(huì)引起沉積物中生物多樣性降低、微生物活性下降等連鎖性的生態(tài)學(xué)問(wèn)題，其生態(tài)危害性已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛注意。石油進(jìn)入海洋后，石油中的一些成分可直接揮發(fā)而進(jìn)入空氣；一小部分海洋表面的石油受紫外線作用可發(fā)生光化學(xué)分解，但速度極慢；而大部分石油要通過(guò)物理化學(xué)作用、微生物的降解作用形成石油乳狀液和石油代謝中間代謝產(chǎn)物，擴(kuò)散進(jìn)入新水體或沉積物，通過(guò)微生物的進(jìn)一步代謝活動(dòng)得到降解［7］。然而，一旦近海水體環(huán)境發(fā)生變化，沉積在底泥中的難降解有機(jī)物會(huì)重新釋放出來(lái)進(jìn)入水體，影響上覆水的水質(zhì)，形成二次污染。此外，底泥又是底棲生物的主要生活場(chǎng)所和食物來(lái)源，污染物質(zhì)可直接或間接對(duì)底棲生物或上覆水生物產(chǎn)生致毒致害作用，并通過(guò)生物富集、食物鏈放大等過(guò)程，進(jìn)一步影響陸地生物和人類健康［8－9］。

海洋沉積物的污染評(píng)價(jià)一直以來(lái)是人們非常關(guān)注但難以解決的問(wèn)題［10］。有研究表明，可以通過(guò)生物組織殘毒和沉積物毒性測(cè)定鑒別沉積物“對(duì)人體健康或環(huán)境的危害”［11］。作為單細(xì)胞原核微生物的細(xì)菌類群，具有對(duì)環(huán)境因素改變快速響應(yīng)的特點(diǎn)，其群落結(jié)構(gòu)、功能的變異是反映沉積物污染的良好指標(biāo)。Tim等［12］研究了重金屬等污染物對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉積物中金屬污染物向水體的轉(zhuǎn)移依賴于沉積物中微生物群落的生物學(xué)活性，而這種微生物群落可作為海洋污染的指標(biāo)。Shane等［13］和Yakimov等［14］研究了石油類污染物對(duì)海底沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響，結(jié)果表明，石油烴類物質(zhì)使沉積物內(nèi)源微生物的石油代謝活性增強(qiáng)，而使微生物群落多樣性降低，這種變化可以作為石油污染狀況的生物指標(biāo)。微生物體內(nèi)參與氧化反應(yīng)的酶可分為氧化酶和脫氫酶2大類，其中脫氫酶在石油降解過(guò)程中尤為重要［15］。微生物降解石油烴的過(guò)程中，石油烴通過(guò)脫氫酶活化氫原子并傳遞給特定的受氫體，實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化［16］。脫氫酶活性（dehydrogenase activity，DHA）可直接反映微生物降解石油的能力。該值越大表明微生物利用石油烴的能力越強(qiáng)，降解石油烴的速度越快［17］。為此，脫氫酶活性可以用來(lái)表征微生物降解石油的功能指標(biāo)。

膠州灣是黃海西北邊緣順承陸海的過(guò)渡海灣，其石油污染日益嚴(yán)峻，作為污染的生態(tài)影響評(píng)價(jià)指征，沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能及對(duì)石油污染的響應(yīng)特征亟需深入研究。基于此，本研究以膠州灣沉積物為對(duì)象，并模擬海底環(huán)境建立動(dòng)態(tài)微宇宙模型，通過(guò)檢測(cè)脫氫酶活性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，來(lái)探討石油烴污染物對(duì)沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的可能影響以及微生物的響應(yīng)，為海洋沉積物石油污染的生態(tài)學(xué)影響評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 沉積物的采集

