番木瓜脂肪酶的應用進展

謝 龍，辛嘉英,2*，王 艷，孫立瑞

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076；

2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州730000）

番木瓜脂肪酶的應用進展

謝 龍1，辛嘉英1,2*，王 艷1，孫立瑞1

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076；

2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州730000）

介紹了番木瓜脂肪酶（CPL）的來源及應用。CPL作為一個與木瓜中的水不溶部分緊密結合的自固定化脂肪水解酶，應用前景非常廣泛：能夠催化脂肪酸和油酸；催化酸與醇的酯化，醇與酯的酯交換反應；催化2-芳基丙酸類藥物的酶促拆分；及在其他方面的應用。

番木瓜脂肪酶；植物脂肪酶；生物催化；選擇性；酯合成

脂肪酶，又稱三?；视王；饷?，是指分解或合成高級脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯脂鍵的酶，一般情況下脂肪酶都具有很好的水解酯酶底物短鏈甘油酯的能力。脂肪酶來源廣泛，不僅僅在動植物中存在，在微生物中也廣泛存在，目前，在實驗室中常用的動物脂肪酶一般是經過冷凍干燥的豬胰脂肪酶，成本高，且提取工藝復雜。因此，微生物是脂肪酶的主要來源，產酶的菌株主要有曲霉、根霉、青霉、南極念珠菌（脂肪酶B）[1]、脂肪酶A[2]、皺褶念珠菌[3,4]等。對于脂肪酶的研究大多集中在微生物脂肪酶中。近年來，由于植物脂肪酶具有易于分離純化，原材料來源充足，在價格上更具有竟爭優(yōu)勢等特點，植物來源的脂肪酶也受到了越來越多的關注[5,6]。目前，針對植物脂肪酶研究較多的是來源于大戟科蘿蘑科木瓜科植物中的脂肪酶。木瓜未成熟的果實里含有豐富的乳白色番木瓜汁，其中15%的干物中含有多種水解酶，主要是蛋白酶[7]。根據木瓜樹年齡和性別的不同，干物中蛋白質成分也不同。由于木瓜乳液里含有多種酶，所以CPL得純化非常難。目前，在工業(yè)中使用的是一種天然混合物。從1935年到1990年，對CPL的報道已經很多，隨著三硝酸甘油酯廣泛用于酶底物，這種具有較強的界面活性的水解酶才引起人們的關注。CPL天然狀態(tài)下緊密結合于木瓜乳汁中不溶于水的類似于纖維的未知物質上，呈天然固定化狀態(tài)，因此，迄今為止關于CPL純化的所有努力均以失敗告終，但這并不妨礙其在酶催化領域的應用[8]。CPL的活性是獨立的，并不依靠木瓜膠乳中的蛋白酶[9]，但對于它的一些天然作用還不清楚[10]。到目前為止，也沒有實驗對于CPL的一些生物化學特征進行說明。盡管CPL的純化很困難，但在最近幾年里，以天然的商品化CPL或半純化的CPL作為催化劑在生物技術上的應用的報道已有很多。

