道真玄參白絹病病原鑒定及殺菌劑毒力測定

陳婧+桑維鈞

摘要：通過對被侵染的道真玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）植株病癥、病狀的觀察，及白絹病病菌的培養(yǎng)性狀與菌落形態(tài)等的研究，結(jié)合ITS序列分析，最終確定該致病菌為整齊小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.），又名羅氏白絹小菌核菌。室內(nèi)殺菌劑抑菌試驗結(jié)果表明，10%多抗霉素對整齊小核菌有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：道真；玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）；整齊小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）；殺菌劑；毒力測定

中圖分類號：S432.4+4；S482.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5020-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.023

Identification and Fungicide Toxicity Determination of the Sclerotium rolfsii Sacc.

On Scrophularia ningpoensis Hemsl. In Daozhen

CHEN Jing， SANG Wei-jun

（College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract： Through observation symptoms of Daozhen figwort root （Scrophularia ningpoensis Hemsl.），and researching southern blight of pathogens to cultivate character and colony morphology， combined with ITS sequence analysis， finally the plant pathogenic bacteria was determined as Sclerotium rolfsii Sacc.， also known as roche white silk small sclerotium bacteria. The indoor bacteriostatic test results showed that polyoxins was the best inhabitant against S. rolfsii Sacc.

Key words： Daozhen； Scrophularia ningpoensis Hemsl.； Sclerotium rolfsii Sacc.； fungicide； toxicity determination

玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）是著名的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)疏》[1]。又稱元參、黑參、浙玄參，屬玄參科（Scrophulariaceae）多年生深根性草本藥用植物，以其干燥塊根入藥，味甘、苦、咸，性微寒，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效[2]。道真縣是貴州省玄參主要產(chǎn)區(qū)，常年種植面積達幾百公頃，生產(chǎn)的玄參以其有效成分含量高、品質(zhì)好、加工獨特而行銷國內(nèi)外。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，道真玄參種植基地常有玄參白絹病發(fā)生，對道真玄參的生產(chǎn)造成較大的影響。目前國內(nèi)外鮮見道真玄參白絹病防治的報道，為了有效防治該病害的發(fā)生及危害，本研究將微生物學(xué)和分子生物學(xué)rDNA-ITS序列分析鑒定結(jié)合起來，對該病病原菌種屬進行了較精確的定位，并篩選了幾種較新的殺菌劑對道真玄參白絹病菌菌絲體生長的影響進行試驗，旨在為生產(chǎn)中應(yīng)用殺菌劑防治白絹病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原物寄主為受害玄參標本，采集于貴州省道真縣陽溪鎮(zhèn)玄參種植基地。

供試試劑：DNA提取試劑盒，rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′）﹑ITS4（5′-TCCTCCGCTTAGATATGC-3′），2×Taq PCR MasterMix[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

供試藥劑：3%中生菌素可濕性粉劑（陜西標正作物科學(xué)有限公司），18.7%丙環(huán)·嘧菌酯乳懸劑（瑞士先正達作物保護有限公司），10%多抗霉素可濕性粉劑（山東神星藥業(yè)有限公司），20%乙酸銅可濕性粉劑（山東科大創(chuàng)業(yè)生物有限公司），0.3%丁子香酚可溶液劑（保定市亞達化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原物的分離培養(yǎng) 采用組織分離法。在感病變色處切取病健交界約5 mm的組織，用體積分數(shù)為70%的乙醇消毒5 s，再用0.1% HgCl2消毒2～4 min，移至滅菌水中漂洗3次以上，將其接至PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。后將病原菌進行3次純化，獲得純培養(yǎng)菌株。

1.2.2 病原物的培養(yǎng)性狀觀察 將純培養(yǎng)菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)、色澤，測量其生長速度以及菌核大小。用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、菌核剖面等，拍照保存，以供后續(xù)研究。

1.2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析 采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取該病原菌DNA，得到的DNA提取液用于PCR擴增。PCR反應(yīng)體系共25 μL：模版DNA 1 μL，ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）1 μL，ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）1 μL， ddH2O 9.5 μL，Taq PCR MasterMix 12.5 μL。RCR擴增反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。endprint

用1.2%瓊脂糖凝膠進行PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察﹑拍照。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離該擴增產(chǎn)物，在紫外燈的照射下，從凝膠中切取目的條帶，經(jīng)DNA片段回收試劑盒純化后，由北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。測得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，用Blast與已知序列進行同源性比對。根據(jù)同源性分析，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征，鑒定道真玄參白絹病病原菌歸屬。

1.2.4 室內(nèi)毒力測定 采用生長速率測定法。在培養(yǎng)皿中分別加入9 mL培養(yǎng)基，1 mL稀釋成不同濃度的殺菌劑，制成PDA含藥培養(yǎng)基，對照加無菌水，每個處理3次重復(fù)，待冷卻后接入白絹病菌菌餅（直徑5 mm），培養(yǎng)皿直徑為9 cm。將病原菌培養(yǎng)5 d后用十字交叉法分別測量每個培養(yǎng)皿中菌落的直徑，計算對病菌的相對抑制率。

