膠體金免疫層析法對呼吸道合胞病毒抗原快速檢測結(jié)果分析

伊 潔， 肖 艷， 劉亞昆， 徐英春

·論著·

膠體金免疫層析法對呼吸道合胞病毒抗原快速檢測結(jié)果分析

伊 潔1， 肖 艷2， 劉亞昆3， 徐英春1

目的 分析膠體金免疫層析法對呼吸道合胞病毒（RS V）抗原快速檢測的靈敏度和特異度。方法 用 RS V抗原檢測試劑盒（膠體金免疫層析法）對197例疑似 RS V感染患者的鼻咽抽吸物或鼻咽拭子標(biāo)本進行檢測，以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（R T-PC R）核酸檢測結(jié)果為參考，比較膠體金免疫層析法對不同類型標(biāo)本和不同年齡組患者的靈敏度。結(jié)果 197例患者標(biāo)本中經(jīng)R T-PC R檢測，95例（48.2%）為陽性。以R T-PC R核酸檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，膠體金免疫層析法的靈敏度和特異度分別是34.7%和100%。該方法對鼻咽抽吸物的陽性檢出率較鼻咽拭子高（36.2%對8.6%，P＜0.01），鼻咽抽吸物標(biāo)本的靈敏度明顯高于鼻咽拭子（22.1%對12.6%）。RS V檢出率與年齡呈負相關(guān)（P＜0.01），1歲以下患兒的陽性檢出率最高（29.5%），而在＞5歲患兒中陽性檢出率為0。結(jié)論 膠體金免疫層析法對1歲以下幼兒的鼻咽抽吸物中的 RS V有較好檢測效果，可輔助臨床進行早期篩查。但鑒于該方法靈敏度較低，且適用于5歲以下兒童，臨床上還需用 R T-PC R對 RS V 進行確認和補充檢測，以免漏診。

呼吸道合胞病毒； 抗原快速檢測； 膠體金免疫層析法； 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RS V）是嬰幼兒急性下呼吸道感染的重要病原體之一，可引起嬰幼兒尤其是新生兒較高的病死率［1］?？焖贆z測RS V對疾病的及時診斷和預(yù)防醫(yī)院感染有著非常重要的作用。目前針對 R S V的檢測方法主要有病毒培養(yǎng)、抗原檢測、病毒核酸擴增和免疫熒光等方法［2］，其中核酸擴增方法有較高的靈敏度，日漸成為 RS V 檢測的主要方法之一［3-4］。核酸檢測陽性并不能確證病原體的感染，而抗原的檢出有助于確證病原的感染，但其靈敏度和特異度尚待評估。本研究以核酸檢測結(jié)果為參考，對一種以R S V抗原檢測為基礎(chǔ)的膠體金免疫層析法試劑盒的靈敏度和特異度進行評估，為臨床RS V的早期快速篩查提供可參考的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 研究對象由3部分組成。第1部分來自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所2012年1—7月保存的59例患者標(biāo)本，其中34份為2012年1—7月采集的診斷為肺炎的住院患兒鼻咽抽吸物標(biāo)本，患兒平均年齡為7個月，其中27份為男性患兒標(biāo)本，7份為女性患兒標(biāo)本。剩余25份為2012年1—2月采集的診斷為上呼吸道感染的成人患者的鼻咽拭子標(biāo)本，患者平均年齡36歲，其中12份為男性患者標(biāo)本，13份為女性患者標(biāo)本。第2部分來自于北京協(xié)和醫(yī)院于2012年9月—2013年12月采集的61例診斷為肺炎的住院患者的鼻咽拭子標(biāo)本，包括46例患兒和15例成人患者?；純浩骄挲g為20個月，其中25份為男性患兒標(biāo)本，21份為女性患兒標(biāo)本。成人患者的平均年齡為55歲，其中男性患者的標(biāo)本為8份，女性患者的標(biāo)本為7份。第3部分為北京市大興婦幼保健院于2013年12月采集的77例診斷為上呼吸道感染的門診患兒標(biāo)本，包括57份鼻咽拭子標(biāo)本和20份鼻咽抽吸物標(biāo)本?；純浩骄挲g為27.1個月，其中男性患兒標(biāo)本為41份，女性患兒標(biāo)本為36份。采集的標(biāo)本均置于3 m L病毒保存液的專用標(biāo)本管中保存。

