腫瘤間質(zhì)比及腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞對(duì)晚期結(jié)直腸癌的預(yù)后價(jià)值

張溪胡柏來(lái)呂震馬廣貞陳麗榮

·臨床研究與應(yīng)用·

腫瘤間質(zhì)比及腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞對(duì)晚期結(jié)直腸癌的預(yù)后價(jià)值

張溪①胡柏來(lái)①呂震②馬廣貞③陳麗榮①

目的：研究結(jié)直腸癌腫瘤間質(zhì)比（tumor-stroma ratio，TSR）及腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)性。方法：收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科2007年1月至2009年12月手術(shù)切除的原發(fā)性Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌218例病理資料進(jìn)行回顧性分析，通過(guò)HE染色評(píng)估腫瘤組織中間質(zhì)成分所占比例及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況，并分析不同分組對(duì)患者預(yù)后生存的影響。結(jié)果：218例Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中低TSR組總體生存率明顯高于高間質(zhì)組（P＜0.05）。TSR與各項(xiàng)臨床特征及病理指標(biāo)，如性別、年齡等無(wú)關(guān)（P＞0.05）。TSR及TIL均為Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子。高淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組患者總體生存率明顯高于低淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組患者，在低間質(zhì)組中高淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組的患者總體生存率高于低淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組患者（P＜0.05）。結(jié)論：腫瘤間質(zhì)比及腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后均相關(guān)，在常規(guī)病理診斷中通過(guò)對(duì)這兩項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)估，可作為輔助指標(biāo)對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)、臨床治療選擇提供依據(jù)。

結(jié)直腸癌 腫瘤間質(zhì)比 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞 預(yù)后

1Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China;

2Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,Department of Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China;

3Department of Pathology,the Second People's Hospital of Liaocheng Affiliatedto Taishan Medical College,Liaocheng 252601,China

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活方式的轉(zhuǎn)變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年增多，目前其發(fā)病率已在惡性腫瘤中居第三位，死亡率第五位［1］。目前，國(guó)內(nèi)外仍采用TNM分期對(duì)大腸癌的浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況作出評(píng)估，指導(dǎo)臨床治療手段。然而事實(shí)上，相同分期的患者臨床預(yù)后也可能極大不同，病理特征可能是造成這種差別的重要原因之一。

癌細(xì)胞周圍的腫瘤間質(zhì)成分起著支持和營(yíng)養(yǎng)腫瘤實(shí)質(zhì)的作用，為腫瘤生長(zhǎng)所必須，在腫瘤的生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用。腫瘤間質(zhì)微環(huán)境可直接影響腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化、侵襲等生物學(xué)行為，與此同時(shí)，腫瘤間質(zhì)又直接或間接受到腫瘤細(xì)胞的影響與調(diào)節(jié)［2］。近年來(lái)腫瘤間質(zhì)比（tumor-stroma ratio，TSR）在結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中

的預(yù)后作用逐漸受到關(guān)注和證實(shí)［3-4］。腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）是腫瘤微環(huán)境中一類重要細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用。本研究重點(diǎn)分析腫瘤間質(zhì)比及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況與Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料

收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科2007年1月至2009年12月手術(shù)切除的原發(fā)性Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌標(biāo)本218例，其中男性145例，女性73例；男女比例1.9：1?；颊吣挲g平均62.1（25～86）歲。按照UICC分期委員會(huì)提出的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅱ期107例（49.1%），Ⅲ期111例（50.9%）。所有病例均未進(jìn)行術(shù)前放化療（表1）。本研究排除多發(fā)性腫瘤、復(fù)發(fā)性腫瘤、非腫瘤性死亡病例、生存時(shí)間＜3個(gè)月的病例、微乳頭狀癌、鋸齒狀腺癌等少見類型結(jié)直腸癌病例。

表1 Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌TSR與臨床病理特征的關(guān)系Table 1Correlations between TSR and clinicopathologic features in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

