醛類-DNA加合物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

劉魯娟,陳歡,侯宏衛(wèi),胡清源

國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

綜述

醛類-DNA加合物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

劉魯娟,陳歡,侯宏衛(wèi),胡清源

國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

甲醛、乙醛、丙烯醛和巴豆醛廣泛存在于環(huán)境污染物中，卷煙煙氣中也有微量存在，它們不需要經(jīng)過機(jī)體代謝就能夠直接進(jìn)攻親核基團(tuán)，可與DNA分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合形成DNA加合物。DNA加合物是DNA損傷的一種形式，在DNA復(fù)制過程中可使所攜帶的遺傳信息發(fā)生改變，從而有可能造成機(jī)體的損傷。本文綜述了生物體內(nèi)常見的6種醛類-DNA加合物的檢測(cè)技術(shù)以及醛類-DNA加合物作為卷煙煙氣暴露的生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展，展望了同時(shí)檢測(cè)多種DNA加合物的研究方向及醛類-DNA加合物作為DNA損傷標(biāo)志物的研究前景。

卷煙煙氣； 甲醛；乙醛；丙烯醛；巴豆醛；DNA 加合物

甲醛、乙醛、丙烯醛和巴豆醛是一類廣泛存在于環(huán)境基質(zhì)中的污染物。它們主要產(chǎn)生于有機(jī)物的不完全燃燒，如工業(yè)生產(chǎn)、卷煙煙氣、機(jī)動(dòng)車尾氣和烹飪油煙等[1-2]?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)甲醛[3]、乙醛[4-5]具有遺傳毒性；丙烯醛和巴豆醛為α，β-不飽和醛，性質(zhì)較活潑，易與DNA發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，顯示一定的遺傳毒性，但是不同的實(shí)驗(yàn)顯示出不同的致癌性[6-8]。甲醛、乙醛分別被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為1 類、2B 類致癌物，丙烯醛和巴豆醛為3 類致癌物[9]，同時(shí)甲醛、乙醛、丙烯醛是世界衛(wèi)生組織（WHO）煙草控制框架公約（FCTC）煙氣優(yōu)先級(jí)管制污染物[10]，巴豆醛被列入了Hoffmann名單和加拿大衛(wèi)生部煙氣有害成分名單[11]。它們?cè)诰頍煙煔庵械暮窟_(dá)到μg/cig級(jí)別[10]。活潑的醛基不需要經(jīng)過機(jī)體代謝就能夠直接攻擊生物體內(nèi)親核基團(tuán)，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶[2,12]。

組成DNA鏈基本單位的堿基若發(fā)生變化，最終可改變DNA上所攜帶的遺傳信息。DNA損傷種類包括：堿基修飾，堿基位點(diǎn)的喪失，DNA鏈斷裂，被修飾的堿基依據(jù)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可分為3類：烷化類堿基，外環(huán)加成類堿基，氧化類堿基[13]。四種醛類與DNA相關(guān)堿基反應(yīng)首先形成希夫堿（Schiff base）[5]，然后被細(xì)胞內(nèi)的還原體系還原形成醛類-DNA 加合物，屬于堿基修飾類DNA損傷。這些DNA加合物若不能被DNA修復(fù)酶及時(shí)正確的修復(fù)，在DNA復(fù)制過程中使遺傳信息發(fā)生改變，可能會(huì)引起相關(guān)的疾病[14-15]。DNA加合物的形成被認(rèn)為是致腫瘤過程的一個(gè)重要階段，它可以作為接觸生物標(biāo)志物來反映毒物到達(dá)靶位的內(nèi)接觸劑量，又可以作為一種效應(yīng)標(biāo)志物反映DNA 受到有毒化學(xué)物質(zhì)損傷的效應(yīng)劑量[16]，因此，對(duì)體內(nèi)DNA加合物的準(zhǔn)確定性定量有助于評(píng)估污染物的暴露水平。

本文總結(jié)了四種醛類化合物與DNA形成加合物的主要結(jié)構(gòu)、形成過程，簡(jiǎn)要介紹了醛類-DNA加合物的檢測(cè)方法及其在評(píng)價(jià)煙氣暴露中的作用，以期為吸煙風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 四種醛類化合物-DNA加合物的主要結(jié)構(gòu)及形成過程

1.1 甲醛-DNA加合物

甲醛是確定的人類致癌物。研究表明人造板材（大芯板、復(fù)合地板）及油漆所散發(fā)的甲醛是引起室內(nèi)空氣中甲醛污染的主要來源，簡(jiǎn)單裝修的室內(nèi)甲醛平均含量約為176 μg/m3，復(fù)雜裝修的室內(nèi)甲醛平均含量高達(dá)972 μg/m3[17]。卷煙煙氣中也含有一定量的甲醛，Counts ME[18]等在基于ISO標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式下分析了48個(gè)品牌卷煙的主流煙氣成分，其中甲醛含量為14-28 μg/cig。

甲醛易進(jìn)攻DNA雙鏈上的腺嘌呤和鳥嘌呤[19]，形成N6-羥甲基-腺嘌呤（N6-hydroxymethyl-dA）和N2-羥甲基-鳥嘌呤（N2-hydroxymethyl-dG），該種結(jié)構(gòu)形式在核苷狀態(tài)下不穩(wěn)定[20]，需將其在DNA水解階段加入NaBH3CN還原為穩(wěn)定的形態(tài)N6-甲基-腺嘌呤（N6-methyl-dA）和N2-甲基-鳥嘌呤（N2-methyl-dG ）（轉(zhuǎn)化率約為50-80%）才可被檢出[21]，羥甲基形式的加合物也可能被細(xì)胞內(nèi)還原性物質(zhì)（抗壞血酸和谷胱甘肽）還原為甲基形式，研究表明，與加入NaBH3CN之后的甲基形式加合物的量相比較，細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)還原量?jī)H占6-8%[21]。N6-甲基-腺嘌呤和N2-甲基-鳥嘌呤在DNA中引入了甲基，屬于DNA的烷化類堿基修飾[22]。甲醛-DNA加合物的形成過程及甲醛在體內(nèi)的代謝途徑如圖1所示。