1.1.2 主要試劑 核酸提取試劑盒為 QIA G E N公司產(chǎn)品（QIAa m p MinElute Virus Spin Kit，Cat. 57704，德國）；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（R T-PC R）采用SuperScript. Ⅲ First-Strand Synthesis System（Invitrogen，Cat.18080-051，美 國）試劑；Binax N O WR S V試劑盒為美國Binax N O W 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Binax N O WR S V檢測 按照檢測說明書進行操作，新采集的標(biāo)本直接滴到試紙條上進行檢測，凍存的標(biāo)本解凍后直接滴到試紙條上進行檢測，等待15 min即可觀察結(jié)果，當(dāng)試紙條判定部 T、C處都確認有條帶時，結(jié)果判為陽性。同時將檢測余下的標(biāo)本分裝后于-80℃低溫冰箱保存，集中進行核酸檢測。

1.2.2 R S V核酸檢測 采用一步法R T-PC R方法進行 R S V核酸的檢測［5］，P C R產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性產(chǎn)物進行測序驗證。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，膠體金免疫層析試劑盒與R T-PCR的檢測結(jié)果比較采用一致性檢驗；該試劑盒對不同類型標(biāo)本的靈敏度用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；檢測結(jié)果與年齡的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠體金免疫層析法檢測與 R T-P C R核酸檢測的比較

197例疑似R S V的鼻咽拭子和鼻咽抽吸物標(biāo)本，經(jīng) R T-P C R 核 酸檢測確認R S V 陽性 95 例（48.2%），陰性102例（51.8%）。膠體金免疫層析法檢測陽性33例（16.8%），陰性164例（83.2%）。以R S V R T-P C R核酸檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，膠體金免疫層析法總體靈敏度為34.7%，特異度100%，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為62.2%。膠體金免疫層析法檢測與 R T-P C R核酸檢測結(jié)果的一致率Pa值為68.5%，在檢測結(jié)果無關(guān)聯(lián)的假定下，期望一致率Pe值為53.9%，Kappa值為0.315，見表1。

表1 膠體金免疫層析法與 R T-PC R核酸檢測結(jié)果的比較Table 1 Performance of colloidal gold im m unochro matography assay co m pared to R T-PC R for detection of respiratory syncytial virus

2.2 膠體金免疫層析法對不同類型標(biāo)本靈敏度檢測的結(jié)果比較

RS V抗原檢測試劑盒提示可以檢測鼻咽抽吸物和鼻咽拭子2種類型標(biāo)本。采集的58例鼻咽抽吸物標(biāo)本，經(jīng)膠體金免疫層析法檢測陽性21例（36.2%），陰性37例（63.8%）。139例鼻咽拭子標(biāo)本中，經(jīng)膠體金免疫層析法檢測陽性12例（8.6%），陰性127例（91.4%），鼻咽抽吸物與鼻咽拭子陽性檢測率具有明顯差異（χ2=22.31，P＜0.01）。以R T-PC R核酸檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，膠體金免疫層析法檢測鼻咽抽吸物標(biāo)本的靈敏度為22.1%，鼻咽拭子標(biāo)本的靈敏度為12.6%，膠體金免疫層析法檢測對鼻咽抽吸物的靈敏度明顯高于鼻咽拭子。

2.3 膠體金免疫層析法對不同年齡組標(biāo)本的檢測結(jié)果比較

根據(jù)患者的年齡將197例標(biāo)本分為0～＜1歲組78例，1～＜3歲組44例，3～＜5歲25例，≥5歲50例。膠體金免疫層析法的陽性率分別是29.5%，20.5%，4.0%和0，見表2。該方法的陽性率與患者的年齡呈負相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.33，P＜0.01），且 為線性關(guān) 系 （R2= 0.9479），見圖1。

表2 膠體金免疫層析法對不同年齡組標(biāo)本的檢測結(jié)果Table 2 Performance of colloidal gold im m unochro matography assay in detection of respiratory syncytial virus by age group

圖1 膠體金免疫層析法的陽性率與患者年齡大小呈線性關(guān)系Figure 1 Linear relationship between the positive rate of colloidal gold im m unochro matography assay and age of patients

3 討論

膠體金免疫層析法是檢測鼻咽抽吸物和鼻咽拭子樣本中 R S V 融合蛋白抗原的膜免疫層析試驗。標(biāo)本中存在的R S V抗原與試紙條硝酸纖維素膜上的抗R S V抗體結(jié)合物結(jié)合，形成的抗原結(jié)合復(fù)合物被固定的抗R S V抗體捕獲，形成可視的樣本線。由于其快速、方便操作等特點，膠體金免疫層析法已經(jīng)在門急診被廣泛地用于多種病毒的檢測。陽性結(jié)果對于快速診斷疾病，避免不必要的使用抗菌藥物等都有極大的幫助［6-8］。但是抗原檢測結(jié)果受很多因素的限制，包括靈敏度和特異度、被檢測患者的年齡、標(biāo)本的類型、疾病的流行狀況等。有國外文獻報道，膠體金免疫層析法檢測 R S V 的靈敏度為74%～89%［9-11］。本研究以P C R 核酸檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，膠體金免疫層析法的靈敏度為34.7%，與P C R檢測一致性較差（Kappa＜0.4），說明該方法的靈敏度存在一定的局限性。