1 CPL催化脂肪酸和油酸

利用CPL在位置上的立體選擇性可以對油脂和脂肪酸進行修飾。低熱量的三酰基丙三醇（TAGs）的合成就是利用CPL的這種立體選擇性，TAGs是由短鏈和長鏈的?；鶜埢Y合成的，最常見的低熱量脂肪酸是SalatrimTM，與天然的脂肪酸相比，它的熱量很低，也為酯交換提供了一個可行的方法。此外，Gandhi等研究了在CPL催化丙三醇三棕櫚酸酯的反應中，對不同脂肪酸乙酯的選擇性[11，12]。發(fā)現(xiàn)當使用脂肪酸乙酯作為供體時，可以提高CPL對中長鏈衍生物的選擇性，也有助于獲得自由脂肪酸。Carla Tecelao等利用低成本的番木瓜乳膠催化合成人乳脂肪替代物。這個實驗的目的是使用固定在番木瓜乳膠上的CPL作為一種低成本的商業(yè)脂肪酶來催化合成人乳脂肪替代物，并評價其催化效果。實驗中使用了兩種不同的木瓜脂肪酶，一種是從木瓜果實（CPLI）中提取的，另一種是從木瓜樹的葉柄（CPLII）中提取的。使用這兩種脂肪酶來催化三棕櫚酸甘油酯和油酸的酸解反應，在60℃無溶劑體系中分批次反應24h，使用了CPL I的油酸的轉化率更高，所以對該酶做進一步研究。建模反應條件：底物摩爾比為n油酸∶n三棕櫚酸甘油酯=1.2～6.8∶1，溫度在58～72℃之間，結果隨摩爾比的增加，?；D移率降低。在60℃下進行穩(wěn)定性試驗，采用的摩爾比為2∶1和6∶1，得到穩(wěn)定性較高的摩爾比是2∶1[13]。ErzhengSu等利用低成本的固定化CPL催化合成脂肪酸正丁酯，發(fā)現(xiàn)CPL對不同的醇?；荏w的選擇性不同。在CPL催化脂肪酸正丁酯的合成實驗中，最優(yōu)條件下反應24h，轉換率可以達到96%。在最優(yōu)條件下使用CPL催化其他植物油，得到的轉化率都非常高。進一步將CPL用于填充床反應器中，可連續(xù)運行150h以上。這些結果表明，低成本的CPL可以作為生物柴油生產的催化劑[14]。

使用番木瓜脂肪酶和甲醇可以催化分解魚油來生產生物柴油燃料。P.Pinyaphong等從魚的廢棄部分提取精制的魚油，使用CPL催化其分解，其產物用作于生產生物柴油的原料。在該實驗中考察了脂肪酶用量、甲醇用量、油的摩爾比、初始水活度、溫度和溶劑的種類等對CPL催化能力的影響。實驗得到當油和甲醇的摩爾比為1∶4，酶量為20%（基于油），初始水活度為0.23和叔丁醇為20%（基于油）時，40℃反應18h后甲酯達到最大產率，最大產率為83%。重復使用30個循環(huán)后，損失的脂肪酶活性較少，可以忽略不計[15]。這方面的應用涵蓋領域較為廣泛，如有機物的改性、酯化、酯交換、酯合成、不同手性酸或醇的不對稱拆分[15-17]。因為CPL是自然非水溶性的，可以被看作是一種“自然固定化”的脂肪酶，所以相比微生物脂肪酶和動物脂肪酶CPL有幾個優(yōu)點，如[18]在有機溶劑中有較穩(wěn)定的pH值和熱穩(wěn)定性，；可回收和再利用；不需要界面活化劑激活活性中心；在不同的生物化學反應中具有較高的通用性、區(qū)域選擇性、立體選擇性和酶作用物的選擇性；可以持續(xù)從未成熟果實中收集。所有的優(yōu)點說明低成本的CPL具有非常好的發(fā)展前景。

2 CPL催化轉酯化拆分芳香仲醇及合成萜烯醇芳香酯

一些研究表明，CPL可以催化多種酰基供體和醇。蘇二正等將CPL用于手性拆分芳香仲醇，以4-苯基-2-丁醇作為模式底物，考察了反應溫度、反應溶劑、酰基供體以及底物摩爾比對CPL拆分能力的影響[19]。結果表明，當使用活性乙烯酯為酰基供體，正己烷或環(huán)己烷作為反應溶劑，底物/?；w摩爾比為1∶2時，在30～45℃下底物的轉化率接近50%，底物對映體過量值e.es大于99%，反應的對映體比值E大于200。CPL對其他結構類似的芳香仲醇也具有很好的拆分能力。該研究為手性芳香仲醇的酶催化制備提供了新的催化劑選擇。