圖1 甲醛-DNA加合物的形成過程及甲醛的代謝途徑[23-24]Fig.1 Formation process of formaldehyde-DNA adducts and metabolic pathyway of formaldehyde

1.2 乙醛-DNA加合物

乙醛為有可能的人類致癌物。人體最主要的乙醛來源為酒精的攝入[25]，Nils Homann[26]等利用頂空氣相色譜法檢測(cè)出飲酒之后唾液中乙醛含量升高，這也是酒精可引起胃與腸腫瘤的可能原因之一。卷煙煙氣中也含有微量的乙醛，在3R4F卷煙主流煙氣中含量為 486.4±44.9 μg/cig[27]。Mingyao W[28]等利用LC-ESI-MS/MS結(jié)合固相萃?。⊿PE）技術(shù)檢測(cè)出人類肝臟DNA中主要乙醛-DNA加合物為N2-亞乙基-鳥嘌呤（N2-ethylidene-dG），在DNA中其性質(zhì)較為穩(wěn)定，而在單核苷酸狀態(tài)下極不穩(wěn)定，其半衰期僅為5min[29]，需用NaBH3CN還原成N2-乙基-鳥嘌呤（N2-ethyl-dG）才能被檢測(cè)出。N2-亞乙基-鳥嘌呤可與另一分子的乙醛作用形成1,N2-丙醇-鳥嘌呤（1,N2-Propano-dG），它可引起G→T突變，并可抑制DNA的合成[4]，但該加合物在體內(nèi)由兩分子乙醛同時(shí)參與形成的觀點(diǎn)存在很大爭(zhēng)議，因?yàn)榘投谷┮部膳cDNA形成1,N2-丙醇-鳥嘌呤[8,30]，Garcia C C[31]等采用[13C2]-乙醛暴露人體細(xì)胞，結(jié)合HPLCMS/MS方法證實(shí)了乙醛與DNA可形成1,N2-丙醇-鳥嘌呤，且在體內(nèi)相對(duì)于巴豆醛而言，乙醛更易與DNA形成1,N2-Propano-dG[29]。N2-乙基-鳥嘌呤在DNA中引入了乙基屬于DNA的烷化類堿基修飾，1,N2-丙醇-鳥嘌呤為DNA的外環(huán)加成類堿基修飾。乙醛-DNA加合物的形成過程及乙醛的代謝途徑如圖2所示。

圖2 乙醛-DNA加合物的形成過程及乙醛的代謝途徑[25,31]Fig.2 Formation process of acetaldehyde-DNA adducts and metabolic pathyway of acetaldehyde

1.3 丙烯醛-DNA加合物

丙烯醛是可疑的人類致癌物。丙烯醛是一種活潑的α，β-不飽和醛，主要來自于有機(jī)物的不完全燃燒，廚房油煙中含有大量的丙烯醛，這與中國(guó)婦女肺癌多發(fā)有密切的關(guān)系[1]。卷煙煙氣中也存在微量的丙烯醛，在2R4F卷煙中含量為58.77 μg/cig[32]。目前研究最多的為丙烯醛-鳥嘌呤（Acr-dG）加合物，包括6-羥基-1,N2-丙醇-2'-鳥嘌呤（α-Acr-dG）和8-羥基-1,N2-丙醇-2'-鳥嘌呤（γ-Acr-dG），這兩種加合物的開環(huán)形式可形成DNA-DNA和DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)結(jié)構(gòu)[6]（圖3）。γ-Acr-dG是主要的dG加合物[33]，它除了正常的G:C配對(duì)方式之外，其開環(huán)形式可與dA以氫鍵方式配對(duì)，在DNA復(fù)制過程中導(dǎo)致G→T的突變（約1%）[6]，而次要加合物α-AcrdG的突變概率高于γ-Acr-dG（約8%），同樣以G→T突變?yōu)橹鱗34-35]。雖然γ-Acr-dG是主要的加合物，但是其易被DNA聚合酶分解而降低致癌性，α-Acr-dG的形成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于γ-Acr-dG，但是其不易被修復(fù)，在體內(nèi)具有累積效應(yīng)。丙烯醛的致癌性一直沒有得到確定，主要是由于不能確定γ-Acr-dG的含量[6]。α-Acr-dG和γ-Acr-dG均為DNA的外環(huán)加成類堿基修飾。丙烯醛-DNA加合物的形成過程與開環(huán)形式及丙烯醛的代謝途徑如圖3所示。

圖3 丙烯醛-DNA加合物的形成過程與開環(huán)形式及丙烯醛的代謝途徑[6, 33, 36]Fig.3 Formation process of acrolein-DNA adducts and its ringopening form and metabolic pathyway of acrolein