抑制率=（對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%

本研究采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（武漢市蔬菜科學(xué)研究所﹑農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。該處理系統(tǒng)中，縱坐標由抑制率轉(zhuǎn)化成的抑制幾率值表示，橫坐標由藥劑濃度轉(zhuǎn)換的對數(shù)值表示，根據(jù)抑制率進行幾率值（y）與殺菌劑濃度對數(shù)值（x）之間的線性回歸關(guān)系分析，求得毒力回歸方程、抑制中濃度EC50及相關(guān)系數(shù)r[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)觀察

菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～6 d（25 ℃）后，形成具白色、羽毛狀菌絲的圓形菌落，菌絲疏松或集結(jié)成線形緊貼于基物上。培養(yǎng)11～12 d后形成菌核，菌核表生，球形或橢圓形，初白色，繼變淡褐色，最后變紅褐色，內(nèi)部灰白色，表面光滑，有光澤，直徑1～2 mm。根據(jù)菌落、菌絲、菌核的形態(tài)進行初步鑒定， 確定其符合整齊小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）的形態(tài)特征[4，5]。

2.2 病原菌rDNA-ITS 序列分析

將病原菌基因組DNA經(jīng)通用引物ITS1-ITS4進行擴增，得到689個堿基，測序后得到其基因序列如下：

TTCTTGAAAAAGCAGGCTAGTTATCGTCGAGGTCA

ATGGTCAATATATGCACTTATATGCTAGATATATG

CGCATGATTTTATAAGTAGTGCATAAAGCTAGAAT

CCCCTTCGGGTTTGGGCGTAAACTTTTATCCCCCCA

CCCGTAGGCTTTTCTACTTGTCCAACTAATATTTTT

AAAAAAAGCCAGTCAAAATATACTCTAACCAGCT

CCTCTCTCATCCAAGCCTTGAAAAATACAAAAATT

TGTGAGGTTGATAATTTGATGACTCTCAAACAGGG

ATGCCCCTCGGAATACCAGGGGGCGGGAGGTGCG

TTCAAAGATTCGATGATTCGCTGGATTCTGCAATT

CTTATTACTTATCGCATTTCGCTGCTTCTTCATCGA

TGCAAGAGCCAAAACATCCGTTGTTGAAAGTTGTT

TATTTTTTAATTAAAAAAAACTTGAAAAAAACAAA

GTTTCAATATAAAATCGTTCTATGTAACATACAAT

AAAAGTTATATAGGGAGATCATAGTTAGAATTTCT

CCTGACTACAGTTGGTTCACAGGGGTATATATAA

TATAGCTCCAAAGGGTGCACATGCAATATTCATTA

CCACCACACCTCCTTCGCATATATAAATTCAATAA

TGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGT

TACATTTTTTTTTTTTCCAA

將基因序列用GenBank數(shù)據(jù)庫中的Blast功能進行比對分析，結(jié)果顯示，與Athelia rolfsii（GenBank accession：JN017199.1）的ITS序列的同源性最高，達到95%。

根據(jù)病原菌的微生物形態(tài)特征和ITS序列同源性比較結(jié)果，確認道真玄參白絹病的病原為整齊小核菌的有性態(tài)A. rolfsii。

2.3 室內(nèi)毒力測定

室內(nèi)毒力測定結(jié)果（表1）表明，5種供試殺菌劑對菌絲生長的抑制作用與藥劑濃度均呈正相關(guān)，其中18.7%丙環(huán)·嘧菌酯、0.3%丁子香酚、10%多抗霉素對病菌有明顯的抑制作用，其EC50分別為1.179 3、0.337 0、0.024 6 μg/mL，10%多抗霉素對整齊小核菌菌絲的抑制效果最好。

3 小結(jié)與討論

整齊小核菌作為一種常見植物病原真菌，通常僅依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征進行病原菌種屬鑒定。但有學(xué)者認為僅根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進行菌種的鑒定與分類會出現(xiàn)不精確現(xiàn)象[6]。本研究在傳統(tǒng)微生物形態(tài)學(xué)特征的基礎(chǔ)上，同時進行貴州省道真玄參白絹病病原菌的rDNA-ITS序列分析和比對，從分子水平上的進一步鑒定結(jié)果可知，引起道真玄參白絹病的病原菌為整齊小核菌。試驗表明，18.7%丙環(huán)·嘧菌酯、0.3%丁子香酚、10%多抗霉素對道真玄參白絹病菌均有明顯的抑菌效果，抑制效果最好的為10%多抗霉素。本試驗結(jié)果為進一步進行該病害的防治研究提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] 明·繆希雍.神農(nóng)本草經(jīng)疏[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[3] 陶挺燕，何 凡，范鴻雁，等.幾種殺菌劑對荔枝霜疫霉病的室內(nèi)毒力測定[J].農(nóng)藥，2010，49（1）：72-73.

[4] 張中義，冷懷瓊，張志銘，等.植物病原真菌學(xué)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1988.

[5] 陸家云.植物病原真菌學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[6] 朱桂寧，蔡健和，胡春錦，等.廣西山藥炭疽病病原菌的鑒定與ITS序列分析[J].植物病理學(xué)報，2007，37（6）：572-577.endprint