兒童呼吸道分離肺炎支原體藥物敏感性分析

張 泓， 葉信予， 徐曉剛， 王明貴， 劉 楊

·論著·

兒童呼吸道分離肺炎支原體藥物敏感性分析

張 泓1， 葉信予2， 徐曉剛2， 王明貴2， 劉 楊2

目的 了解兒童呼吸道肺炎支原體臨床分離株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性。方法 采用微量稀釋法測(cè)定分離自呼吸道感染患兒的112株肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性。對(duì)肺炎支原體核糖體23S rR N A全序列進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序。結(jié)果 98株（87.5%）肺炎支原體臨床分離株對(duì)紅霉素和阿奇霉素耐藥，耐藥株均存在A2063 G 或A2064 G的23S rR N A核苷酸點(diǎn)突變。四環(huán)素類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)對(duì)肺炎支原體仍具有良好的抗菌活性。結(jié)論 呼吸道感染患兒肺炎支原體臨床分離株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率高，核糖體23S rR N A核苷酸點(diǎn)突變是導(dǎo)致其對(duì)紅霉素和阿奇霉素耐藥的原因。

肺炎支原體； 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)； 四環(huán)素類(lèi)； 氟喹諾酮類(lèi)； 耐藥性

肺炎支原體（M ycoplasm a pneu moniae）是引起社區(qū)獲得性呼吸道感染的主要病原體之一，尤其在學(xué)齡期兒童和青少年中［1］。2000年以來(lái)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎支原體在全球范圍內(nèi)報(bào)道增多，尤其是東亞地區(qū)［2］。本研究對(duì)分離自?xún)和潞粑栏腥净颊叩姆窝字гw臨床分離株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，以明確近年來(lái)肺炎支原體對(duì)常用抗菌藥物的敏感性變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源與分離培養(yǎng)

痰液標(biāo)本來(lái)自2009年1月—2011年3月上海市兒童醫(yī)院呼吸道感染患兒因診斷需要常規(guī)留取的鼻咽部吸取物。根據(jù) W aites等［3］2001年描述的方法進(jìn)行肺炎支原體分離培養(yǎng)，臨床標(biāo)本直接接種于肺炎支原體SP4液體分離培養(yǎng)基，并繼以1∶10、1∶100梯度稀釋后分離接種于 SP4固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基置于37℃孵育，固體培養(yǎng)基置于37℃、5%C O2孵育。同一標(biāo)本任何稀釋度的液體培養(yǎng)基由清澈變黃色者陽(yáng)性（分解葡萄糖產(chǎn)酸，p H 值下降），和（或）固體培養(yǎng)基見(jiàn)典型菌落（煎蛋樣）后，顯微鏡下挑取單菌落再次接種于SP4液體培養(yǎng)基，變色后置-80℃保存。

1.2 SP4培養(yǎng)基的配置

根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（C LSI）頒布的關(guān)于肺炎支原體藥敏試驗(yàn)M 43-P 2011年版規(guī)程配置SP4液體和固體培養(yǎng)基［4］。SP4液體和固體培養(yǎng)基簡(jiǎn)要配方：①基質(zhì)配方（每1 000 m L）：去離子純水643 m L，不含結(jié)晶紫的支原體肉湯培養(yǎng)基3.5 g，胰蛋白胨10.0 g，蛋白胨5.3 g，1%酚紅2.0 m L，F(xiàn)ei魚(yú)卵提取D N A 0.2 g；如配置固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g。②添加劑配方（每1 000 m L）：熱滅活（56℃30 min）胎牛血清170 m L，25%酵母提取液35 m L，2%酵母自溶液100 m L，50%葡萄糖 10 m L，C M R L 1066-10 X 50 m L。分別配制后，培養(yǎng)基基質(zhì)121℃20 min滅菌，冷卻后加入經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾的添加劑，最終p H 值調(diào)整至7.4～7.6。液體培養(yǎng)基用于原代培養(yǎng)、菌株保存及藥敏試驗(yàn)，固體培養(yǎng)基用于純化培養(yǎng)。

