光強衰減對煙草葉片碳氮代謝關(guān)鍵基因表達的影響

楊惠娟，王紅麗，史宏志*，陳永明

1 河南農(nóng)業(yè)大學國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，河南鄭州文化路95號 450002；2 廣東煙草南雄科學研究所，廣東南雄，512400

生物技術(shù)

光強衰減對煙草葉片碳氮代謝關(guān)鍵基因表達的影響

楊惠娟1，王紅麗1，史宏志*1，陳永明2

1 河南農(nóng)業(yè)大學國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，河南鄭州文化路95號 450002；2 廣東煙草南雄科學研究所，廣東南雄，512400

通過電子顯微鏡和反轉(zhuǎn)錄PCR方法研究了煙草在遮光處理（分別為100%, 85%, 70% 和 55%的自然光照強度）下煙葉移栽后78天、85天、105天及120天（采收當天）四個時期淀粉的積累和淀粉、糖、氮代謝途徑關(guān)鍵基因表達量的變化。結(jié)果表明，移栽后105天煙葉生理成熟期之前淀粉含量受光照影響最大，隨著光的衰減含量逐漸降低。葡萄糖轉(zhuǎn)化及蔗糖的合成途徑中有4個關(guān)鍵基因表達量隨光強減少逐漸降低，且隨著煙草的成熟也呈下降趨勢。淀粉合成酶基因GBSSI在葉片擴展期表達較弱，在葉片成熟期大量表達，隨著光照強度的減弱表達量稍有減小。氮代謝途徑關(guān)鍵基因Nir、GS等同工酶基因的表達存在一定的互補性，總體基因表達趨勢為隨光強的減弱表達量逐漸增加，表明在弱光下煙葉氮代謝滯后。

烤煙 ；光強；淀粉；基因表達

植物具有適應(yīng)光環(huán)境急劇變化的能力，葉片是主要感受光的器官，無論是低光、強光和過強光，植物對長、短日照的感受都依賴葉片[1]。植物對光照強度的反應(yīng)較為復雜，低光主要影響植物的碳代謝，研究報道碳平衡在植物對低光的反應(yīng)中起重要作用，低光下光合速率和作物產(chǎn)量都顯著降低[2]。遮蔭可以降低植物中可溶性糖和淀粉的含量，也可以抑制果實的生長和誘導果實酸化[3-5]。光強是決定煙草葉片生長、產(chǎn)量和質(zhì)量形成的重要決定因子。光照較強的環(huán)境生長的煙株鮮重，干重，根體積，干鮮比、根冠比、株高和莖圍都大于光照較弱的煙株。隨著光照強度的降低，葉片及其表皮、柵欄組織、海綿組織的厚度都呈降低趨勢，氮代謝強于碳代謝，葉片葉綠素a和葉綠素b，以及類胡蘿卜素的含量也都隨之增加[6]。在一定范圍內(nèi)低光處理可以影響煙草基因表達及信號傳導[7]。有研究報道在煙草中過表達葉綠素加氧酶基因無論在高光強還是低光強條件下都可以導致淀粉含量增加，干物質(zhì)積累[8]。在低光低溫條件下煙草光系統(tǒng)Ⅱ的活性比高光高溫條件下降低更多[9]。光在煙草葉片淀粉合成和積累過程中尤為重要，煙草氮代謝也是受光照影響較大的一個方面，與碳代謝也是相互影響[10]。但目前尚無確切的研究報道煙草葉片在不同光環(huán)境下淀粉、糖及氮代謝變化的分子機制。本研究針對光衰減環(huán)境對煙草葉片淀粉合成及積累以及相關(guān)代謝過程中的關(guān)鍵基因的表達進行了研究，以期探索淀粉、糖及氮代謝途徑間的相互聯(lián)系以及對弱光的響應(yīng)機制。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2012年在廣東煙草南雄科學研究所進行，所用烤煙品種為NX232，采用漂浮育苗，2月23日移栽，行距1.2m，株距0.5m。于煙葉團棵期開始進行遮光處理，遮光所用材料為尼龍網(wǎng)。光照強度使用照度計（ZDS-10F, Shanghai, China）進行測定。光處理分為4組，分別為100%自然光、兩層尼龍網(wǎng)遮光處理（光強約為85%）、三層尼龍網(wǎng)遮光處理（光強約為75%）及四層尼龍網(wǎng)遮光處理（光強約為55%）。煙草生長期間兩次檢測光照強度，每處理分別檢測棚內(nèi)和棚外光照強度，棚內(nèi)檢測3次，取平均值計算每個處理下光照強度（表1）。每個處理面積為36平方米，按照當?shù)爻Ｒ?guī)栽培措施進行施肥、灌水、打頂?shù)却筇锕芾怼?/p>