2008年9月29日，應(yīng)用沉積物原位采集器自膠州灣李村河口附近（120.312 5°E，36.156 4°N）獲取沉積物樣品，沉積物采集后置于50L塑料筒中混合均勻，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于海洋沉積物模擬研究。沉積物基本特征為：總磷522.6mg·kg－1，總氮1 800mg·kg－1，有機(jī)氮0.18%，有機(jī)碳1.03%，有機(jī)質(zhì)5.07%。

1.2 動(dòng)態(tài)微宇宙模型的建立

建立2個(gè)動(dòng)態(tài)微宇宙模型，用于揭示膠州灣沉積物在石油烴污染條件下，沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的變化。模型材質(zhì)為有機(jī)玻璃，圓筒狀，直徑80mm，高240mm，總?cè)莘e1.2L，有效容積1.0L。模型中，加入0.3L穩(wěn)定的膠州灣沉積物樣品，上層覆蓋取自膠州灣的陳海水。

模型采用底部進(jìn)水、頂部出水的方式。1個(gè)模型為空白對(duì)照，進(jìn)水只進(jìn)陳海水；另1個(gè)模型進(jìn)水為加入終濃度1 000mg·L－1乳化石油的陳海水。其中陳海水為取自膠州灣中央受陸地影響較小區(qū)域的海水，將其放置暗處貯存數(shù)周，待其所含雜質(zhì)沉淀后，過(guò)濾而得到的海水。為模擬外源污染物對(duì)膠州灣沉積物的沖蝕作用以及潮汐作用，模型運(yùn)行過(guò)程中頂部設(shè)有一攪拌器。模型的控制以24h為一周期，其過(guò)程為：首先攪拌器攪拌1h，然后靜置1h，之后蠕動(dòng)泵開始進(jìn)水，進(jìn)水流速為0.5mL·min－1，進(jìn)水8h后，蠕動(dòng)泵停止運(yùn)行。此時(shí)開啟攪拌器，攪拌1h，再靜置沉降1h后進(jìn)水，12h后停止進(jìn)水。

本研究的石油污染物是原油和少量吐溫－80的混合物。原油直接取自盤錦遼河油田，在加入進(jìn)水前將石油與吐溫－80按10∶3（w／w）比例乳化，然后加入到進(jìn)水中，配成石油濃度為1 000mg·L－1的進(jìn)水。吐溫－80可有效分散原油液滴以強(qiáng)化與微生物接觸，低濃度時(shí)（500mg·L－1）可協(xié)同促進(jìn)微生物對(duì)多環(huán)芳烴的降解［18］。

每隔5d取模型的出水和底泥，一部分泥樣和水樣裝于封口袋中，立即用于脫氫酶活性測(cè)定和細(xì)菌總數(shù)分析；另取3～5mL沉積物樣品，－20℃保存，用于微生物分子生物學(xué)分析。

1.3 沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)與功能分析

1.3.1 脫氫酶活性（DHA） 微生物降解石油烴的過(guò)程中，石油烴通過(guò)脫氫酶活化氫原子并傳遞給特定的受氫體，實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化，DHA可直接反映微生物降解石油的能力［15］。本研究采用氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法測(cè)定石油降解過(guò)程中沉積物微生物脫氫酶活性［19］。定義每1mL菌液、1h氧化1μg三苯基甲臜（TPF）所需的酶量為1個(gè)酶活單位，單位是μg·g－1。

1.3.2 細(xì)菌定量分析 將稀釋的沉積物樣品按9∶1（v／v）加入甲醛對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固定，用 DAPI（4’，6－diamidino－2－phenylindole，4’，6－聯(lián)脒－2－苯基吲哚）染色，熒光顯微技術(shù)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。DAPI是1種靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光染料，對(duì)染色體及DNA有很好的染色效果。它可與DNA的A－T堿基結(jié)合形成DAPI－DNA復(fù)合物，該復(fù)合物在紫外激發(fā)光（365nm）下會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。甲醛固定的樣品經(jīng)DAPI染色時(shí)，甲醛可誘發(fā)蛋白質(zhì)中的芳香乙酰基團(tuán)轉(zhuǎn)化為熒光色團(tuán)，從而使細(xì)胞質(zhì)熒光較強(qiáng)，由此可見(jiàn)整個(gè)細(xì)胞的輪廓［20］。根據(jù)文獻(xiàn)［21］的計(jì)算公式，計(jì)算原樣品中細(xì)菌總數(shù)。

