不同來源乳酸菌對(duì)2種致病菌的抑菌活性比較及抑菌性質(zhì)研究*

任大勇 榮鳳君 宮圣潔 張振業(yè) 朱劍威 劉宏妍 于寒松

1（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）2（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

不同來源乳酸菌對(duì)2種致病菌的抑菌活性比較及抑菌性質(zhì)研究*

任大勇1**榮鳳君1宮圣潔1張振業(yè)1朱劍威1劉宏妍2于寒松1

1（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）2（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

乳酸菌是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類革蘭氏陽性菌，不產(chǎn)生芽孢，過氧化氫酶陰性細(xì)菌的總稱。乳酸菌是益生菌的重要組成部分，擔(dān)負(fù)著機(jī)體多種重要的生理功能，并在腸道內(nèi)發(fā)揮益生功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和抵抗力，促進(jìn)腸道的生長(zhǎng)和發(fā)育，是廣泛應(yīng)用的益生菌之一。乳酸菌以其獨(dú)特的生物學(xué)功能呈現(xiàn)出極大的開發(fā)、利用價(jià)值，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品及醫(yī)療保健等與人類密切相關(guān)的領(lǐng)域中有很高的應(yīng)用價(jià)值。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌能引起食物中毒和食品污染，是食源性疾病的常見細(xì)菌，這一問題得到了廣泛關(guān)注。

抗生素給人類帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益同時(shí)，在人的身體里也有耐藥性、抗藥性、殘留等副作用，影響了機(jī)體的微生態(tài)平衡。目前許多研究表明，乳酸菌能產(chǎn)生類似抗生素的物質(zhì)，能有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)，增加胃腸道內(nèi)有益微生物數(shù)量，有可能成為潛在的抗生素替代品。本試驗(yàn)研究其對(duì)食品中常見致病菌的抑制作用，最終篩選出抑菌效果較好的乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌菌株來源

本試驗(yàn)乳酸菌菌株來源如表1所示。

表1 乳酸菌菌株來源

以上菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 致病菌菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院毒理學(xué)試驗(yàn)室分離并保存。

1.3 試驗(yàn)試劑

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐溫-80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉5.0g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000 mL（加12.0 g瓊脂為固體培養(yǎng)基）。

BL培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸出物5.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂9.0 g、蒸餾水1 000 mL。

氫氧化鈉，北京化工廠；過氧化氫酶，上海索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，中國慧世生化試劑有限公司；青霉素；乳酸鏈球菌素（NiSin）。

1.4 試驗(yàn)儀器

臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；電子天平，上海佑科儀器表有限公司；Delta320 pH計(jì)，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KYC-100B空氣恒溫?fù)u床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；凈化工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；鑷子；牛津杯；10 mL離心管；1.5 mLEp管；培養(yǎng)皿。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 上清液

取2 mL活化好的乳酸菌培養(yǎng)液，在4℃條件下，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。取3 mL乳酸菌菌液以12 000 r/min離心10min后，取乳酸菌的上清液，在37℃水浴加熱2h后，用1 mol/L NaOH把菌株上清液的pH值調(diào)為6.5，然后用于抑菌試驗(yàn)。

1.5.2 乳酸菌菌體的獲取

取4 mL活化好的乳酸菌菌液，以8 000 r/min離心2 min后，將上清液棄去，用蒸餾水洗滌1次，8 000 r/min離心2 min后，將上清液棄去，向剩余菌體中加入300 μL的蒸餾水吹勻，使?jié)舛冗_(dá)到1×109cfu/mL，用于抑菌試驗(yàn)。

1.5.3 超聲破碎菌體的獲取

取3 mL活化好的乳酸菌菌液，使?jié)舛冗_(dá)到1×109cfu/mL，8 000 r/min離心2 min，將上清液棄去，剩余菌體用蒸餾水連續(xù)洗滌2次，8 000 r/min離心2 min，將上清液棄去，向剩余菌體中加入3 mL的蒸餾水吹勻，進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎后離心取上清液，用于抑菌試驗(yàn)。

