甲氧西林耐藥/敏感金黃色葡萄球菌基因分型和毒力基因檢測

王俊瑞， 杜小莉， 塔 拉， 崔晶花， 福 泉， 韓艷秋

·論著·

甲氧西林耐藥/敏感金黃色葡萄球菌基因分型和毒力基因檢測

王俊瑞1， 杜小莉2， 塔 拉1， 崔晶花2， 福 泉1， 韓艷秋1

目的 分析耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（金葡菌）（M RS A）和甲氧西林敏感金葡菌（M SS A）臨床分離株基因分型及毒力基因分布特征是否存在差異，了解金葡菌耐藥性演變與毒力變遷之間的相關(guān)性。方法 采用脈沖場凝膠電泳（PF G E）方法和多位點(diǎn)序列分型（M LST）方法對呼和浩特地區(qū)住院患者中分離的30株 M RS A和30株 M SS A進(jìn)行分子分型，同步采用聚合酶鏈反應(yīng)（PC R）方法檢測菌株毒力基因。結(jié)果 60株金葡菌PF G E分型共分19個型，M SS A菌株分布在I和H 型等16個基因型中，而 M RS A株主要集中分布在K和 M 2個基因型中。20株不同PF G E型菌株 M LST分型結(jié)果顯示，M RS A株主要為ST-239型；M SS A株呈多樣性分布特征，主要以ST-5型、ST-7型、ST-15型為主。毒力基因在M RS A和M SS A中分布差異顯著。M SS A毒力基因整體攜帶率明顯高于 M RS A（53.9%對40.0%，χ2=32.7，P＜0.01）。M RS A株sea、cna和cap8基因攜帶率明顯高于M SS A攜帶率（P＜0.01），而sec、seg、sei、sem、sen、seo、fnbB、ebpS、cap5基因攜帶率明顯低于 M SS A（P＜0.05）。結(jié)論 呼和浩特地區(qū)金葡菌臨床分離株基因型呈現(xiàn)多樣化分布特點(diǎn)，M RS A主要以ST-239型為主。M SS A毒力基因攜帶率高，特定毒力因子在M RS A和 M SS A株中呈現(xiàn)一定聚集分布特征，金葡菌特定耐藥性的獲得可能伴隨特定毒力特征的變化。