1.3 肺炎支原體的分子生物學(xué)鑒定

煮沸法提取標(biāo)本中肺炎支原體 D N A。根據(jù)Ieven等［5］描述的針對(duì)肺炎支原體 P1黏附蛋白編碼基因設(shè)計(jì)和合成 PC R引物（5′-G C C A C C C T C GG G G G C A G T C A G-3′和5′-G A G T C G G G A T T C C CC G C G G A G G-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PC R擴(kuò)增產(chǎn)物大小為209 bp。肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株 M PF H（A T C C 15531）由北京兒科研究所提供。

1.4 抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品

藥物敏感性測(cè)定所用藥物：紅霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、左氧氟沙星和莫西沙星，均為Sig ma公司標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 最低抑菌濃度（M IC）測(cè)定

根據(jù) C LSI M 43-P 2011年版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程［4］，采用微量稀釋法測(cè)定肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物的敏感性。受試肺炎支原體的接種量為104～105C F U/m L；紅霉素測(cè)定的濃度范圍為0.007～256 m g/L，阿奇霉素為0.007～128 m g/L，四環(huán)素類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)為0.007～8 m g/L。紅霉素和阿奇霉素M IC≤0.5 m g/L者判定為敏感，＞1 m g/L者判斷為耐藥［4］。設(shè)培養(yǎng)基陰性對(duì)照和生長(zhǎng)對(duì)照，當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照為陽(yáng)性而培養(yǎng)基對(duì)照保持陰性時(shí)讀取M IC值。肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株M PF H （A T C C 15531）為質(zhì)控菌株。

1.6 肺炎支原體核糖體23S rR N A基因序列分析

自行設(shè)計(jì)引物，委托生工生物工程（上海）股份有 限 公 司 合 成 （5′-C A A T A A G T T A C T A AG G G C T T A T G G T G G A T G C-3′，5′-T C C A A T A A GT C C T C G A G C A A T T A G T A T T A C T C A G-3′）， 采用P C R法擴(kuò)增肺炎支原體23S rR N A全序列，由華大基因科技有限公司測(cè)序［6］，以確認(rèn)各臨床分離株是否存在核糖體核苷酸點(diǎn)突變。

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體臨床株分離情況

2009年1月—2011年3月1 235份兒童患者鼻咽部吸取物通過(guò)SP4培養(yǎng)基培養(yǎng)，共分離培養(yǎng)到肺炎支原體112株，陽(yáng)性率為9.1%（112/1 235）。對(duì)培養(yǎng)獲得的112株肺炎支原體采用特異性黏附因子P1黏附蛋白引物的PC R擴(kuò)增，結(jié)果顯示112株肺炎支原體均獲得209 bp的特異性黏附因子的擴(kuò)增條帶，確認(rèn)為肺炎支原體。

2.2 肺炎支原體對(duì)抗菌藥物的敏感性

肺炎支原體臨床分離株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率高，98株（87.5%）對(duì)紅霉素和阿奇霉素耐藥，二者M(jìn) IC50和 M IC90均＞128 m g/L。僅14株（12.5%）對(duì)紅霉素敏感，M IC均≤0.06 m g/L。

受試的四環(huán)素類(lèi)對(duì)肺炎支原體均具有強(qiáng)大的體外抗微生物活性。四環(huán)素和多西環(huán)素的M IC50和M IC90分別為0.06 m g/L和0.125 m g/L。受試的氟喹諾酮類(lèi)對(duì)肺炎支原體亦具有良好的體外抗微生物活性。相比較 而言，莫西 沙星 M IC50和 M IC90均為0.06 m g/L，明顯優(yōu)于左氧氟沙星，后者的M IC50和 M IC90均為0.5 m g/L，見(jiàn)表1。

2.3 肺炎支原體核糖體23S rR N A序列分析

98株判定為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥的肺炎支原體均存在23S rR N A的核苷酸點(diǎn)突變，97株為 A2063 G突變，1株為 A2064 G突變。14株敏感株均不存在23S rR N A點(diǎn)突變。