1.4 巴豆醛-DNA加合物

巴豆醛為可疑的人類致癌物，目前尚無足夠的動(dòng)物或人體資料證明巴豆醛具有致癌性。巴豆醛也是一種α，β-不飽和醛，性質(zhì)與丙烯醛類似。巴豆醛是一種重要的工業(yè)原料，廣泛存在于相關(guān)工作場(chǎng)所中[37]；機(jī)動(dòng)車排放尾氣中的巴豆醛濃度較高（0.02-17 mg/m3）[38]；卷煙煙氣也含有微量巴豆醛（10-228 μg/cig）[39]，是評(píng)價(jià)卷煙煙氣危害性指數(shù)的7種有害化學(xué)成分之一[40]。巴豆醛性質(zhì)較活潑，易與鳥嘌呤上的堿基發(fā)生邁克爾加成-關(guān)環(huán)反應(yīng)形成環(huán)外加成產(chǎn)物（6S,8S）和（6R,8R）-1,N2-丙醇-鳥嘌呤（（6S,8S）和（6R,8R）-1,N2-Propano-dG） 加 合 物[8,31,41]（ 圖4）。馮斌[42]等用高效液相色譜法（HPLC）分析了巴豆醛與4種單脫氧核苷酸的加合反應(yīng)，結(jié)果顯示出巴豆醛主要是攻擊DNA分子上的脫氧鳥苷酸形成加合物，與其它3種脫氧核苷酸不能發(fā)生加合反應(yīng)。Siyi Zhang[8]等利用LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)到了存在于人肺、肝和血液中的1,N2-Propano-dG加合物，結(jié)果顯示肺部該DNA加合物的含量高于肝臟，而在血液中未檢出，該加合物可抑制DNA的合成并導(dǎo)致錯(cuò)譯，巴豆醛的致突變和可能的致癌性與巴豆醛可以作用于DNA形成鳥嘌呤復(fù)合物有相關(guān)性。巴豆醛-DNA加合物的形成過程及巴豆醛的代謝途徑如圖4所示。

圖4 巴豆醛-DNA加合物的形成過程及其代謝途徑[41,43]Fig.4 Formation process of crotonaldehyde-DNA adducts and metabolic pathyway of crotonaldehyde

綜上，廣泛存在于環(huán)境基質(zhì)中的甲醛、乙醛、丙烯醛和巴豆醛可與DNA結(jié)合形成加合物，表現(xiàn)為遺傳毒性，四種醛類DNA加合物主要的結(jié)構(gòu)形式如表1所示，其中巴豆醛-DNA加合物的結(jié)構(gòu)形式與兩分子乙醛形成的DNA加合物相同。

表1 四種醛類DNA加合物的主要結(jié)構(gòu)形式Tab.1 Main structure form of DNA adducts derived from four aldehydes

2 醛類-DNA加合物的檢測(cè)方法

2.1 32P-后標(biāo)記法

32P-后標(biāo)記技術(shù)是現(xiàn)今檢測(cè)DNA加合物最為靈敏的方法，可以檢測(cè)到1-100加合物/109核苷酸，而且檢測(cè)時(shí)只需要1-10 μg的DNA樣品，此方法是利用放射性同位素32P標(biāo)記的三磷酸腺苷（ATP）與薄層色譜（TLC）或者固相微萃?。⊿PE）純化后的DNA水解產(chǎn)物結(jié)合，產(chǎn)生32P標(biāo)記的DNA加合物，再經(jīng)反相高效液相色譜純化，最后用HPLC結(jié)合放射性檢測(cè)器定性與定量，檢測(cè)32P放射強(qiáng)度，可以得到DNA加合物的含量[45-46]。Eder[47]等采用基于核酸酶P1富集，聚乙烯亞胺修飾的纖維膜TLC的32P-后標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)了用巴豆醛喂食的Fischer 344小鼠（200，300 mg/kg）20 h后不同組織中1,N2-Propano-dG的含量，在肝臟組織中檢出含有該DNA加合物而在對(duì)照組中未檢出，該方法的檢測(cè)靈敏度為3個(gè)加合物/109個(gè)核苷酸。A.Penn[48]等采用32P-后標(biāo)記/TLC/HPLC技術(shù)檢測(cè)了環(huán)境煙氣（ETS）中廣泛存在的丙烯醛（0，1，10 ppm）暴露6 h后雞動(dòng)脈DNA中Acr-dG的含量，結(jié)果顯示暴露立即結(jié)束之后Acr-dG的含量是10天之后的5倍，表明持續(xù)性暴露于環(huán)境煙氣中可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈壁DNA的損傷，并為其它ETS中的斑塊促進(jìn)劑提供位點(diǎn)，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，但是該研究未能給出是哪種Acr-dG構(gòu)型對(duì)DNA的損傷起主要作用以及相關(guān)的機(jī)制。32P-后標(biāo)記技術(shù)不能準(zhǔn)確提供分析物的結(jié)構(gòu)信息，缺乏內(nèi)標(biāo)物質(zhì)準(zhǔn)確定量，標(biāo)記效率不確定，重現(xiàn)性差，可能具有假陽(yáng)性（T4酶可與非核苷酸反應(yīng)），實(shí)驗(yàn)回收率低（約為5%-10%），具有放射性等缺點(diǎn)[16,45-46]。Emami A[49]等采用32P-后標(biāo)記/SPE/HPLC的改進(jìn)方法，首先通過優(yōu)化SPE條件將修飾的核苷與未修飾的分開，其次32P標(biāo)記之后以5’-單磷酸鹽而非3’,5’-雙磷酸鹽以更好的進(jìn)行HPLC分離，最后利用在DNA消解過程中加入谷胱甘肽（GSH）以消除Acr-dG產(chǎn)生假陽(yáng)性的可能，檢出限達(dá)到0.1 fmol，實(shí)驗(yàn)的回收率和定量效率得到提高。

