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    MiR-340經(jīng)組織型纖溶酶原激活劑調(diào)控施萬細胞的纖溶能力*

    2015-11-21 08:02:10張銳銳龔蕾蕾王珊珊陳倩倩顧曉松李石營
    交通醫(yī)學 2015年1期
    關鍵詞:施萬報告基因髓鞘

    張銳銳,龔蕾蕾,王珊珊,陳倩倩,顧曉松,李石營

    (南通大學江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室,江蘇226001)

    在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的microRNA(miRNA)是一類約22個核苷酸的短鏈非編碼RNA,通過降解靶基因mRNA或者阻礙靶基因的翻譯來下調(diào)靶基因的表達,廣泛參與機體的各種生理及病理過程[1-3]。周圍神經(jīng)因炎癥反應、髓鞘崩解,從而產(chǎn)生髓鞘碎片和膠原纖維等堆積物阻礙軸突向前生長。組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,tPA)是一種絲氨酸蛋白酶,能夠把無活性的纖溶酶原激活成有活性的纖維蛋白溶酶(plasmin),是清除這些堆積物的主要蛋白酶[4-6]。我們研究發(fā)現(xiàn)miR-340可抑制施萬細胞的纖溶能力,靶基因預測分析發(fā)現(xiàn)tPA是miR-340的潛在靶基因,因此我們構(gòu)建tPA的熒光素酶報告質(zhì)粒,通過雙基因報告系統(tǒng)確定miR-340可直接作用于tPA的3'UTR,從而負性調(diào)控靶基因tPA的表達。

    1 材料和方法

    1.1 纖溶實驗 用12孔板制作纖維蛋白板,將低熔點瓊脂糖溶于0.01mol/L PBS中,制成1%低熔點瓊脂糖凝膠。每孔包含0.8 mL瓊脂糖溶液、thrombin(0.125 unit)、125 μL fibrinogen (10 mg/mL)、2.5 μL plasminogen(10 u/mL)。無菌條件下,室溫放置1 h完全凝固后,在孔中央挖5 mm的小孔。miR-340模擬物、阻遏物(廣州銳博生物公司)及各自對照轉(zhuǎn)染永生化的施萬細胞RSC96,6 h后移植在纖維蛋白板的小孔中。放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中,18 h后測量溶圈的寬度。

    1.2 tPA 3'UTR的構(gòu)建 大鼠基因組的制備采用基因組提取PCR試劑盒(福際生物公司)。tPA 3'UTR構(gòu)建的上游引物為CGGAATTCCAAAGAAAGCCCAGCTCCT,下游引物為CCCTCGAGTAAGTGTGAAAAATACCTTG。用Pyrobest DNA聚合酶從基因組上擴增出目的條帶,EcoRI-XhoI雙酶切后插入pLUC-UTR報告基因載體(復旦大學惠贈),構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pLuc-tPA-3'UTR,測序確定構(gòu)建序列的正確性。

    1.3 熒光素酶活性檢測 將miR-340模擬物及對照共轉(zhuǎn)染RSC96細胞,轉(zhuǎn)染24 h后,冰冷PBS液收細胞,加入100 μL PLB裂解液室溫裂解細胞15 min。取20μL裂解上清加入96孔板,然后加入30 μL LAR II,混勻后立即在熒光/化學發(fā)光儀上檢測 Firefly熒光素酶活性(F值)。然后每孔再加入15 μL的Stop&Glo溶液檢測 Renilla熒光素酶活性(R值),R值與F值的比值為相對熒光強度,反映報告基因的相對表達水平,實驗設3次重復。

    1.4 大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型的建立 16只健康成年雄性SD大鼠,體重180~220g,隨機分為2組,用復合麻醉劑麻醉大鼠,暴露左側(cè)坐骨神經(jīng),在坐骨神經(jīng)中段夾傷坐骨神經(jīng),方法為用止血鉗壓傷15 s,停3 s,重復2次。在夾傷后的0 h和7 d處死大鼠,取夾傷段坐骨神經(jīng)用于分析。

    1.5 實時定量聚合酶鏈反應檢測 (RT-PCR)mRNA逆轉(zhuǎn)錄和miRNA逆轉(zhuǎn)錄用MicroRNA Reverse Transcription Kit(Thermo)進行。反應體系如下:10 mM dNTPs 2 μL,Reverse Transcriptase 1μL,5×Reverse Transcription Buffer 4 μL,RNase Inhibitor 20 U/μL 0.25 μL,逆轉(zhuǎn)錄引物 2μL,RNA sample 1 μg,加DEPC水至20 μL。在PCR儀器上運行,37℃ 60 min,70℃5 min。RT-PCR檢測以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物為模板,反應體系如下:2×Premix 10 μL,F(xiàn)orward primer 0.4 μL,Reverse primer 0.4 μL,cDNA 1 μL,ROX 0.4 μL,雙蒸水 7.8 μL。在 ABI StepOne PCR儀上進行,95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s,45 個循環(huán)。每個反應設置3個復孔,mRNA檢測用GAPDH作為內(nèi)參,miRNA檢測用U6作為內(nèi)參。