1.2方法

1.2.1腫瘤間質(zhì)比判定采用雙盲法由2名未知患者信息的病理醫(yī)生對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)Mesker等［5］提出的方法進(jìn)行判定：將原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)最多的部位切取制作成5 μm常規(guī)HE病理切片。在低倍鏡下（×40）選取腫瘤浸潤(rùn)最明顯的區(qū)域，然后在高倍鏡下（×100）判定單視野內(nèi)腫瘤所占該視野的百分比（carcinoma percentage，CP），而該視野范圍四周均應(yīng)有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。每個(gè)視野的腫瘤比例以10%為區(qū)間值（如10%、20%、30%等），盡量避開壞死或黏液區(qū)域。通過(guò)評(píng)估視野內(nèi)腫瘤所占比，可以得出該視野內(nèi)間質(zhì)所占百分比（stroma percentage，SP）（如某一視野內(nèi)CP值為30%，則該視野內(nèi)SP值為70%）。選取至少2個(gè)視野進(jìn)行評(píng)估，取SP最高值作為終值。腫瘤組織中SP≤50%為低間質(zhì)組，SP＞50%為高間質(zhì)組（圖1）。對(duì)于初步評(píng)估SP介于40%～60%的樣本，通過(guò)對(duì)比相鄰腺管間間質(zhì)距離與腺管的寬度進(jìn)行評(píng)估：若腺管間間質(zhì)距離大于腺管寬度，則為高間質(zhì)；若腺管間間質(zhì)距離小于腺管寬度，則為低間質(zhì)。

圖1 結(jié)直腸癌不同腫瘤間質(zhì)比（H&E×100）Figure 1Different TSR of colorectal cancer（H&E×100）

1.2.2淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Huh等［6］的判定方法：在顯微鏡下觀察HE病理切片，在腫瘤浸潤(rùn)最明顯的區(qū)域?qū)IL按浸潤(rùn)程度分為4級(jí)：0級(jí)：無(wú)淋巴細(xì)胞反應(yīng)；1級(jí)：可觀察到散在淋巴細(xì)胞；2級(jí)：可觀察到中度淋巴細(xì)胞反應(yīng)或淋巴細(xì)胞帶狀浸潤(rùn)；3級(jí)：大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，破壞腫瘤細(xì)胞的連續(xù)性。然后根據(jù)浸潤(rùn)情況的不同將病例分為低TIL組（0～1級(jí)）和高TIL組（2～3級(jí)）（圖2）。

1.2.3隨訪部分病例由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供完整臨床隨訪資料，其余病例通過(guò)查閱病案室檔案或電話的方式獲得患者的預(yù)后資料，隨訪至2014年2月28日或患者死亡，隨訪率為85.7%。

圖2 結(jié)直腸癌中腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（H&E×100）Figure 2Tumor-infiltrating lymphocytes in colorectal cancer（H&E×100）

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)數(shù)資料用Pearson卡方檢驗(yàn)，患者預(yù)后分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型單因素和多因素分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，組間差異采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者基本病理特征

218例結(jié)直腸癌中高間質(zhì)組58例（26.6%），低間質(zhì)組160例（73.4%）。TSR在性別、年齡、腫塊部位、腫塊大小、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯、臨床分期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。根據(jù)對(duì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況的判定結(jié)果，218例結(jié)直腸癌中168例（77.1%）為低TIL組，50例（22.9%）為高TIL組。

2.2TSR、TIL與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系

對(duì)218例結(jié)直腸癌患者隨訪至2014年2月28日或患者死亡，高間質(zhì)組28例死亡（48.3%），中位生存時(shí)間為54.0個(gè)月；低間質(zhì)組46例死亡（28.8%），中位生存時(shí)間為60.5個(gè)月。Kaplan-Meier生存分析顯示，兩組結(jié)直腸癌患者的總體生存時(shí)間有顯著性異（χ2=9.730，P=0.002，圖3）。低TIL組與高TIL組患者的中位生存時(shí)間分別為60.8、75.3個(gè)月，兩組結(jié)直腸癌患者的總體生存時(shí)間間有顯著性差異（χ2=6.772，P=0.009，圖4）。Cox單因素分析顯示，TSR、TIL、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為腸癌患者的生存相關(guān)因素（表2）。Cox多因素分析顯示，TSR、TIL與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，而性別、年齡、腫塊部位、腫塊大小、T分期、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯并非結(jié)直腸癌獨(dú)立預(yù)后因素（表3）。

圖3 不同TSR患者的Kaplan-Meier生存分析Figure 3Kaplan-Meier survival curves of OS of stroma-high versus stroma-low in colorectal cancer

圖4 不同TIL浸潤(rùn)的患者Kaplan-Meier生存分析Figure 4Kaplan-Meier survival curves of OS of different tumor-infiltrating lymphocytes groups in colorectal cancer

表2 Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后Cox單因素分析Table 2Univariate Cox regression analysis of prognostic factors in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

表2 Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后Cox單因素分析（續(xù)表2）Table 2Univariate Cox regression analysis of prognostic factors in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