表1 6種抗菌藥物對(duì)112株肺炎支原體臨床分離株的體外抗微生物活性Table 1 In vitroactivity of 6 antimicrobial agents against 112M.pneu moniaestrains（M IC：m g/L）

3 討論

肺炎支原體臨床株分離培養(yǎng)周期長(zhǎng)，技術(shù)要求高，臨床上不作為常規(guī)檢測(cè)開(kāi)展。近年來(lái)由于其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率不斷上升，因此需要進(jìn)行培養(yǎng)以獲得更多藥效學(xué)數(shù)據(jù)。利用肺炎支原體生化特性（分解葡萄糖產(chǎn)酸，SP4液體培養(yǎng)基p H 值下降使含酚紅的培養(yǎng)基變?yōu)辄S色）以及SP4固體培養(yǎng)基見(jiàn)典型菌落（煎蛋樣）可以初步確定菌種。但發(fā)酵支原體（M ycoplasm a fermentans）亦可引起呼吸道感染且存在上述生化特性及類(lèi)似菌落形態(tài)［3］，因此在分離獲得純化菌株后，仍需通過(guò)P C R方法以確認(rèn)。目前肺炎支原體肺炎檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)多針對(duì)16S rR N A、P1黏附蛋白編碼基因和A T P酶操縱子［1］。P1蛋白是一種胰蛋白酶敏感的大分子表面蛋白，是肺炎支原體的特異性黏附因子。本研究采用針對(duì)P1基因的引物進(jìn)行鑒定，證實(shí)所分離的臨床分離株均為肺炎支原體。

2011年10月C LSI頒布了支原體藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，同時(shí)制定了臨床常用治療肺炎支原體抗菌藥物的建議耐藥折點(diǎn)［4］。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)中紅霉素和阿奇霉素 M IC≤0.5 m g/L 判定為敏感，＞1 m g/L判斷為耐藥（一般耐藥株M IC≥16 m g/L）。這是首次正式提出肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥折點(diǎn)。該指南同時(shí)指出該耐藥折點(diǎn)是參考大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)于其他革蘭陽(yáng)性菌已建立的耐藥折點(diǎn)而制定，是探索性的，將會(huì)根據(jù)收集到新的相關(guān)數(shù)據(jù)隨時(shí)更新。這些不斷更新的數(shù)據(jù)資料包括檢測(cè)菌株是否存在已知的、明確的耐藥機(jī)制，M IC值升高是否影響藥物抗微生物活性、藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特性，菌株的M IC值與臨床預(yù)后的相關(guān)性等多個(gè)因素。目前最根本的工作是收集更多的臨床分離株，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行藥敏測(cè)定，以得到更多的M IC值分布數(shù)據(jù)，從而進(jìn)一步明確耐藥折點(diǎn)。

本研究根據(jù)已頒布的C LSI標(biāo)準(zhǔn)化藥敏操作規(guī)程進(jìn)行肺炎支原體藥敏試驗(yàn)，并同時(shí)檢測(cè)了臨床耐藥株是否存在核糖體23S rR N A核苷酸點(diǎn)突變。結(jié)果顯示，2009—2011年分離的肺炎支原體對(duì)常用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)仍保持極高的耐藥率（87.5%），與2005—2008年結(jié)果相仿［7］。

肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥主要與靶位改變有關(guān)，其耐藥機(jī)制主要為核糖體23S rR N A V區(qū)中心環(huán)核苷酸序列改變（2063位A→G，2064位A→G），導(dǎo)致抗菌藥物與核糖體親和力下降而引起耐藥。本 組 資 料 顯 示，耐 藥 株 均 存在核糖 體 23S rR N A核苷酸點(diǎn)突變，敏感株則不存在上述突變，突變位點(diǎn)明顯集中于 A2063 G位點(diǎn)（99.0%，97/98）。