金黃色葡萄球菌； 耐藥性； 毒力基因； 分子分型

金黃色葡萄球菌（金葡菌），特別是耐甲氧西林金葡菌（M RS A）目前已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一。金葡菌通過釋放多種細(xì)胞外毒素，如腸毒素、溶血素、殺白細(xì)胞毒素等而表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力［1］。不同基因背景及來源金葡菌的毒力因子分布特征差異顯著［2-4］，且其表達(dá)特征明顯地受宿主等環(huán)境因素的影響［5-6］。 隨 著異質(zhì)性萬古 霉 素 中 介 金葡菌（h-VIS A）檢出率的增加以及萬古霉素耐藥株（V R S A）的出現(xiàn)，更嚴(yán)格防控金葡菌的感染及其耐藥性的產(chǎn)生成為當(dāng)前醫(yī)院感染防控的重要內(nèi)容。但耐藥性的增加與金葡菌毒力的關(guān)系見解不一［7-10］。本研究擬以內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)住院患者分離的60株M RS A和甲氧西林敏感金葡菌（M SS A）為研究對象，對不同耐藥表型菌株進(jìn)行分子分型并檢測其毒力基因分布特征，分析M R S A 和 M SS A 在基因型和毒力基因分布中的差異，為進(jìn)一步研究金葡菌耐藥性演變與毒力變遷之間的相關(guān)性提供參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)控菌株 2011年12月—2014年3月內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)60例住院患者（入院時(shí)間＞48 h）分離M RS A 30株和 M SS A 30株作為研究對象。其中，25株分離自傷口分泌物，14株分離自全血標(biāo)本，10株分離自膿液標(biāo)本，4株分離自咽拭子標(biāo)本，3株分離自痰液標(biāo)本，2株分離自尿液標(biāo)本，1株分離自胸腹水，1株分離自關(guān)節(jié)腔積液。所有金葡菌分離株均再次鑒定，并依據(jù)美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（C LSI）2013年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法確認(rèn)M R S A株。質(zhì)控菌株金葡菌（A T C C25923）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 VIT E K-Ⅱ全自動微生物分析系統(tǒng)及配套革蘭陽性菌鑒定卡 G P（法國生物梅里埃公司）、2720型PC R儀（A BI公司）、脈沖場凝膠電泳設(shè)備（美國Bio-Rad公司）。頭孢西丁藥敏紙 片購自 英國O X OID公司。溶葡萄 球菌素（lysostaphin）購自Sigma公司。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）master mix購 自 寶 生 物工 程（大連）有 限公 司。SeaKem Gold瓊脂糖（SK G）購自美國L O NZ A公司。PC R引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 脈沖場凝膠電泳（PF G E）分型 實(shí)驗(yàn)基本流程參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行?；具^程如下：標(biāo)準(zhǔn)菌株和試驗(yàn)菌株常規(guī)培養(yǎng)后配置一定濃度菌懸液，加入2μL溶葡萄球菌素（1 m g/m L）處理。等體積預(yù)熱的S K G與菌懸液混合，立即注入模具，室溫下靜置直至凝固為膠塊。膠塊中加入細(xì)胞裂解液混合液中進(jìn)行裂解。標(biāo)準(zhǔn)菌株膠塊及試驗(yàn)菌株膠塊分別置于含XbaI內(nèi)切酶緩沖液及S maI限制性內(nèi)切酶緩沖液中孵育。膠塊在PF G E儀中進(jìn)行電泳，條帶比對以沙門菌 H9812進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。膠塊間圖像比較采用BioNu merics（Version 5.1，Appl ied M aths，Inc）軟件進(jìn)行處理。采用1.5%條帶差異允許度。聚類分析采用U P G M A（組間非加權(quán)的幾何平均數(shù)）方法，D N A相關(guān)性采用 Dice系數(shù)計(jì)算。相似性系數(shù)90%以上認(rèn)為菌株間親緣關(guān)系較近，歸為一類。

1.2.2 多位點(diǎn)序列分型（M LS T） 根據(jù)文獻(xiàn)［12］介紹方法，隨機(jī)選取不同 PF G E 圖譜型 3、4 株M R S A菌株為代表株（共20株）進(jìn)行7個管家基因（arcC，aroE，glp F，g m k，pta，tpi，yqiL）序列測定。首先對各菌株純培養(yǎng)物進(jìn)行D N A提?。?xì)菌基因組D N A提取試劑盒，天根生化科技有限公司），利用各基因特異性引物進(jìn)行P C R擴(kuò)增，P C R產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行序列測定。P C R擴(kuò)增與序列測定使用同一對引物。測序結(jié)果在http：//saureus. mlst.net網(wǎng)站進(jìn)行序列比對，確定其S T型別并進(jìn)行親緣關(guān)系比對。

1.2.3 毒力因子檢測 每株菌純培養(yǎng)物采用細(xì)菌基因組D N A提取試劑盒提取 D N A，用表1所列毒力因子基因特異引物進(jìn)行P C R檢測。P C R產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并成像。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件對毒力因子分布差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。M R S A 和 M SS A 菌株間毒力因子攜帶率比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 毒力基因檢測PC R引物列表Table 1 Primers used in PC R detection of virulence genes

2 結(jié)果

2.1 菌株科室分布特征

60株金葡菌分離自不同住院科室。M R S A 主要分離自骨科（33.3%，10/30）、神經(jīng)外科（20.0%，6/30）、IC U（13.3%，4/30）和腎內(nèi)科（6.7%，2/30）；M SS A株主要分離自皮膚科（23.3%，7/30）、兒科（13.3%，4/30）、骨科（13.3%，4/30）、普通外科（13. 3%，4/30）。