表3 Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后Cox多因素分析Table 3Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

2.3TSR與TIL對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后作用

將218例結(jié)直腸癌患者分為3組：高危組：全部高間質(zhì)組病例；中間組：同時(shí)屬于低間質(zhì)組和低TIL組的病例；低危組：同時(shí)屬于低間質(zhì)組和高TIL組的病例（表4）。3組中位生存時(shí)間分別為53.2、64.8、77.7個(gè)月。Kaplan-Meier生存分析顯示，各危險(xiǎn)組結(jié)直腸癌患者的總體生存時(shí)間之間有顯著性差異（χ2=13.656，P=0.001，圖5）。

圖5 不同風(fēng)險(xiǎn)組（TSR+TIL）的患者Kaplan-Meier生存分析Figure 5 Kaplan-Meier survival curves of OS in different risk groups in colorectal cancer

表4 基于TSR與TIL的風(fēng)險(xiǎn)分組對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后影響Table 4Risk grouping based on TSR and TIL for the prognosis of colorectal cancer

3 討論

腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞由腫瘤細(xì)胞、原有的以及浸潤(rùn)的非腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞通過(guò)多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路等相互作用，建立復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制［7］。在這一過(guò)程中，包括淋巴細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞也發(fā)揮著重要的作用［8］。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)腫瘤間質(zhì)在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中所發(fā)揮的作用，以及腫瘤間質(zhì)與患者臨床預(yù)后的關(guān)系不斷有了新的認(rèn)識(shí)。Mesker等［3，5］回顧性觀察分析了腫瘤組織中腫瘤成分所占比（carcinoma percentage，CP）及間質(zhì)成分所占比（stroma percentage，SP）與結(jié)直腸癌的預(yù)后關(guān)系，并以50%為CP的cut-off值，結(jié)果顯示低CP患者的總體生存率和無(wú)病生存率均低與高CP患者，首先提出TSR為結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因子。Huijbers等［9］通過(guò)對(duì)710例原發(fā)性結(jié)直腸癌進(jìn)行分析，同樣以50%為界將所有病例分為高間質(zhì)（stroma high）及低間質(zhì)（stroma low）兩組，結(jié)果顯示高間質(zhì)患者的總體生存率及無(wú)病生存率較低間質(zhì)患者明顯降低。此研究710例結(jié)直腸癌患者中433例高?；颊呓邮苓^(guò)術(shù)前化療（chemotherapy treatment，CT），通過(guò)對(duì)CT亞組的分析進(jìn)而發(fā)現(xiàn)對(duì)于接受過(guò)術(shù)前化療的高?；颊?，高間質(zhì)同樣與患者的不良預(yù)后相關(guān)，總體生存率及無(wú)病生存率明顯降低（P＜0.05）。West等［10］通過(guò)數(shù)字切片技術(shù)分析結(jié)直腸癌中TSR與患者預(yù)后的關(guān)系，也得出類似的結(jié)論。在隨后的文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示TSR不僅與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)乳腺癌、宮頸癌、食管腺癌等多種實(shí)體腫瘤同樣具有預(yù)后作用［4，11-12］。本研究通過(guò)對(duì)218例Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本HE切片觀察分析，結(jié)果顯示高間質(zhì)組患者總體生存率明顯低于低間質(zhì)組，TSR可以作為結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因子，與以往的研究結(jié)果相一致。

腫瘤間質(zhì)是由一系列細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞等與細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）及細(xì)胞外分子所組成。這些非腫瘤細(xì)胞間的相互作用、直接或間接與腫瘤細(xì)胞間相互作用激活各種分子信號(hào)通路，不僅使其自身獲得異常表型或功能轉(zhuǎn)化，同時(shí)也使腫瘤間質(zhì)發(fā)生功能改變，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤間質(zhì)的重要成分，參與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)合成，并可以通過(guò)多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎癥介質(zhì)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物活性，在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［13-14］。已在多種腫瘤組織中被證實(shí)，腫瘤纖維母細(xì)胞表型與正常纖維母細(xì)胞相比CD34表達(dá)缺失而α-SMA表達(dá)升高。有研究顯示纖維母細(xì)胞的突變?cè)缬谏掀ぜ?xì)胞突變而獲得致瘤性，促進(jìn)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而腫瘤的發(fā)生又能夠反過(guò)來(lái)刺激周圍正常纖維母細(xì)胞發(fā)生表型改變，最終二者共同促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)CAFs不僅可以刺激腫瘤細(xì)胞增殖，還可以通過(guò)HGF、TGF-β等生長(zhǎng)因子參與腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤侵襲浸潤(rùn)能力［17］。以上研究結(jié)果提示腫瘤間質(zhì)可以通過(guò)CAFs參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，這可能是高間質(zhì)結(jié)直腸癌預(yù)后不良的重要原因之一。

