2009—2013年血液標本病原菌耐藥性監(jiān)測

周碧云， 朱旭慧， 陳中舉， 田 磊， 閆少珍， 孫自鏞

·論著·

2009—2013年血液標本病原菌耐藥性監(jiān)測

周碧云， 朱旭慧*， 陳中舉*， 田 磊*， 閆少珍*， 孫自鏞*

目的 了解2009—2013年武漢同濟醫(yī)院血液標本病原菌的構(gòu)成、病原譜的變化及其對常用抗菌藥物的耐藥情況。方法 病原菌按照常規(guī)方法進行鑒定和藥敏試驗。布魯菌屬進行PC R擴增和測序。結(jié)果 共分離病原菌2 152株（不包括凝固酶陰性葡萄球菌），其中革蘭陽性菌761株，占35.4%，革蘭陰性菌1 242株，占57.7%。真菌149株，占6.9%。最常見的革蘭陽性菌為金黃色葡萄球菌（金葡菌）、屎腸球菌和糞腸球菌；革蘭陰性菌為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和布魯菌屬。2009年首次分離出1株羊布魯菌，但2013年增加到50株（其中1株為豬布魯菌），占當年血液標本分離菌的7.1%。耐甲氧西林金葡菌（M RS A）檢出率為54.1%，未檢出對萬古霉素和利奈唑胺耐藥的葡萄球菌。糞腸球菌對氨芐西林和左氧氟沙星耐藥率較低，在30%以下；屎腸球菌除糖肽類和利奈唑胺外，對其余抗菌藥物的耐藥率均在70%以上；大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、頭孢西丁和頭孢哌酮-舒巴坦耐藥率在15%以下。出現(xiàn)了對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌（C R E），以陰溝腸桿菌多見。銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物保持了較高的敏感性，但鮑曼不動桿菌耐藥現(xiàn)象嚴重，除頭孢哌酮-舒巴坦外，對其余抗菌藥物的耐藥率均在60%以上。結(jié)論 大腸埃希菌和金葡菌仍是血流感染中最常見病原菌，布魯菌屬檢出率逐年增高，應引起重視。此外，血液標本病原菌對常用抗菌藥物有不同程度的耐藥性，應根據(jù)藥敏試驗結(jié)果合理選用抗菌藥物。

血液標本； 耐藥性； 監(jiān)測

血流感染是臨床上常見的重癥感染性疾病，隨著創(chuàng)傷性治療技術(shù)的廣泛開展、免疫缺陷人群的出現(xiàn)及抗菌藥物的廣泛使用，發(fā)病率呈逐年增高的趨勢［1］。注意無菌操作、早期發(fā)現(xiàn)病原菌、及時正確地使用抗菌藥物對患者的治療和預后起著至關(guān)重要的作用。本研究總結(jié)了近5年華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院血流感染的病原菌構(gòu)成及耐藥情況，并分析病原譜的變化，為血流感染患者的經(jīng)驗治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2009年1月1日—2013年12月31日我院血培養(yǎng)分離出的病原菌，剔除同一患者相同部位的重復分離菌株。

1.1.2 儀器和試劑 BacT/Alert 3D和B A C T E C 9240血培養(yǎng)儀分別購自法國生物梅里埃公司和美國B E C T O N DIC KIN S O N 公司。A PI和 VIT E K2 Co m pact細菌鑒定系統(tǒng)為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品?？咕幬锩舾行栽囼灱埰透鞣N培養(yǎng)基為英國O X OID公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離鑒定和藥敏試驗 細菌分離與鑒定按全國臨床檢驗操作規(guī)程進行［2］，所有菌株（除外布魯菌屬）均采用自動化細菌鑒定儀 VIT E K2 Co m pact或A PI鑒定系統(tǒng)以及結(jié)合手工生化結(jié)果進行菌種鑒定。肺炎鏈球菌對青霉素和頭孢曲松以及金黃色葡萄球菌（金葡菌）對萬古霉素的敏感性采用E試驗法檢測，其余抗菌藥物敏感性試驗采用紙片擴散法，若出現(xiàn)糖肽類和碳青霉烯類耐藥，則用E試驗法進行確認。

1.2.2 布魯菌屬的檢測

1.2.2.1 寬范圍PC R擴增 參照文獻設計引物并進行PC R擴增［3］，引物由上海英駿公司合成。

1.2.2.2 測序 PC R產(chǎn)物送至上海英駿公司進行測序，結(jié)果與B L A S T比對。

1.2.3 質(zhì)控菌株

1.2.3.1 生化鑒定儀質(zhì)控菌株 G N鑒定板-嗜麥芽窄食單胞菌A T C C 17666，G P鑒定板-酪黃腸球菌 A T C C 700324，A PI 20C-白 念 珠 菌 A T C C 90028，每月1次。

