臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌同源性分析及常見耐藥基因檢測

孫 晴， 張正銀

·論著·

臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌同源性分析及常見耐藥基因檢測

孫 晴， 張正銀

目的 了解上海市同仁醫(yī)院臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的基因同源性及耐藥機(jī)制，為廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的防治提供依據(jù)。方法 采用腸桿菌科基因間重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（E RIC-PC R）對臨床分離的28株廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子生物學(xué)分型，采用PC R方法檢測9種常見β內(nèi)酰胺酶基因：blaK PC、blaI M P、blaVI M、blaN D M-1、blaO X A-23、blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-51和blaO X A-58；膜孔蛋白基因CarO；插入序列IS Aba1；以及IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58的連鎖檢測。結(jié)果 28株臨床分離的廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌大多來自危重患者呼吸道標(biāo)本，E RIC-PC R基因分型提示為同一來源克隆株；所有菌株均攜帶blaO X A-23、blaO X A-51基因，未檢測出 B類β內(nèi)酰胺酶基因，以及blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-58等基因；膜孔蛋白基因CarO和插入序列IS Aba1檢測均為陽性，IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58連鎖檢測均未擴(kuò)增到預(yù)期條帶。結(jié)論 研究期間臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為同一克隆株，且攜帶相同耐藥基因，提示存在克隆傳播。

廣泛耐藥； 鮑曼不動(dòng)桿菌； 同源性； 耐藥基因

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter bau m annii）在環(huán)境中廣泛存在，因其具有極強(qiáng)的生存、黏附以及獲得外源性耐藥基因的能力，成為醫(yī)院感染常見的機(jī)會(huì)致病菌。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，以及機(jī)械通氣和介入治療等侵襲性操作應(yīng)用，鮑曼不動(dòng)桿菌成為我院臨床分離率最高的不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，與上海地區(qū)耐藥監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)相符［1］。我院統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2011至2013年廣 泛耐 藥鮑曼不動(dòng)桿菌（X D R A B）的檢出率不斷上升，分別為5.1%（17株/336株）、6.7%（19株/282株）和14.5%（31株/214株）?？梢?，該菌的醫(yī)院感染問題日益嚴(yán)重。為了解我院X D R A B分子流行病學(xué)及部分常見耐藥基因型特征，本研究對臨床非重復(fù)分離的28株 X D R A B進(jìn)行基因同源性及部分常見耐藥基因的檢測分析，以期發(fā)現(xiàn)X D R A B傳播以及產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2013年2—10月我院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌167株（剔除同一患者中分離的重復(fù)菌株）。

1.1.2 主要試劑 鮑曼不動(dòng)桿菌鑒定板條 G N及藥敏板條G N13為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。藥敏紙片為英國O X OID公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 A T C C 25922、A T C C 35218，銅綠假單胞菌A T C C 27853。檢測用PC R試劑（Reco m binant Taq D N A Poly merase）為寶生物（大連）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用 VIT E K2 Compact系統(tǒng)對病原菌進(jìn)行鑒定及最低抑菌濃度（MIC）測定，采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）測定抑菌圈直徑，并根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2012年M 100-S22標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌耐藥性，測試抗菌藥物為哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑、米諾環(huán)素和多黏菌素B，共17種。1.2.2 細(xì)菌D N A 模板制備 挑取1～2個(gè)菌落，加入0.5 m L T E（10 m m ol/L Tris-H Cl，1 m m ol/L E D T A p H 8.0）中混勻，100℃水浴10 min，5 000 g離心5 min取上清液備用。

1.2.3 耐藥基因檢測 各類β內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測引物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道序列合成［2-4］，CarO 基因檢測引物根據(jù)GenBank公布序列自行設(shè)計(jì)，見表1。PCR反應(yīng)體系總體積均為50μL，其中D N A 模板5μL，10×PC R buffer 5μL，dN TPs（各2.5 m mol/L）4μL，引物（20μmol/L）0.5μL，Taq酶（5 u/μL）0.25μL，最后dd H2O補(bǔ)充至50μL；反應(yīng)參數(shù)均為94℃ 預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)94℃25 s，52℃40 s，72℃50 s共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。IS Aba1F分別與O X A23R、O X A51R 組 合 擴(kuò) 增 IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58連鎖檢測，擴(kuò)增循環(huán)的延伸時(shí)間為4 min。擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送上海邁普生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對。

表1 PC R引物序列Table 1 Primer sequences used in PC R

2 結(jié)果

2.1 菌株來源和分布

2.1.1 標(biāo)本種類來源 167株鮑曼不動(dòng)桿菌中有28株對除多黏菌素B外的臨床常用16種抗菌藥物均耐 藥，廣泛耐 藥 株檢 出率 為 16.8%。28 株X D R A B大多分離自呼吸道標(biāo)本，見表2。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床標(biāo)本來源分布Table 2 Distribution ofAcinetobacter bau m annii isolates by clinical specimen