1.3.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 采用高效土壤DNA提取試劑盒（Mobio，美國(guó)）提取沉積物總DNA。以總DNA為模板，應(yīng)用細(xì)菌通用引物 BA101／BA534［22］對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析；以BA101／BA534擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以細(xì)菌通用引物BA341／BA534［23］對(duì)石油影響下的細(xì)菌群落進(jìn)行嵌套PCR，以進(jìn)一步解析該條件下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)。用于DGGE分析的PCR產(chǎn)物，其引物BA534的5’端均帶有GC夾，所用引物均購(gòu)自上海Invitrogen，PCR擴(kuò)增在Mycycle擴(kuò)增儀（Bio－Rad Laboratories，美國(guó)）上進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)［22］的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增及對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。

應(yīng)用 Gel－Pro 4.5對(duì) DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化，提取各條帶的灰度值。根據(jù)數(shù)字化結(jié)果對(duì)DGGE圖譜中各泳道微生物進(jìn)行Shannon－Weiner多樣性指數(shù)（H′）分析，H′通過(guò)公式H′＝－∑Pi logPi計(jì)算，其中Pi是泳道中條帶的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度；采用SPSS軟件（SPSS Inc.，Chicago IL）以 Ward’s方法對(duì)各泳道群落進(jìn)行聚類分析。

DGGE圖中條帶按文獻(xiàn)［22］方法回收并克隆測(cè)序。序列通過(guò) RDP（http：／／rdp.cme.msu.edu／）中的SeqMatch程序以及Blast在線工具進(jìn)行相似性檢索。

1.4 DNA序列在基因庫(kù)中的登錄號(hào)

本研究獲得DGGE條帶序列均已經(jīng)遞交至Gen－Bank中，登錄號(hào)為：JQ316483－JQ316495。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉積物中細(xì)菌數(shù)量的變化

應(yīng)用熒光計(jì)數(shù)法對(duì)不同時(shí)期的沉積物細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行定量分析（見(jiàn)圖1）。模型運(yùn)行初期，由于上覆水中加入高濃度的石油，大量的細(xì)菌由于環(huán)境的迅速改變以及石油的高毒性而死亡或受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)菌總數(shù)迅速降低。此后，細(xì)菌總數(shù)一直在3.0×109cell·g－1范圍內(nèi)波動(dòng)，變化不大，表明沉積物中細(xì)菌群落經(jīng)過(guò)10d左右的馴化，已經(jīng)基本趨于穩(wěn)定。

模型運(yùn)行至第70天左右，其微生物總數(shù)有降低的趨勢(shì)，可能由于時(shí)間的推移，石油降解中間產(chǎn)物不斷積累，對(duì)微生物產(chǎn)生了強(qiáng)烈的毒害作用，使得其微生物總數(shù)降低。Vania等［24］研究了甲苯和苯在生物降解前后對(duì)網(wǎng)紋水蚤（Ceriodaphnia dubia）的毒害作用，發(fā)現(xiàn)降解前濃度為20mg·L－1的甲苯和苯對(duì)網(wǎng)紋水蚤的致死率分別為99%和48%，降解掉98%后對(duì)其致死率分別為33%和24%，可見(jiàn)生物降解并不能完全去除甲苯和苯的毒性。還有研究表明，在降解過(guò)程中生成的中間產(chǎn)物的毒性反而比石油污染物的毒性更大［25］。宋玉芳等［26］對(duì)沈陽(yáng)東部石油污水灌渠的上、中、下游進(jìn)行了污染物（Cd、礦物油）含量分析和生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明對(duì)微生物的毒性不僅來(lái)源于石油污染物本身，還來(lái)源于石油污染物降解過(guò)程中的中間產(chǎn)物。