1.2.3.2 藥敏質(zhì)控菌株 金葡菌 A T C C 25923（紙片法）、A T C C 29213（E試驗法）、大腸埃希菌A T C C 25922、A T C C 35218、肺炎克雷伯菌A T C C 700603、銅綠假單胞菌 A T C C 27853、肺炎鏈球菌A T C C 49619和白念珠菌A T C C 90028。藥敏試驗結(jié)果參照C LSI 2012年標準。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均使用W H O N E T 5.6軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 細菌構(gòu)成

共分離出病原菌2 152株（不包括凝固酶陰性葡萄球菌），其中革蘭陽性菌761株，占35.4%；革蘭陰性菌1 242株，占57.7%；真菌149株，占6.9%。5年中，革蘭陽性菌分離率為33%～36%，革蘭陰性菌分離率為53%～60%，變化不明顯。但布魯菌檢出率逐年增高，2009年我院首次分離出1株羊布魯菌，但2013年分離出50株（其中1株為豬布魯菌），占當年分離菌的7.1%。見表1。最常見的病原菌依次為大腸埃希菌、金葡菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和糞腸球菌?？琉B(yǎng)菌檢出率不高，主要是肺炎鏈球菌34株（1.6%），流感嗜血桿菌1株，β溶血鏈球菌13株（0.6%）。

表1 2009—2013年血流感染主要病原菌構(gòu)成Table 1 Species distribution of the microorganisms isolated fro m blood specimens［n（%）］

2.2 細菌耐藥性分析

2.2.1 葡萄球菌屬 耐甲氧西林金葡菌（M RS A）的檢出率為54.1%。M R S A對甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑耐藥率較低，為1.3%。甲氧西林敏感金葡菌（M SS A）除對紅霉素耐藥率為41.3%外，對其余抗菌藥物的耐藥率均較低。未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素和利奈唑胺不敏感的葡萄球菌屬細菌。見表2。萬古霉素對金葡菌的 MIC50為1.0 mg/L，MIC90為1.5 mg/L。

2.2.2 腸球菌屬 糞腸球菌對氨芐西林仍保持較高敏感性，敏感率為81.2%。屎腸球菌僅對利奈唑胺和替考拉寧保持高度敏感，耐藥率分別為0和1.4%。未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素耐藥的糞腸球菌，但萬古霉素耐藥屎腸球菌高達11.7%。見表3。

2.2.3 常見腸桿菌科細菌 大腸埃希菌是血液標本中最為常見的腸桿菌科細菌之一，其次是肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌。大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、頭孢西丁和頭孢哌酮-舒巴坦耐藥率在15%以下。此外，肺炎克雷伯菌對左氧氟沙星耐藥率也低于10%。陰溝腸桿菌對阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦耐藥率低于30%。出現(xiàn)了對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌（C R E），以陰溝腸桿菌多見。見表4。

2.2.4 常見不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌 銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物保持了較高的敏感性，除對替卡西林-克拉維酸、甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑和米諾環(huán)素耐藥率高（＞40%）外，對其他常用抗菌藥物耐藥率均在30%以下。鮑曼不動桿菌耐藥現(xiàn)象嚴重，除對頭孢哌酮-舒巴坦耐藥率在40%以下，對其余抗菌藥物耐藥率均在50%以上。見表5。

表2 金葡菌對常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 2 Susceptibility of theStaphylococcus aureusisolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

表3 糞腸球菌和屎腸球菌對常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of theE.faecalisandE.faeciu misolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

表4 大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 4 Susceptibility of theE.coli，K.pneu moniaeandE.cloacaeisolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

表5 銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 5 Susceptibility of theP.aeruginosaandA.bau m anniiisolates to the co m m only used antimicrobial agents（%）

3 討論

盡管新型抗菌藥物不斷出現(xiàn)，但臨床血流感染并未見明顯減少，感染率呈逐年上升趨勢［4］。血培養(yǎng)是診斷血流感染的重要依據(jù)，因此了解血培養(yǎng)病原菌的構(gòu)成和耐藥性變遷，對有效控制血流感染顯得極為重要。