2.2 單克隆抗體-酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）

單克隆抗體-酶聯(lián)免疫技術(shù)是利用待測(cè)DNA加合物的抗體與該DNA加合物之間的特異性反應(yīng)，然后加入酶標(biāo)記的二抗，酶遇底物顯色，根據(jù)顯色強(qiáng)度對(duì)DNA加合物進(jìn)行定量分析，該方法的靈敏度可達(dá)1-10個(gè)加合物/108個(gè)核苷酸水平。Foiles P G[50]等早在1987年就利用巴豆醛-DNA加合物（6R,8R）和（6S,8S）-Cro-dG的單克隆抗體結(jié)合HPLC和ELISA技術(shù)檢測(cè)了因細(xì)胞暴露于巴豆醛所產(chǎn)生的DNA加合物，該方法能夠檢測(cè)出0.5 μmol的1,N2-PropanodG/mol dG。Jishen Pan[44]等利用Acr-dG加合物的單克隆抗體結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）檢測(cè)了不同濃度Acr暴露HT29細(xì)胞，結(jié)果顯示Acr-dG與Acr的量成劑量-依賴效應(yīng)，并采用LC-MS/MS-SRM證實(shí)了該結(jié)果，ELISA技術(shù)不僅可以檢測(cè)Acr-dG作為環(huán)境和內(nèi)源性暴露于丙烯醛的生物標(biāo)志物，在研究細(xì)胞DNA損傷的分子機(jī)制中也有很大價(jià)值，但無法區(qū)分Acr-dG的同分異構(gòu)體。單克隆抗體可用于流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫、高通量的免疫組織化學(xué)方法[51]，具有較高的靈敏度，只需1 μg DNA，不需要DNA的水解與富集，前處理方法簡(jiǎn)單，具有高通量，但獲取與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的抗體較為困難。

2.3 高效液相色譜-紫外檢測(cè)技術(shù) （HPLC-UV ）

HPLC-UV技術(shù)是通過DNA或RNA中嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵，在254 nm處有最大紫外吸收實(shí)現(xiàn)的，之前的HPLC-UV技術(shù)由于分辨率的因素只能對(duì)DNA加合物進(jìn)行定性分析。2004年，Zhong W H[19]等人首次利用該技術(shù)同時(shí)實(shí)現(xiàn)了DNA及DNA加合物的定性與定量檢測(cè)，該方法使用了C18反相色譜柱，流動(dòng)相為5 mM乙酸銨，0-6%甲醇梯度洗脫，將人類胎盤DNA置于100 ppm的甲醛中37℃反應(yīng)20 h，發(fā)現(xiàn)修飾核苷的豐度為N6-OH-dA＞N2-OH-dG＞N4-OH-dC，且N6-OH-dA與N2-OH-dG在-20℃的穩(wěn)定性大于25℃，半衰期分別為50.1 h和21.0 h，為之后對(duì)甲醛-DNA加合物的研究提供了有用的參考信息。Zhong W[52]等利用體外毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合HPLCUV技術(shù)定量檢測(cè)了甲醛的細(xì)胞毒性和經(jīng)甲醛暴露后HNEC細(xì)胞中羥甲基-DNA加合物的含量，細(xì)胞的存活率和DNA加合物的含量與甲醛暴露劑量（10-500 μg/mL）成劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明甲醛與脫氧核苷形成的加合物可作為人鼻腔上皮黏膜細(xì)胞暴露于甲醛的生物標(biāo)志物，該方法用特定劑量染毒，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好但不能準(zhǔn)確給出加合物的結(jié)構(gòu)信息。

2.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）

最初的質(zhì)譜技術(shù)主要是用來檢測(cè)未知DNA加合物結(jié)構(gòu)或者對(duì)DNA加合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行結(jié)構(gòu)的確認(rèn)，隨著接口技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）越來越多地被應(yīng)用于DNA加合物的定性與定量[53]，尤其是LC-MS/MS[45]，它能提供DNA加合物的結(jié)構(gòu)信息；可用穩(wěn)定同位素做內(nèi)標(biāo)對(duì)加合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量（穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物可以作為生物體內(nèi)超痕量分析物的載體）；另外它不需要GC-MS中的衍生化步驟，可結(jié)合納流液相色譜（Nano fl ow），納升電噴霧（NSI）技術(shù)提高靈敏度。LC主要用于DNA加合物與復(fù)雜基質(zhì)的分離，質(zhì)譜主要用于提供待測(cè)物的定性與定量信息。典型LC-MS/MS分析醛類-DNA加合物流程包括：分析物及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的合成，生物樣本的獲?。ㄑ篬54]、唾液[55]和細(xì)胞[51]等），樣本前處理（DNA的提取、水解與SPE純化），儀器分析（LC-MS/MS）和數(shù)據(jù)處理。

由于缺乏現(xiàn)有可用的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物，分析物及內(nèi)標(biāo)物的合成是該技術(shù)的關(guān)鍵，甲醛、乙醛、丙烯醛和巴豆醛的DNA加合物的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)如表1所示。合成一般是由活潑的醛在一定pH緩沖液條件下直接與核苷進(jìn)行反應(yīng)，Siyi Zhang[56]等人在檢測(cè)由丙烯醛產(chǎn)生的α-Acr-dG和γ-Acr-dG時(shí)，直接將56 mg，1 mmol的丙烯醛與25 mg，0.09 mmol的dGuo在10 mL，0.1 M，pH=7的磷酸鹽緩沖溶液中37℃過夜，產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化，用UV或1HNMR檢測(cè)其濃度，產(chǎn)率為5.0%左右，合成產(chǎn)率較低。其中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[15N5]α-Acr-dG，[15N5]γ-Acr-dG用相同的方法讓醛類與[15N5]dGuo反應(yīng)。