為建立經濟綠色高效的萜烯醇芳香酯合成工藝，以木瓜蛋白酶粗品為原料制備獲得了天然固定化木瓜脂肪酶（CPL），蘇二正等研究了CPL在非水相體系中催化合成萜烯醇芳香酯的效果，探討了在有機溶劑體系中萜烯醇種類、有機溶劑種類以及初始水分活度對反應的影響[20]。結果表明：伯醇類萜烯醇（香茅醇和香葉醇）是較適宜的底物，中等極性的有機溶劑如正己烷為適宜的反應溶劑，0.328的初始水分活度有利于CPL發(fā)揮催化活性，此時轉化率為95.2%，與商業(yè)脂肪酶催化效果相當CPL在有機溶劑中重復使用性較差，考察了不同離子液體處理方法對CPL催化性能的影響，結果表明，使用微量離子液體對CPL進行包裹前處理可以顯著地提高CPL的重復使用性，反應15次后，催化活性仍保留90%以上。

3 CPL催化2-芳基丙酸類藥物的酶促拆分

對于脂肪酶介導的非甾體抗菌藥異構體拆分已有報道[21]。光學純藥物在治療方面的應用是制藥行業(yè)非常有吸引力的。事實上，純對映體相比外消旋藥物具有高特異性和生物活性，使用它們也可以避免產生相關的潛在副作用。手性藥物的不同對映體具有不同藥理特性，因此，制備單一構型對映體藥物對提高藥效，減少毒副作用具有重要意義。通過利用酶對外消旋藥物進行手性拆分，是目前制備手性藥物比較常見同時也比較經濟的一種方法。利用對一類重要的外消旋藥物，同時也是脂肪酶拆分反應中常見的一類重要化合物，布洛芬類非甾體抗炎藥進行了手性拆分。通過改變底物布洛芬酯的醇部分的電荷性質，將布洛芬乙酯替換為布洛芬三氟乙酯，反應轉化率由40%提高到45%，E值由12提高到了14。對非甾體抗炎藥物布洛芬類化合物均有一定的拆分效果，其中對萘普生的拆分效果最好。經過30h反應轉化率達到49%，反應的E值為173，對一系列化合物的拆分結果表明位上空間位阻較大的底物比空間位阻小的化合物具有更好的拆分效果[22]。以CPL為催化劑,利用環(huán)己烷酯化對（R,S）-2-（4-氯氧基）-丙酸消旋體拆分,在最適宜的反應條件下,其E值為113（見圖1,a）。對氯氧基的衍生物的研究表明,在非甾體抗菌藥的消旋體拆分中,代表反應是（R,S）-甲氧萘丙酸三氟乙酯與硫酯的反應[23,24]。Ng等[25]對該反應進行了熱力學模型和動力學模型的研究。在最優(yōu)的反應條件下，其E值為122（見圖1,b）[22]?，F(xiàn)在可以利用CPL拆分消旋體洛芬分子[25]，CPL若能被進一步純化，則能產生更好的活性和對映選擇性。人們還研究了CPL來源對活性的影響[26]，除了皺褶念珠菌脂肪酶,大部分脂肪酶對羧酸的對映選擇性較差,但皺褶念珠菌脂肪酶在極性有機溶劑和高溫的條件下，活性會受到抑制[27]。在番木瓜膠乳中，除了眾所周知的木瓜蛋白酶，脂解活性是另一個有趣的酶活性存在。脂解活性強烈附著到膠乳固相上，從而產生自然固定的生物催化劑。番木瓜脂肪酶對前藥（R,S）-2-溴苯基乙酸辛酯呈現(xiàn)高對映選擇性。Ivanna Rivera等描述了用番木瓜粗膠乳和純化膠乳對（R,S）-2-溴苯基乙酸辛酯的動力學拆分[28]。對底物濃度和溶劑的影響都進行了研究。最好的結果是用50mM底物和50mg·mL-1酶，癸烷作為溶劑；在這些條件下，用粗膠乳獲得一個高對映選擇性（E＞200）。采用初始速率保持在E＞200純組分無蛋白酶和酯酶的CPL進行反應，也沒有得到兩倍的效果。根據有史以來研究，番木瓜膠乳脂酶是具有最高對映選擇性野生型酶。