本監(jiān)測結(jié)果顯示，血流感染最常見的革蘭陽性病原菌為金葡菌、屎腸球菌和糞腸球菌；最常見的革蘭陰性病原菌為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和布魯菌屬，與我們之前報道的資料相比較有所變化［5］。2013年布魯菌屬細菌感染逐年上升，占血液標本病原菌構(gòu)成的7.1%。布魯菌病是一種人畜共患病，全球年新發(fā)病例數(shù)為50萬［6］。上世紀90年代以來。國內(nèi)25個省市有人畜布魯菌病疫情，西部、東北及華北地區(qū)疫情較嚴重［7］。湖北省地處中部，非疫區(qū)，但近年來發(fā)病率逐年上升，患者除畜牧業(yè)人員外，有醫(yī)務人員、武警戰(zhàn)士、司機等。這可能與我國檢疫制度不健全，群眾自我防護意識淡漠等有關(guān)［7］。應引起廣大醫(yī)務人員廣泛關(guān)注，并加強對此病的防范和診治。

本次監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，我院血流感染的金葡菌中M RSA的檢出率相當高，為54.1%，給臨床經(jīng)驗治療帶來極大的挑戰(zhàn)，慶幸的是，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素和利奈唑胺不敏感的金葡菌。腸球菌屬也是引起血流感染重要的革蘭陽性菌，常繼發(fā)于尿路、盆腔和腹腔感染［8］，主要包括糞腸球菌和屎腸球菌。萬古霉素耐藥腸球菌有逐年上升趨勢，從2009年的約4%升至2013年約8%。均為VanA基因型，未檢出VanB和VanC菌株。分離自血液標本的凝固酶陰性葡萄球菌大部分為污染菌，因臨床資料有限（患者往往只送一套甚至是一瓶血培養(yǎng)），故本文未對凝固酶陰性葡萄球菌進行統(tǒng)計。

血流感染最常見的革蘭陰性桿菌是大腸埃希菌，其次是肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌。大腸埃希菌血流感染多繼發(fā)于尿路、腸道等感染，肺炎克雷伯菌和腸桿菌屬細菌等血流感染則多獲自醫(yī)院內(nèi)［8］。這3種常見的腸桿菌科細菌，除對碳青霉烯類抗生素外，對阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮-舒巴坦的耐藥率均在30%以下。本研究檢出了C R E，尤其是陰溝腸桿菌耐藥現(xiàn)象比較嚴重。2009年我們檢出第1株C R E，2013年增加到15株，基因型主要為I M P-4和N D M-1。臨床上遇 C R E感染應慎用碳青霉烯類抗生素。

血流感染分離的不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌主要是銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌。銅綠假單胞菌血流感染在重癥監(jiān)護病房患者中更為常見，患者往往有嚴重免疫缺陷或嚴重原發(fā)病，且常繼發(fā)于呼吸機相關(guān)性肺炎，病情兇險，病死率高。分離自血培養(yǎng)的銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率為20%～30%，對常用抗菌藥物，如哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、妥布霉素、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率均在30%以下。鮑曼不動桿菌血流感染患者大多有嚴重的基礎疾病，多系醫(yī)院獲得性感染，其耐藥性較銅綠假單胞菌嚴重。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥率高達70%以上，治療相當困難，臨床可考慮聯(lián)合用藥。

本次監(jiān)測檢出肺炎鏈球菌34株，占1.6%，β溶血鏈球菌13株，占0.6%。血培養(yǎng)苛養(yǎng)菌檢出率低的原因可能有：①與抗菌藥物的使用有關(guān)，血流感染往往比較兇險，患者在進入大型綜合性醫(yī)院前，已大量使用抗菌藥物。病原菌被抑制而無法得到陽性培養(yǎng)結(jié)果。②苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)條件相對苛刻，如消毒不嚴格，混有雜菌生長，苛養(yǎng)菌無法得到適當?shù)臓I養(yǎng)呈假陰性。③血培養(yǎng)瓶采集后未立即送往實驗室，任何延誤送入自動連續(xù)監(jiān)測血培養(yǎng)儀的行為，都會延誤或阻止檢測細菌的生長。因此，應重視標本采集處理的各個環(huán)節(jié)，提高檢出率。

綜上所述，血流感染的病原菌種類多，耐藥菌檢出率高，涉及的環(huán)節(jié)也很多。因此，實驗室應重視血培養(yǎng)的全程控制，包括對醫(yī)護人員的培訓，分析前、分析中和分析后各個環(huán)節(jié)的管理，為合理使用抗菌藥物提供科學依據(jù)。

［1］ Tsalik E L，Jones D，Nicholson B，et al.M ultiplex P C R to diagnose bloodstream infections in patients ad mitted fro m the emergency department with sepsis［J］.J Clin Microbiol，2010，48（1）：26-33.