Kun Lu[23]等利用LC-MS/MS結(jié)合同位素標(biāo)記技術(shù)顯示暴露甲醛之后的細(xì)胞中主要DNA加合物為N2-羥甲基鳥嘌呤（N2-hydroxymethyl-dG），該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易被還原成N2-甲基鳥嘌呤（N6-methyl-dG），另外該研究還顯示烷基化試劑易在N2-dG和 N6-dA位置形成甲基加合物。Chen HJ[57]等采用nanoLCNSI-MS/MS技術(shù)檢測(cè)了人白細(xì)胞和胎盤細(xì)胞DNA中的Acr-dG和Cro-dG，檢測(cè)限分別為5.0和3.0 fg（S/N=3），定量限分別為200和100 fg/20 μg DNA,相當(dāng)于9.8和4.7個(gè)Acr-dG/109核苷酸，僅需1-1.5 mL的血液樣本，具有臨床可行性,使用這一高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)可探究由于丙烯醛和巴豆醛導(dǎo)致的DNA損傷，并可將其作為癌癥的潛在生物標(biāo)志物以研究其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用。但是無論Nano-LC還是納流-增強(qiáng)型質(zhì)譜檢測(cè)器，都面臨同一個(gè)難題：α-AcrdG的一個(gè)同分異構(gòu)體與γ-Acr-dG存在共洗脫。Yin R[58]等采用NH4HCO3增強(qiáng)型-UHPLC-MS/MS技術(shù)，將NH4HCO3加入了流動(dòng)相，不僅解決了這一難題，還使質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)了2.3-8.7倍，其機(jī)制可能是Acr-dG優(yōu)先與NH4+形成復(fù)合物然后去氨化，抑制了在ESI過程中金屬離子-核苷復(fù)合物的形成，并且HCO3

-可快速分解產(chǎn)生H+，加速了Acr-dG的質(zhì)子化。四種醛類化合物-DNA加合物檢測(cè)技術(shù)的目標(biāo)物及優(yōu)缺點(diǎn)見表2所示。

表2 DNA加合物的檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)分析Tab.2 Detection methods of DNA adducts and their advantages and disadvantages

3 醛類-DNA加合物在評(píng)價(jià)煙氣暴露中的應(yīng)用

Wang M[60]等采用LC-ESI-MS/MS技術(shù)定量檢測(cè)了32個(gè)吸煙者（≥10cig/d）與30個(gè)非吸煙者白細(xì)胞DNA中的甲醛-DNA加合物的含量，吸煙組樣本中有29個(gè)檢測(cè)出含有N6-羥甲基-腺嘌呤，平均含量為179±205 fmol/μmol dA， 非吸煙組樣本中僅有7個(gè)檢測(cè)出含有N6-羥甲基-腺嘌呤，平均含量為15.5±33.8 fmol/μmol dA，該結(jié)果顯示在吸煙者與非吸煙者白細(xì)胞DNA中甲醛-DNA的含量存在明顯的差異，表明甲醛-DNA加合物可作為卷煙煙氣暴露的生物標(biāo)志物。

Li Chen[61]等采用LC-ESI-MS/MS-SRM技術(shù)在白細(xì)胞DNA酶水解階段加入NaBH3CN檢測(cè)吸煙者戒煙前后的N2-ethyl-dG含量，該方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于微克級(jí)的樣本DNA，結(jié)果顯示吸煙者白細(xì)胞DNA中N2-ethyl-dG含量為1310±1720 fmol/μmol dGuo，戒煙四周后N2-ethyl-dG含量為705±438 fmol/μmol dGuo，與戒煙前相比下降了28%（P=0.02），表明吸煙可顯著影響白細(xì)胞DNA中N2-ethyl-dG含量，其或可作為吸煙相關(guān)疾病的潛在生物標(biāo)志物。

Raghu G[59]等采用32P-后標(biāo)記-薄層色譜技術(shù)結(jié)合HPLC檢測(cè)了吸煙者和非吸煙者口腔組織中丙烯醛-DNA的含量，結(jié)果顯示γ-Acr-dG是加合物的主要形式，且吸煙者的含量是非吸煙者的3倍，首次表明Acr-dG加合物可以作為吸煙與非吸煙口腔組織中DNA損傷的生物標(biāo)志物。Siyi Zhang[56]等采用LCESI-MS/MS檢測(cè)了25個(gè)吸煙者和25個(gè)非吸煙者體內(nèi)白細(xì)胞DNA中由丙烯醛誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA加合物含量，該實(shí)驗(yàn)在DNA水解為單核苷酸的步驟中，為防止產(chǎn)生假陽(yáng)性加入了一定量的GSH（0、0.1、0.5和1.0 mM），當(dāng)GSH含量在0.5 mM以上時(shí)， DNA加合物含量差異性不大，但與對(duì)照組相比差別較大（γ-Acr-dG下降20%，α-Acr-dG下降50%），確定加入GSH的量為0.5 mM，在兩組中都檢測(cè)出了Acr-dG加合物，且γ-Acr-dG加合物是所有樣本中的主要構(gòu)型，但是總的Acr-dG量在兩組中無明顯差異，表明在生物體內(nèi)丙烯醛可能與GSH發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，有效清除了卷煙煙氣所產(chǎn)生的丙烯醛，保護(hù)白細(xì)胞DNA免受丙烯醛的損害。

Raghu G[59]等也利用32P-后標(biāo)記-薄層色譜技術(shù)結(jié)合HPLC檢測(cè)了吸煙者和非吸煙者口腔組織中巴豆醛-DNA加合物的含量，在11個(gè)吸煙者和12個(gè)非吸煙者的牙齦組織DNA中，CdG1（（6R,8R）-Cro-dG）的平均含量分別為0.53±0.44和0.06±0.07 μmol/mol dG（P=0.0015），吸煙組約為非吸煙組的8.8倍，與CdG1類似，CdG2（（6S,8S）-Cro-dG）在吸煙組中含量是非吸煙組的5.5倍，分別為1.72±1.26和 0.31±0.40 μmol/mol dG（P=0.0014），CdG1和CdG2在吸煙組和非吸煙組中含量的差異性都比AdG（丙烯醛-DNA加合物）顯著，則CdG可為吸煙誘發(fā)口腔癌的風(fēng)險(xiǎn)提供一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