本研究中膠體金免疫層析法的靈敏度低于文獻報道的原因可能有：①采集標(biāo)本中有鼻咽拭子和鼻洗液，而文獻研究以鼻洗液或鼻咽吸取物為主［12-13］。本研究對2種類型標(biāo)本的靈敏度進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻洗液的靈敏度明顯高于鼻咽拭子（36.2%對8.6%，P＜0.01），而197例標(biāo)本中鼻咽拭子標(biāo)本占了70%，可能是導(dǎo)致膠體金免疫層析法靈敏度較低的一個原因；②采集的標(biāo)本患者的年齡從0～80歲，而 Mierny等［12］報道的采集標(biāo)本患兒的平均年齡為9.3～12.9個月，因此將患者分成為0～＜1歲，1～＜3歲，3～＜5歲和≥5歲4組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，膠體金免疫層析法的陽性率有所降低，即該方法的陽性率與患兒的年齡呈負相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.33，P＜0.01），且為線性關(guān)系（R2=0.948）。

盡管膠體金免疫層析法的靈敏度較低，但其特異度為100%，與國外報道的97%～100%［11-13］結(jié)果基本一致。該方法陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為62.2%，因此當(dāng)該試劑盒檢測為陽性時，基本可以確定為RS V感染，而檢測為陰性時則需要進一步確認，例如用R T-PC R或者病毒培養(yǎng)來排除假陰性。膠體金免疫層析法適用于新生兒或5歲以下兒童呼吸道合胞病毒感染的體外診斷，不適用于成人，這可能成為該方法廣泛應(yīng)用的一個限制性因素。

免疫層析技術(shù)與臨床常用的直接免疫熒光法有很好的符合率［14］。本研究結(jié)果表明，盡管膠體金免疫層析法的靈敏度有一定的局限性，但是其在1歲以下幼兒的鼻洗液中較高時仍有較好的檢測效果，該方法操作簡便，需時較短，不需要特殊的儀器設(shè)備，易被門急診及基層醫(yī)院所接受，可用于早期新生兒及兒童RS V感染的輔助診斷。

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Performance of colloidal gold im m unochromatography assay in rapid detection of respiratory syncytial virus antigen

YI Jie，XIA O Yan，LIU Yakun，X U Yingchun. （Department of Laboratory M edicine，Peking U nion M edical College H ospital，Beijing 100730，China）

Objective To investigate the sensitivity and specificity of colloidal gold im m unochro matography assay in rapid detection of respiratory syncytial virus （RS V）antigen.M ethods A total of 197 nasal-pharyngeal swabs （N Ps）or nasalpharyngeal aspirates （N P As） obtained fro m patients were tested by RS V assay kits，i.e.， colloidal gold im m unochro matography assay.The results determined by reverse-transcription poly merase chain reaction （R T-PC R）were taken as reference.Co m pared to the results of R T-PC R，the sensitivity of the kit was different w hen testing different types of specimens or specimensobtained fro m patients of different ages.Results A total of 95（48.2%）sam ples were positive for RS V tested by R T-PC R.The sensitivity and specificity of colloidal gold im m unochro matography assay were 34.7% and 100%，respectively co m pared with R T-PC R results.The positive rate of the assay was higher in testing N P As than N Ps（36.2%vs 8.6%，P ＜0.01），w hich was the same in the sensitivity （22.1% vs 12.6%）.The positive rate of colloidal gold im m unochro matography assay showed negative correlation with the age of patients（P＜0.01），w hich was highest in children less than one-year old（29.5%）but zero in patients m ore than five-year old.Conclusions The colloidal gold im m unochro matography assay is effective in early detection of RS V fro m N P As in children less than one-year old.It can be used in early diagnosis for children infected with RS V. Since colloidal gold im m unochro matography assay has so me limitations，and itis only suitable for the children under five-year old，R T-PC R method should be used for RS V detection in clinical practice to avoid missed diagnosis.

respiratory syncytial virus；rapid antigen test；colloidal gold im m unochro matography assay；reverse transcription poly merase chain reaction

R373

A

1009-7708（2015）01-0024-04

2014-02-27

2014-06-16

國家科技重大專項課題（2012Z X10004-206）。

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)

中心，北京 100730；

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所；3.北京市大興區(qū)婦幼保健院。

伊潔（1983—），女，博士，研究實習(xí)員，主要從事病原微生物及腫瘤分子診斷。

徐英春，E-mail：xycpu mch@aliyun.co m。