1.2 方法

每個處理選取3-5株烤煙中部葉位葉片混合取樣，取樣時間為移栽后78d ，85 d， 105 d和120d(采收當天)，樣品放液氮中保存?zhèn)溆谩悠钒凑针娮语@微鏡和RT-PCR實驗要求處理。電子顯微鏡觀察淀粉粒的組織結(jié)構(gòu)變化，各代謝途徑關(guān)鍵基因用RT-PCR方法檢測。檢測基因所用的引物序列見表2。選取Actin基因為內(nèi)參基因。

表1 遮陰條件下各處理的光照強度Tab.1 Light intensity tests on the environments of four groups

表2 淀粉和糖及氮代謝途徑關(guān)鍵基因表達檢測所用的引物序列表Tab.2 Primers used for expression examination of genes involved in the sugar, starch, and nitrogen metabolism pathway.

續(xù)表2

2 結(jié)果和討論

2.1 光強衰減對煙草葉片淀粉積累的影響

電鏡結(jié)果顯示，移栽后78d烤煙葉片擴展期和85d葉片成熟期樣品中淀粉粒含量隨光照強度的變化呈逐漸減少的趨勢，移栽后85d自然光照下的成熟期葉片淀粉粒體積大，積累早，85%光照環(huán)境下淀粉粒則體積變小，數(shù)量減少，隨著光強降低至70%和55%，淀粉粒顯著減少，直至最弱光下幾乎無積累。移栽后105d生理成熟期各光照處理間淀粉粒數(shù)量差距逐漸縮小，但淀粉粒體積差異顯著。縱向來看，隨著葉片的生長和成熟，淀粉粒含量呈增加趨勢，在移栽后105天烤煙生理成熟期時，各處理下淀粉含量都達到最大。由結(jié)果可以看出，光強對葉片淀粉積累影響最為顯著的時期是在移栽后105天即煙葉的生理成熟期以前，在葉片生理成熟期淀粉到達峰值隨后在采收時樣品中淀粉粒明顯減少，顆粒完整度降低 (圖1)，說明此時淀粉粒已發(fā)生明顯的降解，在不同光強條件下的煙葉樣品間沒有明顯差異，均處于減少、降解的狀態(tài)。結(jié)果表明光照衰減對生長期烤煙葉片淀粉的合成和積累影響較大。

圖1 各光強處理下及不同時期煙草葉片組織的電鏡照片*Fig.1 Ultrastructure images of starch grains in tobacco leaf samples at different stages under different light intensity environments

2.2 光照衰減對淀粉和糖代謝途徑基因表達的影響

電鏡結(jié)果顯示淀粉的積累主要發(fā)生在移栽后105天之前，通過RT-PCR方法對移栽后78d的擴展期葉片和85d成熟期葉片中目的基因表達量進行了檢測(圖 2)。結(jié)果顯示受光強衰減的影響，有6個與淀粉和糖代謝相關(guān)基因的表達量發(fā)生了變化，分別為負責糖轉(zhuǎn)化和合成的胞外轉(zhuǎn)化酶(INV)，UDP-葡萄糖脫氫酶(UGDD)，蔗糖合成酶(SuSy)，6-磷酸蔗糖磷酸酶(SPP2)，及負責淀粉合成的顆粒淀粉合成酶(GBSS I)與淀粉分支酶(SBE)[11-15]。

其中糖代謝關(guān)鍵酶INV，UGDD，SPP2基因不僅受光照強度的影響，在不同生長時期表達量也有顯著差異，其在成熟期的葉片樣品中表達量顯著低于擴展期煙葉樣品中的表達量。隨著光照強度的減弱，基因表達量顯著減少，特別是INV基因。SuSy基因的變化較為復雜，在擴展期的樣品中表達量在自然光下表達較少，而在遮光條件下表達量增加，可能與煙葉的長勢有關(guān)。在成熟期的樣品中SuSy基因表達量則隨光強的減弱逐漸減少，直至55%光照處理的樣品中表達量幾乎為零，整體表達都低于葉片擴展期各處理的表達量，表明隨著煙草生長發(fā)育時期的延長，糖的合成也是逐漸降低的。糖代謝途徑的4個關(guān)鍵基因控制著蔗糖的合成和轉(zhuǎn)化，隨著葉片成熟進程，這4個基因的表達逐漸降低，表明隨著光強的減弱，在這些基因的影響下蔗糖的合成轉(zhuǎn)化也會逐漸減少。