目前認(rèn)為對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎支原體的出現(xiàn)和流行始于2000年，以東亞（日本和中國(guó)）為主要流行地區(qū)，耐藥率逐年上升。日本地區(qū)在2000年以前未報(bào)道過(guò) 對(duì) 大環(huán)內(nèi) 酯 類(lèi)耐 藥 的肺炎 支 原 體［8］，而2000—2010年報(bào)道的兒童患者中肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率為13%～70%，成人患者中分離的肺炎支原體耐 藥率僅 6%［9-14］。中 國(guó)報(bào) 道的 耐 藥率最高，部分地區(qū)兒童患者臨床分離株的耐藥率超過(guò)90%（83% ～92%），成人 菌 株 耐 藥 率69%［6-7，15-18］。此外，肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率超過(guò)20%的國(guó)家還包括韓國(guó)（兒童，31.4%）［19］、以色列（兒童和成人，30%）［20］、意大 利（兒 童，26%）［21］以及 美 國(guó)的一項(xiàng)流行的報(bào)道，耐藥率為27%（3/11）［22］。本研究結(jié)果顯示，目前兒童患者呼吸道分離肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率高，臨床疑似肺炎支原體感染的兒童患者在初始治療時(shí)需要考慮大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥株感染的可能。

由于諸多可能發(fā)生的不良反應(yīng)，兒童患者選用四環(huán)素類(lèi)及氟喹諾酮類(lèi)藥物受到極大限制。臨床研究顯示，阿奇霉素治療大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎支原體仍可獲得臨床治愈，僅發(fā)熱和退熱時(shí)間延長(zhǎng)［16］。原因可能與阿奇霉素在細(xì)胞內(nèi)濃度較高以及存在免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。因此，目前肺炎支原體感染患兒，無(wú)論是否為耐藥株感染，仍推薦首先選用阿奇霉素治療。但值得關(guān)注的是，本研究中阿奇霉素M IC值有上升趨勢(shì)（2005—2008年資料 M IC90為64 m g/L）。國(guó)外目前研究開(kāi)發(fā)的新酮內(nèi)酯類(lèi)藥物如solithro m ycin，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎支原體具有良好的抗微生物活性［23］，但仍需進(jìn)一步研究以明確臨床療效。

綜上所述，本研究根據(jù) C LSI新頒布的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程來(lái)進(jìn)行肺炎支原體藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，兒童患者中分離的肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率仍保持極高水平，耐藥株均存在核糖體23S rR N A A2063 G或 A2064 G核苷酸點(diǎn)突變。應(yīng)考慮開(kāi)發(fā)新型抗微生物藥物用于臨床治療大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥肺炎支原體感染的兒童患者。

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Antimicrobial susceptibility of theM ycoplasma pneumoniaestrains isolated from pediatric patients

Z H A N G H ong，Y EXinyu，X UXiaogang，W A N GMinggui，LIU Yang. （Shanghai Children′s H ospital，Shanghai JiaoTong U niversity，Shanghai 200040，China）

Objective To investigate the profile of antimicrobial susceptibility of theM ycoplasm a pneu moniae （M pn）strains isolated fro m pediatric patients with respiratory tract infection.M ethods A ntimicrobial susceptibility testing was conducted with a total of 112 M pn clinical strains by broth microdilution method.Sequence analysis of full 23S rR N A genes was performed for all M pn strains.Results O ne hundred and twelve M pn strains were isolated fro m January 2009 to M arch 2011. Of these clinicalisolates，98（87.5%）were resistant to erythro m ycin and azithro m ycin.All macrolide-resistant M pn strains harbored an A2063 G or A2064 G transition m utation in do main V of 23S rR N A genes.M pn isolates were still very susceptible to the tetracyclines and fluoroquinolones tested.Conclusions The M pn strains fro m pediatric patients are highly resistant to macrolides.The mechanism of macrolide resistance may be associated withthe transition m utation on 23S rR N A gene.

M ycoplasm a pneu moniae；macrolide；tetracyclines；quinolones；antimicrobial resistance

R375.2

A

1009-7708（2015）01-0063-04

2014-08-22

2014-10-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（81370047）；上海衛(wèi)生局（20124026）。

1.上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院。

張泓（1963—），女，碩士，主任技師，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

劉楊，E-mail：liuyang@fudan.edu.cn。