圖1 手性酸的消旋體拆分Fig.1 Racemic separation of chiral acids

4 其他

4.1 CPL催化拆分beta-氨基酸及其在達泊西汀生物法合成中的應用

在非水相有機溶劑正己烷中拆分另一類重要的化合物氨基酸。分別對這一類氨基酸中兩種具有代表性的氨基酸：芳香族氨基酸β-苯丙氨酸和脂肪族氨基酸丙氨酸進行了拆分。實驗發(fā)現(xiàn)CPL對N-Ac-β-苯丙氨酸甲酯的對映體選擇性不高，E為14。我們從底物工程的角度考慮如何提高CPL對底物的對映體選擇性，以及底物結構對CPL拆分效果的影響。將酯基團替換為三氟乙基，CPL對S型底物的反應速率明顯提高，相比底物N-Ac-β-苯丙氨酸甲酯，其反應速率提高了400倍以上，而對R型的反應速率僅提高了20幾倍，反應的對映體選擇性也得到了較大的提高。E值達到230[29]。

4.2 長鏈醚作為溶劑可提高番木瓜脂肪酶催化2-（取代的苯氧基）丙酸酯的酯交換的對映選擇性

Toshifumi Miyazawa等通過研究使用長鏈醚作為溶劑，CPL催化2-（取代的苯氧基）丙酸與2,2,2-三氟乙基酯的酯交換反應，當用二正己基醚代替常規(guī)二異丙醚作為溶劑[30]時，對映體選擇性有很大的提高，在同樣的反應條件下，CPL（10mg）催化2,2,2-三氟乙基酯（RS）-2-苯氧丙酸（0.1mmol）與甲醇（0.4mmol）的酯交換反應，E值從21[二異丙醚（0.8mL）]提高至57[二正己基醚（0.8mL）]；催化2,2,2-三氟乙基（RS）-2-（2-氯苯氧基）丙酸乙酯和甲醇的酯交換反應，E值從13（二異丙醚）提高至44（二正己基醚）。

5 結果與展望

最近幾年，CPL作為一種新型、多用途的生物催化劑，得到了大量應用。目前，在油酸和脂肪酸的修飾，有機相的轉酯化，芳香酯的合成，重要手性化合物的拆分方面，都取得了非常好的效果，擴展了其應用領域。不僅表明CPL具有優(yōu)良的催化性能，同時說明木瓜源酶類具有較高的開發(fā)價值，作為植物來源的酶，經過一些簡單的物理過程就可以純化，沒有化學溶劑的污染，相比微生物來源的酶，其更適宜用于食品、香精香料、化妝品等行業(yè)，相比其他來源脂肪酶，植物脂肪酶具有不同的酶學性質。綜上所述，木瓜脂肪酶具有很好的應用前景。

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Application progress of carica papaya lipase

XIE Long1，XIN Jia-ying1，2*，WANG Yan1，SUN Li-rui1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076，China；2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000,China）

Carica papaya lipase（CPL）is attracting more and more interest.This hydrolase,being tightly bonded to the water-insoluble fraction of crude papain,is thus considered as a“naturally immobilized”biocatalyst. Several applications have already been described:Capable of catalyzing fatty acid and oleic acid;Catalyzed esterification of acids and alcohols,alcohol and ester exchange reaction;Catalyze enzymatic resolution 2-aryl-propionic acid drugs;Applications in other areas.

carica papaya lipase；plant lipases；biocatalysis；selectivity；ester synthesis

Q556

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20151141

2015-09-06

謝龍（1989-），男，大慶人，哈爾濱商業(yè)大學碩士研究生，研究方向：農產品加工。

導師簡介：辛嘉英（1966-），男，博士，龍江學者特聘教授，博士生導師。