2.2 分子分型結(jié)果

PF G E分型結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古不同地區(qū)分離金葡菌呈現(xiàn)多樣性的基因背景特征，按照90%相似度為判斷依據(jù)，60株菌共分19型。其中，優(yōu)勢型為I、K和M 型，分別占11.7%（7/60）、16.7%（10/60）和28.3（17/60）。M R S A 和 M SS A 菌株呈現(xiàn)明顯的基因分型特征。其中，M SS A株共分16型，優(yōu)勢型為I型（11.7%，7/60）和H 型（6.7%，4/60）；而M R S A集中分布在K 型（16.7%，10/60）和 M 型（28.3%，17/60），另外3株M R S A 散在分布于 G型（2株）和 H型（1株）。結(jié)果見圖1。

選擇PF G E各型菌株共20株進(jìn)行M LS T分型，其中M R S A 9株，M SS A 11株。20株中S T-5型3株（S8、S14、S75）、S T-7型2株（S2、S81）、S T-15型2株（S65、S91）、S T-45型1株（S3）、S T-59型1株（S10）、S T-121型1株（S69）、S T-188型1株（S7）、S T-239型為7株（S4、S9、S13、S68、S71、S72、S56）、S T-338型1株（S67）、S T-1964型1株（S6）。M R S A主要是S T-239型，M SS A主要以S T-5型、S T-7型、S T-15 型為主，其他型 別在 M R S A 和M SS A中交叉分布。聚類結(jié)果如圖1所示。

2.3 毒力基因分布特征

各類毒力因子在 M RSA和M SSA菌株中分布特征差異明顯，M SSA菌株各種毒力因子分布更為多樣化，M SSA 毒力因子整體攜帶率明顯高于M RSA（53.9%對40.0%，χ2=32.7，P＜0.01）。腸毒素基因中，sea基因總攜帶率最高（51.7%，31/60），攜帶率最低者為see基因（3.3%，1/30）。其他毒力基因中，luk-D E為85.0%（51/60），tst為6.7%（4/60），4株均為M SSA。M RSA株sea基因攜帶率明顯高于M SSA攜帶率（χ2=15.01，P＜0.01），而sec、seg、sei、sem、sen、seo基因攜帶率明顯低于M SSA（χ2=23.72，P＜0.01；χ2=7.92，P＜0.05；χ2=11.43，P＜0.01；χ2=9.32，P＜0.01；χ2=18.26，P＜0.01；χ2=11.59，P＜0.01；χ2=12.27，P＜0.01）。見表2。

結(jié)合PF G E分型，M R S A主要集中分布在K和M型（90.0%，27/30），是醫(yī)院感染 M R S A 的主要流行株，毒力基因分布如圖1所示。M SS A 優(yōu)勢型為 H和I型（36.7%，11/30），非優(yōu)勢型占60.0%（18/30），兩類菌株毒力基因分布特征見圖1。優(yōu)勢株腸毒素基因總攜帶率明顯高于非優(yōu)勢株（50.4%對25.8%，χ2=20.04，P＜0.01）。非優(yōu)勢株sec、sed基因攜帶率高于優(yōu)勢株（χ2=6.45，P＜0.05；χ2=4.97，P＜0.05），而優(yōu)勢株seg、lukD-E、tst、cap5基因攜帶率高于非優(yōu)勢株（χ2=15.10，P＜0.05；χ2=5.64，P＜0.05；χ2=7.59，P＜0.05；χ2=4.97，P＜0.05）。

圖1 60株金葡菌PF G E分型結(jié)果Figure 1 PF G E profile of 60 strains ofStaphylococcus aureus