    1.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用STATA7.0統(tǒng)計學軟件進行分析,組間差異分析采用t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 miR-340抑制施萬細胞的纖溶能力 坐骨神經(jīng)損傷后的再生過程中,軸突在生長過程中需要穿過髓鞘碎片和膠原纖維等堆積物,因此溶解這些障礙物,清除軸突生長的路障,在坐骨神經(jīng)損傷后的再生修復過程中具有重要作用。我們在篩選影響施萬細胞纖溶能力的miRNA時發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-340模擬物的RSC96細胞組,溶圈明顯比對照組小。而轉(zhuǎn)染miR-340抑制物的RSC96細胞組,溶圈明顯比對照組大(圖1),說明miR-340能夠抑制施萬細胞的纖溶能力。

    圖1 miR-340能夠抑制施萬細胞的纖溶能力(*0.01<P<0.05)

    2.2 miR-340可直接靶向作用于tPA的3'UTR TargetScan和miRanda軟件預測分析顯示,miR-340可能作用于tPA的3'UTR。我們用熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)來驗證miR-340是否靶向tPA的3'UTR。將miR-340與tPA匹配區(qū)的3'UTR構(gòu)建到p-Luc熒光素酶報告基因的下游,構(gòu)成報告基因質(zhì)粒(圖2A)。構(gòu)建的質(zhì)粒分別與miR-340的模擬物或?qū)φ展餐D(zhuǎn)入RSC96細胞中,與對照組相比,miR-340模擬物可顯著降低相對熒光強度(圖2B)。說明miR-340能直接靶向作用于tPA的3'UTR,從而可以抑制tPA的表達。

    圖2 miR-340可直接作用于基因tPA的3'UTR(**P<0.01)

    2.3 大鼠坐骨神經(jīng)再生過程中tPA與miR-340的表達基本呈負相關性 通過RT-PCR來檢測夾傷段坐骨神經(jīng)中tPA和miR-340的表達變化情況,如圖3所示,與0 h相比,tPA的mRNA表達在7 d顯著增加。而miR-340的表達在7 d顯著降低,表明tPA與miR-340的表達呈負相關性。

    圖3 大鼠坐骨神經(jīng)再生過程中tPA與miR-340表達變化(**P<0.01)

    3 討 論

    周圍神經(jīng)損傷后近側(cè)端神經(jīng)發(fā)生創(chuàng)傷性潰變,遠側(cè)端神經(jīng)發(fā)生瓦勒氏變性[7],產(chǎn)生的髓鞘碎片和膠原纖維等堆積物阻礙軸突向前生長。tPA主要由施萬細胞分泌,是清除這些沉積的髓鞘碎片和膠原纖維的主要蛋白酶。文獻報道tPA在周圍神經(jīng)再生過程中具有重要的調(diào)控作用,神經(jīng)損傷后,tPA的分泌迅速增加[8-9]。而tPA敲除的大鼠感覺和運動功能的恢復明顯減弱[10]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達,具有迅速、精細、可逆等特點。小的分子屬性使它也相對容易通過血--神經(jīng)屏障,因此是一種新的潛在的治療靶點。本研究首次報道m(xù)iR-340可直接靶向tPA的3'UTR,從而通過降低靶基因tPA的表達,抑制施萬細胞的纖溶能力。本研究從轉(zhuǎn)錄后水平解讀了tPA的調(diào)控機制,是miRNA在周圍神經(jīng)再生過程中的調(diào)控作用的良好補充,也為miR-340作為新的治療靶點的研究與開發(fā)提供了科學前提。

    [1]Jinek M,D oudna JA.A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference[J].Nature,2009,457(7228):405-412.

    [2]Vasudevan S,Tong Y,Steitz JA.Switching from repression to activation:microRNAs can up-regulate translation[J].Science,2007,318(5858):1931-1934.

    [3]Krol J,Loedige I,F(xiàn)ilipowicz W.The widespread regulation of microRNA biogenesis,function and decay[J].Nat Rev Genet,2010,11(9):597-610.

    [4]Chang YM,Shih YT,Chen YS,et al.Schwann cell migration induced by earthworm extract via activation of PAs and MMP2/9 mediated through ERK1/2 and p38 [J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2011 2011;2011:395458.doi:10.1093/ecam/nep131.Epub 2011 Jan 4.

    [5]García-Rocha M,Avila J,Armas-Portela R.Tissue-type plasminogen activator(tPA)is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones[J].Neurosci Lett,1994,180(2):123-126.

    [6]Mack TG,Reiner M,Beirowski B,et al.Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene[J].Nat Neurosci,2001,4(12):1199-1206.

    [7]Lee SK,Wolfe SW.Peripheral nerve injury and repair[J].J Am Acad Orthop Surg,2000,8(4):243-252.

    [8]Siconolfi LB,Seeds NW.Induction of the plasminogen activator system accompanies peripheral nerve regeneration after sciatic nerve crush[J].Journal of Neuroscience,2001,21(12):4336-4347.

    [9]Strong AM,Setaluri V,Spiegelman VS.microRNA-340 as a modulator of RAS-RAF-MAPK signaling in melanoma[J].Arch Biochem Biophys,2014,563(SI):118-124.

    [10]Siconolfi LB,Seeds NW.Mice lacking tPA,uPA,or plasminogen genes showed delayed functional recovery after sciatic nerve crush[J].J Neurosci,2001,21(12):4348-4355.

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