［2］ 葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.2版.南京：東南大學出版社，1997：437-576.

［3］ Xu J，Millar B C，M oore JE，et al.E m ploy ment of broadrange 16S rR N A P C R to detect aetiological agents ofinfection fro m clinical specimens in patients with acute meningitisrapid separation of 16S rR N A PC R a m plicons without the need for cloning［J］.J A ppl Microbiol，2003，94（2）：197-206.

［4］ Dellinger R，Levy M M，Carlet J M，et al.Surviving Sepsis Ca m paign：international guidelines for management of severe sepsis and septic shock：2008［J］.Intensive Care M ed，2008，34（1）：17-60.

［5］ 劉彩林，孫自鏞，朱旭慧，等.2001-2010年血培養(yǎng)病原菌變遷及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2012，22（3）：624-626.

［6］ 尚德秋.布氏桿菌病研究進展［J］.中國地方病防治雜志，2004，19（4）：204-212.

［7］ 周艷彬，柳曉琳.布魯氏菌病的流行、發(fā)病原因及防治進展［J］.遼寧醫(yī)學院學報，2010，31（1）：81-85.

［8］ 李光輝，朱德妹，汪復，等.2011年中國C HIN E T血培養(yǎng)臨床分離菌的分布及耐藥性［J］.中國感染與化療雜志，2013，13（4）：241-247.

Antimicrobial resistance surveillance in the microorganisms isolated from blood specimens：a five-year analysis from 2009 to 2013

Z H O UBiyun，Z H UX uhui，C H E NZhongju，TIA NLei，Y A N Shaozhen，S U NZiyong.
（Department of Laboratory M edicine，Tongji H ospital，Tongji M edical College，H uazhong University of Science and Technology，W uhan 430030，China）

Objective To investigate the distribution，variability and antibiotic resistance of the pathogen sisolated fro m bloodstream infections.M ethods The bacterial strains were routinely isolated fro m blood sam ples and identified.Brucellatrains were identified by PC R and gene sequencing.A ntimicrobial susceptibility were routinely tested for these isolates.Results A total of 2 152 strains，excluding coagulase negativeStaphylococcus，were isolated fro m blood specimens during the 5-year period fro m 2009 through 2013.Gram-positive cocci，gram-negative bacilli and fungi accounted for 35.3% （761/2 152），57.7% （1 242/2 152）and 6.9% （149/2 152），respectively.The top three gram-positive bacteria wereS.aureus，E.faeciu m andE.faecalis.E.coli，K.pneu moniae，P.aeruginosa，A.bau m annii，andBrucellawere the m ost frequently isolated gram-negative bacteria.In 2009，only oneBrucella melitensiswas isolated，butincreased to 50 in 2013（7.1%），including one strain ofBrucella suis.The prevalence of M RS A was 54.1%inS.aureus.No staphylococcal isolate was found resistant to vanco m ycin or linezolid.M ore than 60% of theE.faecalisisolates still showed low resistance（＜ 30%）to am picillin and levofloxacin.ButE.faeciu mstrains were highly resistant to m ost antibiotics（＞70%）except glycopeptides and linezolid.E. coliandK.pneu moniaeisolates displayed low resistance rate（＜15%）to piperacillin-tazobactam，amikacin，cefoxitin and cefoperazone-sulbactam.Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae strains were identified，especially inEnterobacter cloacae. P.aeruginosaisolates were still susceptible to the co m m only used antibiotics，butA.bau m anniiisolateswere highly resistant（＞60% resistant）to all the co m m only used antibiotics except cefoperazone-sulbactam.ConclusionsO ur five-year surveillance data indicated thatE.coliandS.aureuswere still the m ost co m m on pathogens in blood stream infections.Attention should be paid to the increasing prevalence of Brucellain blood stream infections.Various levels of antibiotic resistance are found in the pathogens of blood stream infections.A ntibiotics should be prescribed reasonably according to local susceptibility testing data.

blood stream infection；antibiotic resistance；surveillance

R378

A

1009-7708（2015）01-0001-05

2014-04-28

2014-07-24

湖北省自然科學基金項目（2013C FB172）。

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院麻醉科，武漢430030。*檢驗科。

周碧云（1971—），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事感染學研究。

朱旭慧，E-mail：zhuxuhui2002@163.co m。