本研究對(duì)腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示高TIL患者的總體生存率明顯高于低TIL患者，提示TIL是Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的良好預(yù)后因子。將本研究低間質(zhì)組的患者根據(jù)TIL的不同分為低危組（低間質(zhì)+高TIL）及中間組（低間質(zhì)+低TIL）與高危組（高間質(zhì)）患者共同進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示低危組患者的總體生存率最高，中間組次之，高危組最低。生存曲線顯示在低間質(zhì)組患者中，高TIL組的患者的總體生存率明顯高于低TIL組患者，提示低間質(zhì)患者的預(yù)后差異可能是由淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況不同所引起的。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展也是腫瘤細(xì)胞與宿主相互平衡、相互適應(yīng)的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子如TSP-1、TGF-β、MMP等，可以直接或間接產(chǎn)生免疫耐受和免疫抑制以促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程［18］。而在腫瘤組織中及腫瘤浸潤(rùn)邊緣出現(xiàn)的炎細(xì)胞反應(yīng)被認(rèn)為是一種宿主抵抗癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)［19］，腫瘤間質(zhì)中的TIL可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，往往與患者的較高生存率相關(guān)［20］。早在1987年腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞已被提出可作為結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因子［21］，近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道了腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞在其他腫瘤如乳腺癌、卵巢癌中的預(yù)后作用［22-23］。有研究顯示CD3+、CD8+T細(xì)胞在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，TIL細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)CTL細(xì)胞的激活［24-25］。也有國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為TIL憑借其抗腫瘤作用有可能成為免疫治療中新的高效抗瘤效應(yīng)細(xì)胞［26-27］。

綜上TSR、TIL均為結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因子，兩項(xiàng)參數(shù)的綜合分析對(duì)結(jié)直腸癌患者有較強(qiáng)的預(yù)后指導(dǎo)作用。腫瘤間質(zhì)中各種成分間的相互作用與制衡形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目前對(duì)TSR與TIL之間的具體作用仍未完全清楚，若將其作為一項(xiàng)結(jié)直腸癌病理診斷的常規(guī)輔助參數(shù)，可為臨床治療方案制定、預(yù)后判斷提供更加完善、更加準(zhǔn)確的依據(jù)。

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（2014-12-25收稿）

（2015-01-20修回）

（編輯：鄭莉）

Prognostic values of tumor-stroma ratio and tumor-infiltrating lymphocytes in stagesⅡandⅢcolorectal cancer

Xi ZHANG1,Bailai HU1,Zhen LV2,Guangzhen MA3,Lirong CHEN1

Lirong CHEN;E-mail:chenlr999@163.com

Objective:To investigate the prognostic values of tumor-stroma ratio and tumor-infiltrating lymphocytes in colorectal cancer.Methods:A total of 218 stageⅡorⅢprimary colorectal cancer patients were analyzed for the tumor-stroma ratio(TSR) and tumor-infiltrating lymphocytes(TIL)by using HE stained histological sections.The relationship between TSR and clinicopathologic variables and the difference in clinical outcomes of different groups were also analyzed.Results:Overall survival rates for the stroma-low group were significantly higher than the stroma-high group in stagesⅡandⅢcolorectal cancer(P<0.05).However,the differences in TSR were not correlated with clinicopathologic features such as gender and age(P>0.05).Overall survival rates of patients with high TIL were significantly higher than patients with low TIL(P<0.05).Patients with high TIL had notable better prognosis than patients with low TIL(P<0.05)in the stroma-low group.Conclusion:TSR and TIL are independent prognostic factors for stagesⅡandⅢcolorectal cancer.The combined estimates of TSR and TIL in routine pathology diagnoses may provide more evidence to predict the prognosis of stagesⅡandⅢcolorectal cancer.

colorectal cancer,TSR,TIL,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20142129

①浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科（杭州市310009）；②浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科；③泰山醫(yī)學(xué)院附屬聊城市第二人民醫(yī)院病理科

陳麗榮chenlr999@163.com

張溪專業(yè)方向?yàn)榇竽c癌的分子機(jī)制、早期診斷及個(gè)體化治療。

E-mail：［K V YJ BPYJ”126.com