甲醛、乙醛、丙烯醛和巴豆醛可直接作用于生物體的DNA形成DNA加合物，進(jìn)而造成健康風(fēng)險(xiǎn)。為了準(zhǔn)確定量此類化合物，科學(xué)家開展了大量的研究。LC-MS/MS技術(shù)用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)，可以準(zhǔn)確定量DNA加合物且能提供加合物的結(jié)構(gòu)信息，是目前檢測(cè)DNA加合物最常用的方法。但是目前研究局限于單一醛類形成的DNA加合物，樣本前處理步驟較為復(fù)雜，檢測(cè)較為繁瑣。因此亟需建立一種靈敏度高、特異性好且可同時(shí)檢測(cè)6種醛類-DNA加合物的LCMS/MS方法。

醛類-DNA加合物可作為DNA損傷的生物標(biāo)志物，且加合物的含量可與其它生物標(biāo)志物進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，如醛類-DNA加合物與尿液中醛類代謝物之間的關(guān)系。探討暴露于不同醛類含量的卷煙煙氣與形成的醛類-DNA加合物之間是否存在劑量-效應(yīng)關(guān)系是今后的研究方向。

依據(jù)專一性和靈敏度進(jìn)一步確認(rèn)醛類-DNA加合物作為煙氣暴露生物標(biāo)志物的潛力，進(jìn)而系統(tǒng)評(píng)估其與煙氣暴露的關(guān)系，有助于更好地進(jìn)行卷煙風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

[1]Stevens J F, Maier C S.Acrolein: sources, metabolism, and biomolecular interactions relevant to human health and disease [J].Molecular nutrition & food research, 2008, 52(1): 7-25.

[2]Phillips D H, Venitt S.DNA and protein adducts in human tissues resulting from exposure to tobacco smoke [J].International Journal of Cancer, 2012, 131(12): 2733-2753.

[3]Kawanishi M, Matsuda T, Yagi T.Genotoxicity of formaldehyde:Molecular basis of DNA damage and mutation [J].Frontiers in Environmental Science, 2014, 2(36): 1-8.

[4]Scott Stein Y L, In-Young Yang, Stephen S.Hecht, et al.Genotoxicity of acetaldehyde- and crotonaldehyde-induced 1,N2-propanodeoxyguanosine DNA adducts in human cells [J].Mutation research, 2006, 608(21): 1-7.

[5]Brock Matter R G, Jianwei Zhao, Zhong-Ze Li, et al.Sequence Distribution of Acetaldehyde-Derived N2-Ethyl-dG Adducts along Duplex DNA [J].Chemical Research in Toxicology, 2007, 20(10):1379–1387.

[6]Liu X Y, Zhu M X, Xie J P.Mutagenicity of acrolein and acroleininduced DNA adducts [J].Toxicology mechanisms and methods,2010, 20(1): 36-44.

[7]Wang H T, Hu Y, Tong D, et al.Effect of carcinogenic acrolein on DNA repair and mutagenic susceptibility [J].The Journal of biological chemistry, 2012, 287(15): 12379-12386.

[8]Siyi Zhang P W V, Mingyao Wang, and Stephen S.Hecht.Analysis of crotonaldehyde- and acetaldehyde-derived 1,N2-propanodeoxyguanosine adducts in DNA from human tissues using liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry [J].Chemical Research in Toxicology, 2006, 19(10):1386-1392.

[9]IARC(Intenational Agency for Research on Cancer), Agents Classi fi ed by the IARC Monographs [R].2012, 1-110:1-15.

[10]Ashley D, Burns D, Djordjevic M, et al.The scientific basis of tobacco product regulation [J].World Health Organization technical report series, 2007, 951: 78-84.

[11]Rundle A.The composition of cigarette smoke: Problems with lists of tumorigens [J].Beitrage zur Tabakforschung international,2003, 20(6): 402-437.[J].Beitrage zur Tabakforschung international, 2003, 20(6): 402-437.

[12]程學(xué)美, 邵華, 單永樂, 等.甲醛及丙烯醛對(duì)人淋巴細(xì)胞DNA分子加合作用的研究 [J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2007,17(1): 23-25.

[13]胡清源, 侯宏衛(wèi), 熊巍, 等.卷煙煙氣生物標(biāo)志物 [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2014: 151-152.

[14]Rundle A.Carcinogen-DNA adducts as a biomarker for cancer risk [J].Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2006, 600(1–2): 23-36.

[15]Hang B.Formation and repair of tobacco carcinogen-derived bulky DNA adducts [J].Journal of nucleic acids, 2010, 2010:1-29.

[16]馮 峰, 王 超, 呂美玲, 等.DNA加合物檢測(cè) [J].化學(xué)進(jìn)展,2009, 21(2): 503-513.

[17]湯波.室內(nèi)空氣中的甲醛檢測(cè)及控制 [J].環(huán)境科學(xué)與管理,2006, 31(5):168-170.

[18]Counts M E, Hsu F S, Laffoon S W, et al.Mainstream smoke constituent yields and predicting relationships from a worldwide market sample of cigarette brands: ISO smoking conditions [J].Regulatory toxicology and pharmacology : RTP, 2004, 39(2): 111-134.

[19]Zhong W H, S.Q.Quantitation of normal and formaldehydemodified deoxynucleosides by high-performance liquid chromatography/UV detection [J].Biomedical chromatography :BMC, 2004, 18(7): 462-469.

[20]Beland F A, Fullerton N F, Heflich R H.Rapid isolation,hydrolysis and chromatography of formaldehyde-modi fi ed DNA[J].Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1984, 308:121-131.

