1個青少年發(fā)病的成人型糖尿病2型家系的基因突變分析

樂昊 任蕾 郭豐 秦貴軍

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科 河南 鄭州 450052)

青少年發(fā)病的成年型糖尿病(maturity -onset diabetes of the young，MODY)是一種常染色體顯性遺傳的特殊類型糖尿病，以發(fā)病年齡早(通常＜25 歲)、胰島β 細胞功能缺陷為特征［1］。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)14 個基因(HNF4A、GCK、HNF1α、PDX1、HNF1β、NEUROD1、KLF11、CEL、PAX4、INS、BLK、ABCC8、KCNJ11)與之相關(guān)，其中葡萄糖激酶基因(GCK)突變所致的MODY2是最常見的MODY 類型之一，大約占所有MODY 患者的30% ～50%［2］。由于患病率較低(有統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，MODY 僅占歐美國家糖尿病患者的2% ～5%)［3］，并且其發(fā)病年齡及臨床表現(xiàn)與1 型和2 型糖尿病有很大相似之處，導(dǎo)致該病的診斷較為困難。但由于該病的明確診斷對患者的治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷和遺傳咨詢有重要意義，因此臨床上應(yīng)予以重視。該病在歐美國家報道較多，在我國有數(shù)個家系報道［4］，但在河南省內(nèi)尚無MODY2 家系報道。

1 資料與方法

1.1 研究對象 患者男，14 歲。主訴“發(fā)現(xiàn)血糖升高4 個月”。4 個月前至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院體檢查空腹血糖7.77 mmol/L，餐后2 h 血糖10.48 mmol/L，無口渴、多飲、多尿、消瘦，無手足麻木、視物模糊，診斷為“糖尿病(未定型)”，未服用藥物，未嚴格控制飲食。3月前至南陽市中心醫(yī)院查空腹血糖7.63 mmol/L，餐后2 h血糖10.22 mmol/L，腹部彩超無異常，骨齡片符合14歲，診斷為“糖尿病(未定型)”，予“格列吡嗪控釋片5 mg，早1 片”，后偶測空腹血糖波動于7.30 ～7.88 mmol/L。半月前測空腹血糖7.6 mmol/L，遵醫(yī)囑家用“鹽酸二甲雙胍緩釋片0.5 g，晚1 片”，未測血糖。至鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院后門診以“MODY”收入內(nèi)分泌科。個人史:系第1 胎、第1 產(chǎn)，順產(chǎn)，無產(chǎn)傷、產(chǎn)后窒息史，身高較同齡人偏低，生長發(fā)育及智力發(fā)育與同齡人無明顯差異。

查體:身高148.5 cm，體質(zhì)量39 kg，BMI 17.7 kg/m2，余無特殊。入院后查OGTT:空腹為8.9 mmol/L，30 min 為11.0 mmol/L，60 min 為13.4 mmol/L，120 min為13.3 mmol/L，180 min 為9.5 mmol/L;胰島素釋放試驗:空腹為5.2 μU/ml，30 min 為11.5 μU/ml，60 min 為28.5 μU/ml，120 min 為55.0 μU/ml，180 min 為18.3 μU/ml;C 肽釋放試驗:空腹為1.21 ng/ml，30 min 為2.17 ng/ml，60 min 為4.38 ng/ml，120 min 為8.49 ng/ml，180 min 為4.67 ng/ml;胰島素自身抗體:谷氨酸脫羧酶抗體27 IU/L、胰島素抗體1.5%、胰島細胞抗體8.1 IU/ml;脂聯(lián)素11.62 μg/ml;肝功能、腎功能、血脂、電解質(zhì)、血常規(guī)、糞常規(guī)、尿常規(guī)、甲狀腺功能、24 h 尿蛋白、心電圖、腹部及泌尿系彩超、聲導(dǎo)抗及純音聽閾檢查無異常;傳染病四項全陰性;生長激素激發(fā)試驗:0 min 為12.2 ng/ml，15 min 為23.6 ng/ml，30 min 為45.6 ng/ml，60 min 為41.1 ng/ml，90 min 為23.6 ng/ml;骨齡片符合14 歲。明確診斷后行院外飲食控制，未使用藥物治療，3 個月后于門診復(fù)查，身高150 cm，體質(zhì)量40 kg，BMI 17.8 kg/m2，空腹血糖7.44 mmol/L，糖化血紅蛋白5.7%。