圖1 細(xì)菌總數(shù)隨時(shí)間變化過(guò)程Fig.1 The dynamics of total bacteria in the sediment samples

2.2 沉積物脫氫酶活性對(duì)石油污染的響應(yīng)

微生物數(shù)量在一定程度上并不能準(zhǔn)確反映微生物活性狀況，利用微生物活性指標(biāo)評(píng)價(jià)生物活性是十分必要的。微生物體內(nèi)含有各種各樣的酶，能夠催化石油烴進(jìn)行氧化反應(yīng)，參加生物氧化的重要酶為氧化酶和脫氫酶二大類，其中脫氫酶類尤為重要［15］。微生物脫氫酶是微生物降解有機(jī)污染物、獲得能量的必需酶。生物體的脫氫酶活性（DHA）在很大程度上反映了生物體的活性狀態(tài)［27］。脫氫酶使石油烴的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化。石油中包含有數(shù)千種不同有機(jī)分子，其主要元素是碳和氫，也含有少量的氮、氧、硫元素。在微生物作用下，其中的直鏈烷烴首先被氧化成醇，源于烷烴的醇在醇脫氫酶的作用下，被氧化為相應(yīng)的醛，醛則通過(guò)醛脫氫酶的作用氧化成脂肪酸［24］。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沉積物脫氫酶活性（DHA）變化見(jiàn)圖2。

圖2 脫氫酶活性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The dynamics of DHA in the simulative sediment samples

圖2 表明，隨著石油的加入，沉積物中的脫氫酶活性明顯升高，在實(shí)驗(yàn)初期，模型中的脫氫酶活性增長(zhǎng)緩慢，模型運(yùn)行到第40天左右，脫氫酶活性呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，沉積物逐漸受到石油烴刺激，烴類污染物能使具備降解能力的微生物逐漸富集［19］，石油降解菌可以利用沉積物中易降解的石油烴組分作為碳源生長(zhǎng)，刺激石油降解菌大量繁殖，引起沉積物中的脫氫酶活性升高。比較圖1和2可以看出，在脫氫酶活性增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，細(xì)菌總量稍有增多，但并不明顯，這表明石油烴利用活性的升高與細(xì)菌總量的提高并不同步，主要是由于沉積物中石油降解菌數(shù)（均值為7.0×104個(gè)·g－1·dw）只占細(xì)菌總數(shù)（均值1.08×109個(gè)·g－1dw）中少部分，在這種情況下，即使石油烴降解菌的數(shù)量和活性有較大的提升，也無(wú)法在總菌數(shù)量上表現(xiàn)出來(lái)［28］。但到第75天左右脫氫酶活性開始有所降低，可能由于石油中間代謝產(chǎn)物的長(zhǎng)時(shí)間積累，毒性逐漸加強(qiáng)。研究表明，在降解過(guò)程中生成的中間產(chǎn)物的毒性反而比石油污染物的毒性更大［25］，這就導(dǎo)致石油降解菌逐漸受到抑制甚至死亡。

2.3 石油污染條件下沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)

分別取模型運(yùn)行的第0、10、25、55、85天沉積物樣品進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并未隨著時(shí)間而發(fā)生明顯變化，而石油處理樣品在第10、25天有較大變化（圖未提供）。為了更好地顯示這些差異，又應(yīng)用嵌套PCR，將石油處理樣品的種群差異進(jìn)行放大，并進(jìn)行DGGE分析。石油處理樣品的DGGE圖譜及對(duì)圖譜進(jìn)行聚類分析結(jié)果如圖3，對(duì)DGGE圖中部分條帶進(jìn)行克隆測(cè)序分析，結(jié)果如表1。