2.1.2 科室分布 28株X D R A B來源為急診重癥監(jiān)護(hù)病房（IC U）15株，神經(jīng)外科6株，消化內(nèi)科3株，呼吸科2株，神經(jīng)內(nèi)科1株，心內(nèi)科1株。

2.2 基因檢測結(jié)果

28株X D R A B的E RIC-P C R基因分型結(jié)果顯示均為同一克隆株，均未檢測出 A類β內(nèi)酰胺酶K PC 基因 和B 類 β內(nèi) 酰胺 酶基 因I M P、VI M、N D M-1，均攜帶有blaO X A-23、blaO X A-51基因，未檢測出blaO X A-24、blaO X A-48、blaO X A-58基因，插入序列IS Aba1及膜孔蛋白基因CarO檢測均為陽性，IS Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58連鎖檢測均未擴(kuò)增到預(yù)期條帶。

3 討論

近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌因其不斷升高的耐藥率以及醫(yī)院感染的高發(fā)率被稱為“革蘭陰性菌中的M RS A”。在分子流行病學(xué)研究中，脈沖場凝膠電泳（PF G E）是細(xì)菌分子生物學(xué)分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其設(shè)備價(jià)格昂貴、試驗(yàn)周期長、操作技術(shù)要求高。本研究采用的E RIC-PC R是一種成本低、操作簡便快速、分 辨 效果 較好、可 重復(fù) 性好 的方 法，且與PF G E 結(jié)果 一致性 高［5］。本次 28 株 X D R A B 的E RIC-P C R基因分型結(jié)果顯示條帶一致，提示為同一克隆株。

本研究收集臨床分離的28株 X D R A B主要來源于急診IC U 以及神經(jīng)外科，其他科室為散在分布。標(biāo)本來源以呼吸道為主，提示感染部位多發(fā)生在下呼吸道。本組82%患者為60歲以上老年人，免疫功能低下，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)這些急診IC U 和神經(jīng)外科患者均有氣管插管、機(jī)械通氣史，這可能是造成克隆株傳播、流行的主要原因，與厲世笑等［6］的報(bào)道相似。另外發(fā)現(xiàn)，急診IC U和神經(jīng)外科的部分床位短期內(nèi)2次先后從不同患者標(biāo)本中分離出 X D R A B，提示患者出院后“終末消毒”可能不夠徹底，未能完全殺滅X D R A B。

鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶主要為blaO X A-23、blaO X A-24、blaO X A-51和blaO X A-58型 等 D 類酶［7］。 本組X D R A B 全部 攜帶 有blaO X A-23，blaO X A-51 基 因，均 未 檢 測 出blaO X A-24、blaO X A-48、 blaO X A-58。 攜 帶blaO X A-23基因是國內(nèi)報(bào)道鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的主要機(jī)制，而blaO X A-51常為鮑曼不動(dòng)桿菌天然攜帶［8］。膜孔蛋白CarO的缺失也與耐碳青霉烯類藥物具有相關(guān)性［9］。而本組菌株均無CarO 基因缺失，故對碳青霉烯類耐藥與膜孔蛋白基因缺失無關(guān)，但不能排除基因表達(dá)降低或是突變引起的耐藥性增加。插入序列是最為簡單的轉(zhuǎn)座子，可攜帶傳遞β內(nèi)酰胺酶基因、氨基糖苷類修飾酶基因、16SrR N A甲基化酶基因、喹諾酮作用靶位保護(hù)蛋白基因、外排泵基因等耐藥基因［10］。甚至IS Aba1插入CarO 基因，致膜孔蛋白CarO基因失活對碳青霉烯類藥物耐藥［11］。IS Aba1作為一種鮑曼不動(dòng)桿菌特有的插入序列，常伴隨blaO X A-23、blaO X A-51出現(xiàn)，并為其基因表達(dá)提供強(qiáng)啟動(dòng)子［12］。本研究分離 X D R A B菌株均 檢測 出插 入序 列IS Aba1，但I(xiàn)S Aba1-O X A23、IS Aba1-O X A58的連鎖檢測并未擴(kuò)增到預(yù)期條帶，提示兩者不是直接連鎖，但并不能除外間接相鄰，可能與其他耐藥性的形成具有一定相關(guān)性。

總之，E RIC-P C R基因分型以及耐藥基因的檢測結(jié)果均顯示，我院分離的28株X D R A B具有高度的相似性，親緣關(guān)系緊密，為同一克隆株，提示我院存在 X D R A B 的 克隆傳 播，且 攜 帶blaO X A-23、blaO X A-51基因是引起其高耐碳青霉烯類藥物的主要原因之一。臨床上醫(yī)務(wù)人員必須嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作以及環(huán)境的消毒，加強(qiáng)對感染或定植患者的監(jiān)測及隔離，避免在醫(yī)院內(nèi)的進(jìn)一步傳播。此外，在治療各種感染時(shí)，盡量參考藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥監(jiān)測，及時(shí)報(bào)告耐藥表型，定期對監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行總結(jié)并通報(bào)臨床，以便臨床醫(yī)師和感染防控人員采取及時(shí)、有效的干預(yù)措施，以減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與傳播。

［1］ 朱德妹，楊洋，蔣曉飛，等.2011年上海地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國感染與化療雜志，2012，12（6）：401-411.