圖1 1 個青少年發(fā)病的成年型糖尿病MODY2 家系的遺傳譜系圖

家族史見家系圖(圖1)，先證者母親于37 歲時體檢發(fā)現(xiàn)糖尿病，其祖母、外祖母均發(fā)現(xiàn)糖尿病5 a 余，現(xiàn)使用二甲雙胍等口服藥物治療，余家族成員篩查空腹血糖及糖化血紅蛋白均未發(fā)現(xiàn)異常。

1.2 外周血DNA 提取 取患者及家族成員全血各1 ml(肝素抗凝)，用血液基因組柱式小量提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取所有家系成員的外周血基因組DNA。

1.3 PCR 擴增并測序 對患者進行PCR 擴增并測序GCK 基因所有外顯子，找出突變位于7 號外顯子，后對家系成員GCK 基因7 號外顯子進行測序。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計及合成:GCK -7F 5’-CGCCTTTCCATTGTTCCAGA -3’，GCK -7R 5’-AGTTTGCTTTTCCCCAGAGTTG -3’。50 μl PCR 總反應(yīng)體系:DNA 模板1 μl、引物Fi 1 μl、引物Ri 1 μl、10 mmol/L dNTP 1 μl、Taq Buffer 5 μl、25 mmol/L MgCl25 μl、5 U/μl Taq 酶0.5 μl、水35.5 μl。采用美國ABI公司Verity 96well 型PCR 擴增儀擴增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃3 min，變性94℃30 s，退火55℃35 s，延伸72 ℃40 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸40 s，72 ℃修復(fù)延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)英國Syngene 公司凝膠成像儀成像，美國ABI 3730XL 自動測序儀測序。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 這是1 個早發(fā)糖尿病家系(先證者年齡＜25 歲)，連續(xù)三代可見家系成員受累，符合常染色體顯性遺傳。先證者和其他受累者無典型的“三多一少”癥狀，無酮癥傾向，血清GAD 抗體、IAA、ICA 陰性，先證者及受累者均未合并其他器官受累(非糖尿病腎病、胰腺發(fā)育不全等)的表現(xiàn)?；颊呱砀咻^同齡人偏低，但生長激素激發(fā)試驗正常。在后續(xù)隨訪中發(fā)現(xiàn)，患者僅經(jīng)單純飲食治療即可令血糖得到良好控制，血糖水平無進行性加重趨勢，身高及體質(zhì)量增加在正常范圍內(nèi)。

2.2 GCK 基因測序 該家系中連續(xù)三代中4 人均發(fā)現(xiàn)GCK 基因7 號外顯子上的c.1174 G ＞T 突變，均為雜合子突變，測序結(jié)果見圖2。該突變導(dǎo)致GCK 基因1 條單倍體7 號外顯子上的T 堿基變異為G 堿基，造成編碼甲硫氨酸變?yōu)榫彼?，查閱文獻該突變未經(jīng)報道。先證者符合MODY2 特點，另外3 名攜帶者中2位已診斷為糖尿病，另1 位突變攜帶者空腹血糖及糖化血紅蛋白均正常，余家系成員均未檢測出該突變。

圖2 GCK 基因測序結(jié)果

3 討論

臨床診斷MODY2 需要要符合以下條件:①年齡＜25 歲;②至少5 a 內(nèi)無需胰島素治療;③無酮癥傾向;④空腹血清C 肽≥0.3 nmol/L，葡萄糖刺激后水平≥0.6 nmol/L;⑤有3 代或3 代以上常染色體顯性遺傳史［5］。在該家系中，連續(xù)3 代均可見家系成員受累(糖尿病或空腹血糖受損)，符合常染色體遺傳模式，先證者和其他受累者無典型的“三多一少”癥狀，無酮癥傾向，經(jīng)單純飲食治療即可良好控制血糖，且血糖水平無進行性加重趨勢。這些臨床表現(xiàn)與MODY2 的臨床特征高度吻合，強烈提示MODY2 的可能。

葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)是一種己糖激酶(hexokinase)，葡萄糖在該酶的催化下轉(zhuǎn)變成6 -磷酸葡萄糖，是葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，人GCK 基因位于染色體7p15.3 ～15.1，由12 個外顯子構(gòu)成，編碼含465 個氨基酸殘基的蛋白［6］。GCK 主要在胰腺、肝臟和部分神經(jīng)元、腸細胞中表達，已證實GCK 是糖代謝通路的重要組成部分，在維持血糖穩(wěn)態(tài)過程中起關(guān)鍵作用。肝細胞和胰島β 細胞GCK 基因啟動子的差異導(dǎo)致其組織特異性表達和活性調(diào)節(jié)也有所不同。GCK 在胰島β 細胞中起著葡萄糖感受器的作用:空腹時GCK 處于失活狀態(tài)，進餐后血糖升高，激活β 細胞內(nèi)的GCK 并啟動葡萄糖分解代謝，產(chǎn)生大量ATP，觸發(fā)胰島素釋放入血，而在肝臟表達中表達的GCK 主要作用是促進葡萄糖在肝臟儲存為糖原［7-8］。

GCK 基因的雙等位突變可引起永久性新生兒糖尿?。?］，而雜合突變則引起GCK 酶活性部分下降，基礎(chǔ)血糖水平上升并發(fā)生MODY2［10］，在現(xiàn)實中雜合突變更為常見。根據(jù)以往對GCK 蛋白結(jié)構(gòu)的研究，現(xiàn)已明確GCK 的葡萄糖結(jié)合位點及ATP 結(jié)合位點［11］。葡萄糖結(jié)合位點的突變會降低酶催化活性，ATP 結(jié)合位點附近的突變將會導(dǎo)致ATP -Km 及催化率的改變，甚至失去與ATP 的協(xié)同性。GCK 基因c.1174 G ＞T突變造成編碼甲硫氨酸變?yōu)榫彼?M391R)，雖然該位點距離GCK 的活性中心(Thr168、Lys169、Asn204、Asp205、Asn231、Glu290)較遠［11］，但其為1 個錯義突變，不能排除其導(dǎo)致GCK 構(gòu)型改變而掩蓋酶活性部位，影響其酶活性的可能。

GCK/MODY2 突變者空腹高血糖通常是溫和的，即使不接受治療也很少發(fā)生微血管或大血管并發(fā)癥。在兒童期無需進行治療，且應(yīng)用口服降糖藥及胰島素的效果常不能達到預(yù)期，宜進行飲食控制。由于高血糖容易增加巨大兒和圍產(chǎn)期并發(fā)癥的風(fēng)險，故合并妊娠的患者可能需要胰島素治療，但對于母子均為MODY2 患者的情況，由于胎兒同樣對高血糖敏感性降低，故母親孕期應(yīng)用胰島素可能造成胎兒宮內(nèi)生長遲緩，此時母體血糖水平的控制應(yīng)以胎兒生長狀態(tài)確定［2］。將來GCK 激活劑類藥物也可用于治療MODY2。

本文報道了1 例由GCK 基因c.1174 G ＞T 突變導(dǎo)致的MODY2 家系，是河南省首例，該突變國內(nèi)外均未報道，是1 個新型的GCK 基因突變，該突變可能導(dǎo)致GCK 酶活性下降。盡管MODY 的分子生物學(xué)病因未完全闡釋清楚，但通過基因診斷測試可以檢出目前最流行的亞型，并指導(dǎo)最優(yōu)化治療——個體化治療，該措施能降低糖尿病患者的醫(yī)療成本，并將對其長期治療和遺傳咨詢帶來深遠影響。

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