3 討論

金葡菌的毒力因子主要是其產(chǎn)生的多種細(xì)胞外毒素，包括腸毒素、溶血素、殺白細(xì)胞毒素（lukD E、P V L）、毒性休克綜合征毒素（T SS T）等。這些毒力因子因其不同的生物學(xué)特性，證實(shí)具有不同的致病特 征［1，16-17］，體 現(xiàn) 在不同 克 隆株 間明 顯 的毒 力 差異［2-4］。金葡菌毒力 的差異不 僅體現(xiàn) 在菌株與 菌 株之間，更與細(xì)菌自身進(jìn)化及宿主因素的影響密切相關(guān)［18］。有學(xué)者認(rèn)為，苯唑西林耐藥性的獲得與金葡菌生物膜形成能力及毒力的降低密切相關(guān)［19］。但另有不同研究結(jié)果顯示，M R S A 與 M SS A 相比，前者具有更強(qiáng)的能力引起醫(yī)院感染及菌血癥［8］。因此，金葡菌耐藥性的變化與其毒力變化之間的相關(guān)性尚需進(jìn)一步證實(shí)。本研究選用內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)住院患者分離的60株金葡菌作為研究對象，對M R S A和M SS A之間毒力因子攜帶差異情況作進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)各種毒力因子呈現(xiàn)出多樣化的分布特征，特別是各種腸毒素。其中，M R S A株的sea基因攜帶率明顯高于M SS A株，其他腸毒素基因（sec、seg、sei、sem、sen、seo）的攜帶率則明顯低于M SS A株。針對腸毒力基因分布特征的不同報(bào)道，結(jié)果差異明顯。我國學(xué)者以全血標(biāo)本分離金葡菌進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，sea基因在M R S A株中攜帶率高于M SS A 株，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［20］。一項(xiàng)針對浙江和上海地區(qū)住院患者分離M R S A和M SS A的研究顯示，sea基因在 M RS A和 M SS A中攜帶率無顯著性差異［10］。在另一項(xiàng)相關(guān)研究中，M R S A 特征性的攜帶sec和tst-1基因，這些基因的聚集分布主要與編碼這些毒力基因的一些特定可移動基因序列有關(guān)，如編碼sec、sell和tst-1的Ⅰ型νSa4毒力島基因以及編碼seg、sei、selm、seln和selo的Ⅰ型νSaβ毒力島基因［21］。這些受試菌株主要是 S T-5-SC C mecⅡ型，而本研究所分析M R S A菌株主要為S T-239型。不同菌株來源及遺傳背景的差異可能是造成毒力因子分布差異明顯的主要原因之一。進(jìn)一步針對S T-239型 M R S A毒力因子攜帶特征的研究有待開展，以更加明確不同感染部位、不同地域環(huán)境分離株毒力因子分布的差異及與菌株耐藥性演變之間存在的相關(guān)性。

菌株的科室分布特征表現(xiàn)為 M R S A 主要集中在IC U、神經(jīng)外科和骨科病房，而且同一病房不同時(shí)間分離菌株呈現(xiàn)高度同源性；同時(shí)，骨科病房和普通外科病房金葡菌均分離自術(shù)后切口部位或膿液，這些科室患者因其易感性的增加，金葡菌在這些病房中更易傳播，感染防控措施應(yīng)更為加強(qiáng)。

我們同步采用PF G E對60株菌進(jìn)行了分子分型。結(jié)果顯示，基因型相近菌株呈現(xiàn)出相近的耐藥特征，如K型和M 型均為M R S A 菌株，而 H、I型及其他少見型菌株主要為 M SS A。研究中共檢測到4株T SS T陽性菌株，分別分離自傷口分泌物、膿液和全血標(biāo)本，且均為M SS A。值得注意的是，4株菌均歸屬于同一基因型I型菌株。這些結(jié)果提示，在不考慮菌株分離地域的情況下，依據(jù)PF G E分型結(jié)果可能初步預(yù)測相近菌株的一些生物學(xué)特性，特別是毒力特征。