1.5.4 陽性對(duì)照藥品

青霉素和乳酸鏈球菌素（NiSin）做陽性對(duì)照組。用質(zhì)量濃度0.9%生理鹽水將病原菌稀釋至10-6cfu/mL濃度，取100 μL病原菌稀釋液接種于LB固體培養(yǎng)基上，并涂布均勻。用鑷子夾取高壓滅菌后的牛津杯放到LB培養(yǎng)基上，每個(gè)平板貼5～6個(gè)牛津杯，分別吸取100 μL乳酸菌上清液加于牛津杯中，在超凈工作臺(tái)中靜放5 min～10 min。靜放后將平板放于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，觀察是否有抑菌圈，及其直徑大小，從而比較各菌株菌體和產(chǎn)物的抑菌效果。

2 結(jié)果分析

9株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌和沙氏門菌的抑菌效果如表2所示。

表2 9株乳酸菌對(duì)2種致病菌的抑菌效果 cm

2.19 株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌的影響

由表2可知9株乳酸菌經(jīng)過處理后對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌圈直徑。乳酸菌上清液抑菌性最好的是H9，直徑是2.56 cm；抑菌效果弱的是T20，抑菌圈只有1.37 cm。當(dāng)把上清液pH調(diào)到6.5時(shí)，只有L12處理后的菌液對(duì)金黃色葡萄球菌還有抑菌效果，抑菌直徑為1.26 cm，見下頁圖1。經(jīng)過超聲波破碎后，還有抑菌性的菌株是H8、H9、L2抑菌效果幾乎差不多，其中最好的是L2菌株，抑菌圈直徑是1.27 cm；直徑最小的是T18，抑菌直徑為0.94 cm。把菌株經(jīng)過2次PBS緩沖液洗滌之后，只有T18菌體對(duì)致病菌沒有抑菌效果，其余5株都有抑菌效果，抑菌效果最好的是H8，直徑為1.63 cm，見下頁圖2。

2.29 株乳酸菌對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的影響

根據(jù)表2可知9株乳酸菌經(jīng)過處理后對(duì)鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的抑菌圈直徑。T18、L16、L17乳酸菌菌株的上清液抑菌效果比較接近，直徑大約都在2.46 cm～2.54 cm左右；當(dāng)把上清液pH調(diào)到6.5時(shí)，T18、L17、L34還有抑菌效果，抑菌性效果最強(qiáng)的是L17，抑菌直徑為1.47 cm，見下頁圖3；經(jīng)超聲波破碎后，抑菌效果較好的菌株是L17，直徑是1.27 cm之間，見圖3；把9株乳酸菌進(jìn)行PBS緩沖液洗滌2次之后，活菌體還具有抑菌效果，抑菌活性較好的是L16，抑菌圈的直徑是2.04 cm，見下頁圖4。

3 討論

在抗生素濫用的今天，尋找天然抗生素，已經(jīng)成為人們研究的方向。天然抗生素在機(jī)體內(nèi)不會(huì)殘留、產(chǎn)生耐藥和抗藥性，同時(shí)還可以抑制胃腸道內(nèi)有害微生物的生長(zhǎng)，保護(hù)機(jī)體的微生態(tài)平衡。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同家庭自制發(fā)酵食品中分離出的乳酸菌，其代謝產(chǎn)物、活菌體、超聲波裂解物對(duì)致病菌都有抑菌效果，不同菌株在不同條件下對(duì)致病菌的抑菌作用也不相同。

圖1 菌株L12對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈

圖2 菌株H8對(duì)金黃色葡萄菌抑菌圈

圖3 菌株L17對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌圈

圖4 菌株L16對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌圈

目前，國內(nèi)外有很多研究人員對(duì)乳酸菌的抑菌活性進(jìn)行了研究。周偉等報(bào)道了植物乳桿菌素L-1對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌作用機(jī)制的研究。魏新元等報(bào)道了3株食用乳酸菌對(duì)抗生素的藥敏性的研究。Sgouras D等報(bào)道了體外和體內(nèi)抑制幽門螺旋桿菌的干酪乳桿菌菌株的活化的研究。侯亞文等報(bào)道了產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌篩選方法的研究進(jìn)展的研究。陳靜等報(bào)道了泡菜中乳酸菌的分離及其發(fā)酵液抑菌活性研究。乳酸菌的抑菌效果體現(xiàn)在多方面，不同來源的乳酸菌產(chǎn)生抑菌效果的原因也不相同。乳酸菌代謝后的產(chǎn)物，如乙酸、過氧化氫、抗生素類或細(xì)菌素類物質(zhì)都具有抑菌作用。