［2］ M ussi M A，Limansky AS，Viale A M.Acquisition of resistance to carbapenems in m ultidrug-resistant clinical strains of Acinetobacter bau m annii：naturalinsertionalinactivation of a gene encoding a mem ber of a novelfamily of beta-barrel outer mem brane proteins［J］.A ntimicrob A gents Chem other，2005，49（4）：1432-1440.

［3］ T urton JF，W ard M E，W oodford N，et al.T he role of IS Aba1 in expression of O X A carbapenemase genes in Acinetobacter bau m annii［J］.FE M SMicrobiol Lett，2006，258（1）：72-77.

［4］ Poirel L，W alsh T R，Cuvillier V，et al.M ultiplex P C R for detection of acquired carbapenemase genes［J］. Diagn Microbiol Infect Dis，2011，70（1）：119-123.

［5］ 孫晶，常軍霞，劉巍.E RIC-P C R與PF G E檢測銅綠假單胞菌同源性的方法學(xué)比較［J］.中國抗生素雜志，2013，38（4）：297-302.

［6］ 厲世笑，余素飛，黃林瑤.耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌 O X A基因檢測及同源性分析［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（3）：332-334.

［7］ 周翠，吳慶，吳蓮鳳，等.鮑曼不動(dòng)桿菌O X A-23基因和IS Aba1基因檢測和耐藥性關(guān)系［J］.疾病監(jiān)測，2013，28（7）：583-586.

［8］ 鐘敏，黃文芳.耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)O X A酶的研究進(jìn)展［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（1）：122-125.

［9］ Siroy A，M olle V，Lemaitre-Gui ll ier C，et al.Channelformation by CarO，the carbapenem resistance-associated outer mem brane protein ofAcinetobacter bau m annii［J］.A ntimicrob Agents Chem other，2005，49（12）：4876-4883.

［10］ 褚少朋，汪桂華，王旭東，等.泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶及膜孔蛋白編碼基因與ISaba1-O X A23連鎖檢測［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（24）：5441-5444.

［11］ Peleg A Y，Seifert H，Paterson D L.Acinetobacter bau m annii：emergence of a successful pathogen［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21（3）：538-582.

［12］ H e C，Xie Y，Zhang L，et al.Increasing imipenem resistance and dissemination of theIS Abal-associatedblaO X A-23 gene am ongAcinetobacter bau m anniiisolates in an intensive care unit［J］.J M ed Microbiol，2011，60（Pt 3）：337-341.

Analysis of the genetic homology and resistant genes in clinical isolates of extensively drug-resistantAcinetobacter baumannii

S U N Qing，Z H A N G Zhengyin. （Department of Laboratory M edicine，Tong Ren H ospital，Shanghai 200336，China）

Objective To investigate the genetic ho m ology in clinical isolates of extensively drug-resistantAcinetobacter bau m annii（X D R A B），so as to provide evidence for better controlling hospitalinfections.M ethods The genotypes of 28 clinical X D R A B isolates were determined by Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PC R （E RIC-PC R）.PC R was conducted to analyze 9 types ofβ-lactamase genes（blaK PC，blaI M P，blaVI M，blaN D M-1，blaO X A-23，blaO X A-24，blaO X A-48，blaO X A-51 andblaO X A-58），the outer mem brane porin gene（CarO）and insertion sequence（IS）IS Aba1.W e also carried out linkage analysis forIS Aba1-O X A23 andIS Aba1-O X A58.Results M ost of the above 28 X D R A B strains were isolated fro m respiratory tract specimens fro m intensive care patients.The result of E RIC-PC R showed that there was high ho m ology between all the strains，suggesting that they might derive fro m the same clone.The genesblaO X A-23，blaO X A-51，CarOand the ISIS Aba1 except Class Bβ-lactamase genes，blaO X A-24，blaO X A-48，blaO X A-58，IS Aba1-O X A23 andIS Aba1-O X A58 were detected in all the clinical strains by PC R.Conclusions All the X D R A B isolates belong to the same clone and carry the same drug-resistant genes，indicating that there was clone spread am ong X D R A B isolates.

extensively drug-resistant；Acinetobacter bau m annii；ho m ology；drug-resistant gene

R378

A

1009-7708（2015）01-0028-04

2014-03-11

2014-06-27

上海市同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200336。

孫晴（1979—），女，主管技師，主要從事微生物檢驗(yàn)和細(xì)菌耐藥性研究。

張正銀，E-mail：zhangzy08@163.co m。