涉及淀粉代謝的基因中有兩個關(guān)鍵基因GBSS I和SBE在處理間變化較為顯著。淀粉合成的控制基因GBSS I受葉片生長時期的影響較大，而受光照影響較小。與擴展期煙葉樣品相比，該基因在成熟期煙葉樣品中大量表達，表明此時淀粉大量合成，導致移栽后105天時淀粉粒的積累達到高峰。淀粉含量不僅受淀粉合成途徑的影響，也受糖含量的影響，由此可見前兩個時期中光衰減導致的淀粉含量逐漸減少的主要原因是弱光抑制了糖分的合成和轉(zhuǎn)化，因此導致淀粉含量的減少。顆粒淀粉合成關(guān)鍵基因GBSS I在葉片的擴展期表達量較弱，而在成熟期淀粉合成酶大量表達，這與電鏡顯示擴展期葉片淀粉含量較低，而之后逐漸增加的結(jié)果一致。結(jié)果也說明移栽后85天至移栽后105天葉片中淀粉大量合成導致了在隨后移栽105天時各個光照強度處理條件下的淀粉含量均達到最高。SBE基因是催化直連淀粉向支鏈淀粉轉(zhuǎn)化的酶，但對于淀粉的合成不起決定作用。結(jié)果顯示SBE基因在兩個時期均受到光照強度的影響，都呈隨光強減弱先增加后減小的表達模式，但擴展期葉片SBE基因受光強的影響程度小于成熟期葉片。擴展期煙葉在85%的光照強度下SBE基因表達量最高，隨后逐漸降低。而在成熟期煙葉樣品中隨光照減弱表達量降低更加明顯，結(jié)果表明煙草葉片中直鏈淀粉向支鏈淀粉的轉(zhuǎn)化受光照的影響較大。

圖2 糖、淀粉途徑關(guān)鍵基因在不同光強處理下及不同時期表達量的變化

2.3 光照衰減對氮代謝途徑基因表達的影響

試驗中對氮代謝途徑7個關(guān)鍵基因表達量進行了檢測，包括谷氨酰胺合成酶（GS）兩個同工酶 (GS1-3與GS1-5)、硝酸還原酶基因（Nit）、谷氨酸脫氫酶（Gdh1）和亞硝酸還原酶三個同工酶基因(Nir-1, Nir-2和Nir-3)(圖3)。亞硝酸還原酶、谷氨酸脫氫酶和谷氨酰胺合成酶都是氮代謝途徑中氮還原的關(guān)鍵酶，控制著硝態(tài)氮向銨離子的轉(zhuǎn)化及銨離子的同化，兩個步驟緊密相連[16]。

結(jié)果顯示由于GS1-3和GS1-5是同工酶，兩個基因的表達呈較為明顯的互補趨勢，表明兩個基因?qū)鈴娮兓姆磻?yīng)有差異，整體來看擴展期葉片谷氨酰胺合成酶基因的表達在不同光強處理下沒有明顯的規(guī)律性，在100%自然光下表達量最弱，弱光處理下表達量有所增加。成熟期葉片各光強處理下表達量互相補充，差異性較小，整體略高于擴展期葉片的表達量。Gdh1谷氨酸脫氫酶在成熟期葉片中表達量隨光強變化較為規(guī)律，隨著光強減弱，其表達量逐漸增加。亞硝酸還原酶的三個同工酶Nir-1、Nir-2和Nir-3基因表達趨勢與GS同工酶相似，表達具有互補效應(yīng)，Nir-2基因受光照影響最大，在弱光下表達量高于自然光條件下表達量。亞硝酸還原酶與谷氨酸脫氫酶兩個關(guān)鍵酶在弱光處理下表達模式一致，均在弱光條件下表達較強，表明氮同化代謝在弱光條件下維持在較高的水平，這可能與在弱光下葉片氮代謝滯后有關(guān)。

圖3 氮代謝途徑關(guān)鍵基因在不同光強處理下及不同時期表達量的變化

3 結(jié)論

光強衰減可以導致煙草葉片淀粉含量的降低，糖的合成基因受弱光影響表達顯著降低，淀粉合成酶表達量不受光強的影響，在煙草生長的成熟期大量表達，在移栽后105天時各光強處理下淀粉含量均達到最高，之后淀粉開始降解,弱光促進氮代謝途徑關(guān)鍵酶的表達從而適度增強了氮代謝生理過程?？緹熑~片糖和氮代謝途徑受光強的衰減影響最大。

[1]Magdalena Szechyńska-Hebda，Stanis?aw Karpiński.Light intensity-dependent retrograde signalling in higher plants[J].Journal of Plant Physiology, 2013, 170:1501-1516.

[2]Fran?ois Vasseur, Florent Pantin, Denis Vile.Changes in light intensity reveal a major role for carbon balance in Arabidopsis responses to high temperature[J].Plant, cell&environment,2011,34:1563-1576.

[3]Jo?o S,Isabel B,Monya M Costa,et al.Physiological Responses of Zostera marina and Cymodocea nodosa to Light-Limitation Stress[M].PLoS One.2013,28;8(11):e81058.