[21]Mingyao Wang G C, Peter W.Villalta, and Stephen S.Hecht.Development of Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry Methods for Analysis of DNA Adducts of Formaldehyde and Their Application to Rats Treated with N-Nitrosodimethylamine or 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone [J].Chemical Research in Toxicology, 2007,20(8): 1141-1148.

[22]田永峰, 侯宏衛(wèi), 張小濤, 等.DNA 烷基化損傷及其修復(fù)研究進(jìn)展 [J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào), 2014, 20(1): 96-102.

[23]Lu K, Craft S, Nakamura J, et al.Use of LC-MS/MS and stable isotopes to differentiate hydroxymethyl and methyl DNA adducts from formaldehyde and nitrosodimethylamine [J].Chemical research in toxicology, 2012, 25(3): 664-675.

[24]Lu K, Gul H, Upton P B, et al.Formation of hydroxymethyl DNA adducts in rats orally exposed to stable isotope labeled methanol[J].Toxicological sciences : an of fi cial journal of the Society of Toxicology, 2012, 126(1): 28-38.

[25]Yu H S, Oyama T, Isse T, et al.Formation of acetaldehyde-derived DNA adducts due to alcohol exposure [J].Chemico-biological interactions, 2010, 188(3): 367-375.

[26]Homann N, Jousimies-Somer H, Jokelainen K, et al.High acetaldehyde levels in saliva after ethanol consumption:methodological aspects and pathogenetic implications [J].Carcinogenesis, 1997, 18(9): 1739-1743.

[27]Liu C, Feng S, Van Heemst J, et al.New insights into the formation of volatile compounds in mainstream cigarette smoke[J].Analytical and bioanalytical chemistry, 2010, 396(5): 1817-1830.

[28]Wang M, Yu N, Chen L, et al.Identi fi cation of an acetaldehyde adduct in human liver DNA and quantitation as N2-ethyldeoxyguanosine [J].Chemical research in toxicology, 2006,19(2): 319-324.

[29]Wang M, Mcintee E J, Cheng G, et al.Identification of DNA adducts of acetaldehyde [J].Chemical research in toxicology,2000, 13(11): 1149-1157.

[30]Camila C.M.Garcia F N P F, Paolo Di Mascio, and Marisa H.G.Medeiros.Ultrasensitive Simultaneous Quanti fi cation of 1,N2-Etheno-2ˊ-deoxyguanosine and 1,N2-Propano-2ˊ-deoxyguanosine in DNA by an Online Liquid Chromatography Electrospray Tandem Mass Spectrometry Assay [J].Chemical Research in Toxicology, 2010, 23(7): 1245-1255.

[31]Garcia C C, Angeli J P, Freitas F P, et al.[13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2’-deoxyguanosine in human cells [J].Journal of American Chemical Society, 2011, 133(24): 9140-9143.

[32]Chen Py M S.Mainstream smoke chemical analyses for 2R4F Kentucky reference cigarette.[J].Contributions to Tobacco Research, 2003, 20(7): 447-458.

[33]Chung F L, Wu M Y, Basudan A, et al.Regioselective formation of acrolein-derived cyclic 1,N(2)-propanodeoxyguanosine adducts mediated by amino acids, proteins, and cell lysates [J].Chemical research in toxicology, 2012, 25(9): 1921-1928.

[34]Wang H T, Zhang S, Hu Y, et al.Mutagenicity and sequence specificity of acrolein-DNA adducts [J].Chemical research in toxicology, 2009, 22(3): 511-517.

[35]尹瑞川, 汪海林.丙烯醛-DNA加合物的研究進(jìn)展 [J].環(huán)境化學(xué), 2011, 30(1): 179-187.

[36]侯宏衛(wèi), 熊巍, 張小濤, 等.丙烯醛生物標(biāo)志物研究進(jìn)展 [J].環(huán)境與健康雜志, 2011, 28(8): 748-751.

[37]張志虎, 邵華, 門金龍, 等.巴豆醛及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展 [J].中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2008, 34(6): 503-505.

[38]Grosjean D, Grosjean E.Airborne carbonyls from motor vehicle emissions in two highway tunnels[J].Research Report (Health Effects Institute), 2002, 107: 57-78.

[39]A.R.Problems with the Tobacco Products Scientific Advisory Committee (TPSAC) List of Harmful or Potentially Harmful Tobacco and/or Tobacco Smoke Components [J].Beitr Zur Tabakforsch Int, 2011, 24(6): 258-276.

[40]謝劍平, 劉惠民, 朱茂祥, 等.卷煙煙氣危害性指數(shù)研究 [J].煙草科技, 2009, 2: 5-15.

[41]Irina G.Minko I D K, Thomas M.Harris, et al.Chemistry and Biology of DNA Containing 1, N2- Deoxyguanosine Adducts of the α, β- Unsaturated Aldehydes Acrolein, Crotonaldehyde, and 4- Hydroxynonenal [J].Chemical Research in Toxicology, 2009,22(5): 759-778.

[42]馮斌, 邵華, 張志虎, 等.巴豆醛-DNA加合特性的研究 [J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2012, 30(12): 935-936.

[43]趙閣, 謝復(fù)煒, 劉惠民.卷煙煙氣生物標(biāo)志物研究進(jìn)展 [J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào), 2010, 16(6): 94-103.

[44]Pan J, Awoyemi B, Xuan Z, et al.Detection of Acrolein-Derived Cyclic DNA Adducts in Human Cells by Monoclonal Antibodies[J].Chemical research in toxicology, 2012, 25(12): 2788-2795.

[45]Chen H J.Analysis of DNA adducts in human samples: acroleinderived exocyclic DNA adducts as an example [J].Molecular nutrition & food research, 2011, 55(9): 1391-1400.