本試驗(yàn)把9株乳酸菌上清液的pH值均調(diào)到6.5，菌液還具有抑菌效果，說明乳酸菌的代謝物中不只含有乳酸，還含有細(xì)菌素類物質(zhì)進(jìn)行抑菌；把乳酸菌菌體進(jìn)行2次洗滌后，活菌體仍然具有抑菌效果，推測(cè)乳酸菌菌體表面有抑菌物質(zhì)的存在；經(jīng)超聲波裂解后還具有抑菌效果，推測(cè)菌體內(nèi)部含有抑菌物質(zhì)或菌體表面的抑菌物質(zhì)經(jīng)過超聲破碎、離心之后在上清液中產(chǎn)生抑菌效果。后續(xù)將會(huì)對(duì)細(xì)菌素類物質(zhì)和活菌體進(jìn)行深入研究，以期為今后乳酸菌的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

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Antibacterialproperties of lactic acid bacteria from different sources against two pathogens*

RENDayong1**RONGFengjun1GONGShengjie1ZHANGZhenye1ZHU Jianwei1LIUHongyan2YUHansong1

1（College of food science and engineering，Jilin agricultural university，Jilin Changchun 130118，China）

2（College ofChinese herbal medicine，Jilin agricultural university，Jilin Changchun 130118，China）

天然抗生素已經(jīng)成為現(xiàn)代生物科學(xué)和食品科學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)，篩選出含有抑菌物質(zhì)的天然抗生素菌株，已經(jīng)成為食品、生物研究的新趨勢(shì)。選用9株不同來源的乳酸菌對(duì)2種致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，采用牛津杯法對(duì)乳酸菌的上清液、上清液（pH=6.5）、超聲波裂解液、活菌體的抑菌性能進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)致病菌為金黃色葡萄球菌時(shí)：上清液抑菌最好的菌株是H9，直徑為2.56 cm；上清液（pH=6.5）抑菌最好的是L12，直徑為1.26 cm；活菌體抑菌最好的菌株H8，直徑為1.63 cm；超聲波裂解液抑菌最好的是L2，直徑是1.27 cm。當(dāng)致病菌為沙門氏菌時(shí)：上清液抑菌最好的菌株是L16，直徑為2.54 cm；上清液（pH=6.5）抑菌最好的是L17，直徑為1.47 cm；活菌體抑菌最好的菌株L17，直徑為1.27 cm；超聲波裂解液抑菌最好的是L16，直徑是2.04 cm。

乳酸菌；抑菌；牛津杯法；病原菌

Natural antibiotics have become a hot topic in modern biological science and food science,screening of the natural antibiotic strains containing antimicrobial substances is a new trend in food and biological research.9 strains of lactic acid bacteria from different sources for 2 kinds ofpathogenic bacteria in vitrobacteriostasis experiment was carried out.Oxford cup method was used to vitro antibacterial test in the supernatant of lactic acid bacteria,the supernatant（pH=6.5），the ultrasonic cracking and the live bacteria.The results show that pathogenic bacteria is Staphylococcus aureus,the best antibacterial strain of the supernatant,supernatant（pH=6.5），Live bacteria and Ultrasonic cracking liquid respectively is H9,L12,H8,L2.Above the best diameter respectively is 2.56 cm,1.26 cm,1.63 cm,1.27 cm. Pathogenic bacteria is Salmonella,the best antibacterial strain of the supernatant,supernatant（pH=6.5），Live bacteria and Ultrasonic cracking liquid respectively is L16,L17,L17,L16.Above the best diameter respectively is 2.54 cm,1.47 cm,1.27 cm,1.42 cm.

lactobacillus；antibacterial experiment；oxford cup method；pathogenic bacteria

TS261.1+7

A

1673-6044（2015）04-0041-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2015.04.012

吉林省教育廳項(xiàng)目［吉教科合字（2015）第196號(hào)］。

**任大勇，男，1979年出生，2013年畢業(yè)于吉林大學(xué)食品安全專業(yè)，博士，副教授。

2015-10-10