[4]Li C, Wang Y, Huang X,et al.De novo assembly and characterization of fruit transcriptome in Litchi chinensis Sonn and analysis of differentially regulated genes in fruit in response to shading[M].BMC Genomics.2013 ,14;14:552.

[5]Pietro S, Antonino P, Davide Pet al.Effect of arti fi cial shading on the tannin accumulation and aromatic composition of the Grillo cultivar (Vitis vinifera L.)[J].BMC Plant Biol.2013, 6;13(1):175.

[6]楊興有,崔樹毅,劉國順,等.弱光環(huán)境對煙草生長、生理特性和品質(zhì)的影響.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2008,16(3):635-639.

[7]Christos K, Nicholas V,Maria G D,et al.DCL3 and DCL4 are likely involved in the light intensity-RNA silencing cross talk in Nicotiana benthamiana[M].Plant signaling &behavior 2011, 6:8,1180-1182.

[8]Ajaya K B, Gopal K P, Shiv S P, et al.Light intensitydependent modulation of chlorophyll b biosynthesis and photosynthesis by overexpression of chlorophyllide a oxygenase in tobacco[J].plant physiology,2012, 159:433-449.

[9]Zhang Wei, Huang Wei,Yang Qiuyun, et al.Effect of growth temperature on the electron flow for photorespiration in leaves of tobacco grown in the field[J].Physiologia Plantarum, 2013,149:141-150.

[10]顧少龍,史宏志.光照對烤煙生長發(fā)育及質(zhì)量形成的影響研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2010,5：120-124.

[11]王連軍.高等植物中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2014, 42(24): 8108-8111.

[12]賀順姬,趙向麗,韓銳,等.鹽藻尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶（DsUGD）基因的功能預(yù)測[J].四川大學學報：自然科學版,2006,43(3):713-716.

[13]李和平,李海明,潘世明.甘蔗熱帶種BadUa蔗糖合成酶基因的克隆及表達分析[J].生物技術(shù)通報,2013,11:58-62.

[14]唐朝榮,肖小虎,方永軍,等.巴西橡膠樹磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表達模式分析[J].熱帶作物學報,2013, 34(5): 855-859.

[15]王自布,黃燕芬,吳坤,等.籽粒淀粉合成酶與淀粉合成關(guān)系的研究進展[J].生物技術(shù)進展, 2013, 3(5): 336-341.

[16]王冠,周清明,楊宇虹,等.烤煙碳氮代謝及其關(guān)鍵酶研究進展[J].作物研究, 2012, 26(2): 189-192.

Effects of light attenuation on expression of pivotal genes in carbon and nitrogen metabolism in tobacco leaves

YANG Huijuan1, WANG Hongli1, SHI Hongzhi1，CHEN Yongming2
1 Henan Agricultural University, National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Key Laboratory for Tobacco Cultivation of China Tobacco, Zhengzhou 450002, China;2 Nanxiong Tobacco Research Institute, Guangdong Province, Nanxiong 512400, China

Electrical microscope and reverse transcriptional PCR were used to study starch accumulation and genes expression involved in starch, sugar and nitrogen pathway in tobacco leaves.Four light attenuation treatments (100%, 85%, 70% and 55% of natural light intensity respectively) achieved by shading were applied and tobacco leaves were sampled at 78d, 85d, 105d after transplanting and 120d at harvesting.Results showed that starch reacted the strongest to light intensity.It decreased with the reduction of light intensity before 105d.Expression of four genes involved in sugar metabolism became lower with the decrease of light intensity and also in line with tobacco maturing process.GBSSIgene expressed at a low level in samples on 78d during which tobacco leaf was in the progress of expansion,while gene expression increased dramatically on 85d when leaves had entered maturing stage.The expression of isoenzyme genes ofNirfamily and GS family showed certain complementary effect.The expression level of genes in general decreased with light attenuation,indicating that low light intensity delayed nitrogen metabolism expression.

fl ue-cured tobacco; light intensity; starch; gene expression

楊惠娟，王紅麗，史宏志,等.光強衰減對煙草葉片碳氮代謝關(guān)鍵基因表達的影響[J].中國煙草學報，2015,21（5）

中國煙草總公司濃香型特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項項目（Ts-01-2011002）

楊惠娟（1978—），博士，副教授，碩士生導師，從事煙草分子生物學研究，Email：huijuan@zju.edu.cn

史宏志（1963—），博士，教授，博士生導師，從事煙草栽培生理研,Email:shihongzhi88@163.com

2015-01-28

:YANG Huijuan, WANG Hongli, SHI Hongzhi , et al.Effects of light attenuation on expression of pivotal genes in carbon and nitrogen metabolism in tobacco leaves [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(5)