[46]D.H.Phillips P B F, F.A.Beland, et al.Methods of DNA Adduct Determination and Their Application to Testing Compounds for Genotoxicity [J].Environmental and Molecular Mutagenesis,2000, 35(3): 222-233.

[47]Schuler D, Eder E.Development of a32P-postlabelling method for the detection of 1, N2-propanodeoxyguanosine adducts of crotonaldehyde in vivo [J].Archives of toxicology, 2000, 74(7):404-414.

[48]Penn A, Nath R, Pan J, et al.1,N(2)-propanodeoxyguanosine adduct formation in aortic DNA following inhalation of acrolein [J].Environmental health perspectives, 2001, 109(3): 219-224.

[49]Emami A, Dyba M, Cheema A K, et al.Detection of the acroleinderived cyclic DNA adduct by a quantitative32P-postlabeling/solid-phase extraction/HPLC method: blocking its artifact formation with glutathione [J].Analytical biochemistry, 2008,374(1): 163-172.

[50]Foiles P G, Chung F L, Hecht S S.Development of a monoclonal antibody-based immunoassay for cyclic DNA adducts resulting from exposure to crotonaldehyde [J].Cancer research, 1987,47(2): 360-363.

[51]Greenspan E J, Lee H, Dyba M, et al.High-throughput,quantitative analysis of acrolein-derived DNA adducts in human oral cells by immunohistochemistry [J].The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society, 2012, 60(11): 844-853.

[52]Zhong W, Que Hee S S.Formaldehyde-induced DNA adducts as biomarkers of in vitro human nasal epithelial cell exposure to formaldehyde [J].Mutation research, 2004, 563(1): 13-24.

[53]田永峰, 侯宏衛(wèi), 劉勇, 等.乙烯基 DNA 加合物檢測(cè)技術(shù)研究 [J].科技導(dǎo)報(bào), 2012, 30(17): 73-79.

[54]Siyi Zhang S B, Mingyao Wang, and Stephen S.Hecht.Analysis of Acrolein-Derived 1,N2-Propanodeoxyguanosine Adducts in Human Leukocyte DNA from Smokers and Nonsmokers [J].Chemical research in toxicology, 2011, 24(1): 119-124.

[55]Erin E.Bessette S D S, Angela K.Goodenough, Tao Wang,et al.Identi fi cation of Carcinogen DNA Adducts in Human Saliva by Linear Quadrupole Ion Trap/Multistage Tandem Mass Spectrometry [J].Chemical research in toxicology, 2010, 23(7):1234–1244.

[56]Siyi Zhang P W V, Mingyao Wang, and Stephen S.Hecht.Detection and quantitation of acrolein-derived 1,N2-propanodeoxyguanosine adducts in human lung by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry [J].Chemical research in toxicology, 2007, 20(4):566-571.

[57]Chen H J, Lin W P.Simultaneous quantification of 1,N2-propano-2’-deoxyguanosine adducts derived from acrolein and crotonaldehyde in human placenta and leukocytes by isotope dilution nano fl ow LC nanospray ionization tandem mass spectrometry [J].Analytical chemistry, 2009, 81(23): 9812-9818.

[58]Yin R, Liu S, Zhao C, et al.An ammonium bicarbonate-enhanced stable isotope dilution UHPLC-MS/MS method for sensitive and accurate quantification of acrolein-DNA adducts in human leukocytes [J].Analytical chemistry, 2013, 85(6): 3190-3197.

[59]Raghu G.Nath J E O, Joseph B.Guttenplan, and Fung-Lung Chung.l,N2-Propanodeoxyguanosine Adducts: Potential New Biomarkers of Smoking induced DNA Damage in Human Oral Tissue [J].Cancer research, 1998, 58(15): 581-584.

[60]Wang M, Cheng G, Balbo S, et al.Clear differences in levels of a formaldehyde-DNA adduct in leukocytes of smokers and nonsmokers [J].Cancer research, 2009, 69(18): 7170-7174.

[61]Li Chen M W, Peter W.Villalta, Xianghua Luo, et al.Quantitation of an acetaldehyde adduct in human leukocyte DNA and the effect of smoking cessation [J].Chemical research in toxicology, 2007,20(1): 108-113.

Research progress in detection technology of DNA adducts derived from aldehydes

LIU Lujuan, CHEN Huan, HOU Hongwei, HU Qingyuan
China National Tobacco Quality Supervision & Test Center, Zhengzhou 450001, China

Formaldehyde, acetaldehyde, acrolein and crotonaldehyde exist widely in environmental pollutants and cigarette smoke also contains trace amounts of these aldehyde compounds.They can cause damage by attacking nucleophilic groups in the body directly.A covalent bond can be formed with DNA molecule to form DNA adducts.The formation of DNA adducts is a form of damage of DNA,which can change genetic information in the process of DNA replication.This paper reviewed six typical DNA adducts derived from aldehydes in organism and their research methods and progress of using aldehydes-DNA adducts as biomarkers in cigarette smoke exposure.Simultaneous quantitative analysis of multiple DNA adducts for cigarette smoke and its future development were also discussed.

cigarette smoke; formaldehyde; acetaldehyde; acrolein; DNA adducts

劉魯娟,陳歡,侯宏衛(wèi),等.醛類-DNA加合物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2015,21（5）

劉魯娟（1991—），碩士研究生，主要研究方向?yàn)槲鼰熍c健康及其生物標(biāo)志物，Email: liulujuanlwh@126.com

侯宏衛(wèi)（1975—），高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槲鼰熍c健康及其生物標(biāo)志物，Email: qsfctc@163.com胡清源（1965—），研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槲鼰熍c健康，Email: huqy1965@163.com

2014-12-29

:LIU Lujuan, CHEN Huan, HOU Hongwei, et al.Research progress in detection technology of DNA adducts derived from aldehydes [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(5)