由圖3－B聚類分析，可以看出第0天和第10天群落結(jié)構(gòu)相似性較高，第55天和85天菌落結(jié)構(gòu)相似性較高，隨著石油的不斷馴化，沉積物中的群落結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化，前10天與后期群落結(jié)構(gòu)的分離距離可達(dá)50%，表明石油烴對(duì)沉積物樣品細(xì)菌群落的選擇作用主要發(fā)生在模型運(yùn)行初期，而隨著模型的運(yùn)行，這種選擇作用逐漸減小。

圖3 不同時(shí)期泥樣的DGGE譜圖（A）及其聚類分析（B）Fig.3 DGGE profile of samples at different times（A）and cluster analysis for DGGE profiles（B）

從圖3－A 中可以看出，條帶 A1、A2、A8、A11、A12、A13逐漸消失，表明這些條帶由于不適應(yīng)石油環(huán)境而逐漸被淘汰；而相反，條帶 A3、A4、A5、A7、A10隨著模型的運(yùn)行，其濃度逐漸加強(qiáng)，并成為優(yōu)勢(shì)類群，表現(xiàn)出對(duì)石油環(huán)境的適應(yīng)，同時(shí)其功能也可能得到發(fā)揮。根據(jù)測(cè)序結(jié)果的分析，這5個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，序列分別同γ－變形菌綱（3條）、δ－變形菌綱（1條）和厚壁菌門（1條）中的微生物最為相似，多為分離自海洋中的非典型石油烴降解菌。可見(jiàn)，不同微生物對(duì)石油污染環(huán)境的適應(yīng)能力是有差別的，沉積物被石油烴污染以后，烴類污染物能使具有降解能力的微生物產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，正是通過(guò)這種自然選擇以及基因突變作用，能夠適應(yīng)新的微生物生態(tài)環(huán)境的微生物種屬，在降解烴類物質(zhì)的過(guò)程中被逐漸富集成為優(yōu)勢(shì)菌群［20］。

通過(guò)對(duì)各泳道群落的多樣性分析，發(fā)現(xiàn)群落的多樣性是逐漸下降的，由最初的2.967降至2.154。這表明，由于石油污染進(jìn)入，將引起原有沉積物微生物群落多樣性的降低而特異類群的富集，這將導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)組成過(guò)于單一，趨于不穩(wěn)定。

根據(jù)對(duì)DGGE條帶序列的分析，發(fā)現(xiàn)沉積物中以變形菌門（Proteobacteria）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群，占全部測(cè)得序列的60%左右。其中37%為γ－變形菌綱，23%為δ－變形菌綱。模型中加入石油后，這些有機(jī)化能異養(yǎng)菌，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌。其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠彎菌門（Chloroflexi）等相關(guān)序列。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）屬于革蘭氏陰性菌，是兼性厭氧生物，絕大多數(shù)種屬在有機(jī)物的發(fā)酵降解過(guò)程中具有重要作用。放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）都屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，其中很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽胞，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境。

表1 通過(guò)BLAST和SeqMatch進(jìn)行的相似性檢索結(jié)果Table 1 Sequence similarities to closest relatives and phylogenetic affiliations of DNA recovered from DGGE gel

續(xù)表

測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究中膠州灣沉積物降解石油的微生物類群，與陳碧娥等［29］湄洲灣海域降解石油烴的天然菌群結(jié)構(gòu)較為相似。另外，Margesin等［6］降解柴油的微生物研究以及周宗澄等［30］報(bào)道的廈門港石油降解菌的研究，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)菌群主要為革蘭氏陰性菌，也與本研究結(jié)果較為一致。

3 結(jié)語(yǔ)

采用脫氫酶活性分析和DGGE技術(shù)，探討了沉積物上覆水中添加石油后沉積物中微生物功能和群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)特征，表明高濃度的石油污染對(duì)細(xì)菌總量無(wú)顯著影響，但脫氫酶活性卻會(huì)明顯提高；石油烴污染可引起沉積物中特異微生物類群的過(guò)度富集，并導(dǎo)致微生物多樣性明顯下降。

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