總之，本研究表明呼和浩特地區(qū)醫(yī)院內(nèi)分離金葡菌基因分型呈多樣化特征，M R S A主要分布在K型和 M 型，而M SS A則分布在14個PF G E型中。毒力因子分布在 M R S A 和 M SS A 中差異顯著，M SS A毒力基因分布更為豐富，特定毒力因子在M R S A和M SS A株中呈現(xiàn)一定聚集分布特征。這些結(jié)果提示，金葡菌特定耐藥性的獲得可能相應(yīng)伴隨特定毒力特征的變化。關(guān)于金葡菌耐藥性演變與致病力變化之間的相關(guān)性值得進(jìn)一步研究，以更好指導(dǎo)臨床進(jìn)行金葡菌醫(yī)院感染防控和治療。

表2 M RS A和M SS A毒力基因攜帶情況比較Table 2 Co m parison between methicillin-resistant Staphylococcus aureusand methicillin-susceptible Staphylococcus aureusstrains in terms of the prevalence of virulence genes（n=30，%）

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Genotyping and detection of virulence genes for methicillin-resistant and-sensitive Staphylococcus aureus

W A N G Junrui，D UXiaoli，T ALa，C UI Jinghua，F(xiàn) UQuan，H A NYanqiu. （Department of Laboratory M edicine，A ffiliated H ospital of Inner M ongolia M edical U niversity，H ohhot 010050，China）

Objective To elucidate the difference between methicillin-resistantStaphylococcus aureus（M RS A）and methicillinsensitiveS.aureus（M SS A）in terms of genotypes and distribution of virulence genes with the clinical strains isolated fro m H ohhot，and explore the relationship between the changing resistance ofS.aureusand the virulence transition.M ethods Pulsed field gel electrophoresis（PF G E）and m ulti locus sequence typing（M LST）methods were em ployed to do m olecular typing for 30 M RS A strains and 30 M SS A strains isolated fro m inpatients in H ohhot，Inner M ongolia.PC R method was used to profile the distribution of virulence genes am ong these strains.Results PF G E typing results showed that 60S.aureusstrains were classified into 19 major types.M SS A strains belonged to 16 types，mainly types I and H.M RS A strains mainly belonged to types of K and M.A m ong the 20 strains with different PF G E types，M RS A strains were mainly identified as ST-239 type. M SS A strains showed diverse STs and the predo minant types were ST-5，ST-7 and ST-15.The profile of virulence genes was significantly different between M SS A strains and M RS A strains.The overall prevalence of virulence genes in M SS A strains was significantly higher than that in M RS A strains（53.9%versus 40.0%，χ2=32.7，P＜0.01）.The prevalence ofsea，cnaandcap8 geneswas significantly higher in M RS A strains than in M SS A strains（P＜0.01），but the prevalence ofsec，seg，sei，sem，sen，seo，fnbB，ebpSandcap5 was higher in M SS A strains than in M RS A strains（P＜0.05）.Conclusions The clinical strains ofS.aureusisolated fro mH ohhot showed diverse genotyping features.S T-239 was the major PF G E type of M RS A strains.The prevalence of virulence genes was higher in M SS A strains than in M RS A strains. Characteristic cluster is found for specific virulence genes.The results also suggestthat acquisition of specific antibiotic resistance may be associated with change of specific virulence feature inS.aureus.

Staphylococcus aureus；antibiotic resistance；virulence gene；m olecular typing

R378.11

A

1009-7708（2015）01-0070-06

2014-05-28

2014-07-21

國家自然科學(xué)基金（81260244）。

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，呼和浩特010050；2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。

王俊瑞（1981—），男，博士，主治醫(yī)師，主要從事金黃色葡萄球菌感染致病機(jī)制研究。

韓艷秋，E-mail：qyh1016@sina.co m。