釀酒酵母蛋白提取工藝優(yōu)化

岳紅衛(wèi)，韓富亮

（西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌712100）

釀酒酵母蛋白提取工藝優(yōu)化

岳紅衛(wèi)，韓富亮*

（西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌712100）

采用響應面法優(yōu)化酵母蛋白提取工藝，實驗結(jié)果表明，酵母蛋白最佳提取方法為0.1%NaCl、0.97%NaOH、2.0%十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.77%曲拉通X-100。在此條件下，酵母蛋白提取的理論值為168.68 mg/g（干重），實際提取量為147.57 mg/g（干重），占干酵母質(zhì)量的14.76%。四溶劑復合法可有效提取酵母蛋白，為提取酵母蛋白提供了方法基礎。

釀酒酵母，蛋白，提取，響應面設計

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）含有豐富的蛋白，其常用的提取方法有堿法、酶法、超聲波輔助法、凍融法、鹽熱法、堿熱法、鹽法、自溶法、離子萃取法和高壓脈沖電場法等［1-11］。這些方法各有利弊，單一方法的蛋白提取率均較低。

目前，酵母蛋白的提取主要采用復合法［12］。例如，采用表面活性劑吐溫80和超聲波輔助提取啤酒酵母蛋白，酵母粗蛋白的產(chǎn)率為0.106 mg/mL［13］；采用超聲波法、凍融法、鹽熱法和堿熱法四種方法提取啤酒廢酵母蛋白質(zhì)，其粗蛋白質(zhì)的提取率分別為3.47%、4.15%、5.66%和22.81%［14］；采用超聲波和酶法從白葡萄酒廢酵母中提取蛋白質(zhì)，其提取液中的蛋白質(zhì)含量可達9.8 g/L［5］；采用誘導劑+自溶+酶法從啤酒廢酵母中提取蛋白的提取得率為27%［7］。由于蛋白提取效率的表征方法不同，這些研究結(jié)果不具有可比性。

酵母細胞蛋白的提取涉及蛋白的釋放（細胞破壁）和蛋白的溶解兩個過程［15-16］。氯化鈉和氫氧化鈉是常用的細胞破壁劑和蛋白溶解劑，十二烷基硫酸鈉（SDS）和曲拉通X-100（Triton X-100）是蛋白提取常用的增容劑。二喹啉甲酸法（BCA）法是優(yōu)越的蛋白定量分析方法之一，試劑配制簡單、操作方便、反應產(chǎn)物穩(wěn)定、檢測靈敏度高、線性范圍寬，受蛋白標準品的影響較小［17］。BCA法對氯化鈉、氫氧化鈉、SDS和Triton X-100等蛋白提取溶劑有較高的耐受性［18-21］。因此，擬采用復合提取法，即采用鹽法、堿法和表面活性劑（離子型和非離子型）法提取酵母蛋白，BCA法定量分析蛋白，利用響應面法優(yōu)化酵母蛋白的提取工藝，為其進一步研究提供方法基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

釀酒酵母安琪酵母股份有限公司（宜昌）；Tween 80、麥角固醇、YNB、SDS、Triton X-100、二喹啉甲酸二鈉鹽（BCA）、牛血清蛋白Sigma公司（上海）。所有試劑為分析純。

UV-2450型紫外分光光度計日本島津公司；BPH-9042型恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋國華電器有限公司。

1.2模擬葡萄汁發(fā)酵

葡萄汁中含有一定量的蛋白，對實驗的結(jié)果可能會造成一定的影響。因此，配制含有酵母生長繁殖所需的氮源但不含有蛋白的模擬葡萄汁進行實驗。模擬葡萄汁配制參考Dennis等方法［22］。主要配方為果糖和葡萄糖各120 g、蘋果酸5 g、酒石酸5 g、檸檬酸0.2 g、麥角甾醇15 mg、煙酸2 mg、氯化銨0.3 mg、20種氨基酸混合液和酵母無氨基氮源（YNB）等。稱取酵母1 g，添加到含糖量5%的水中，在37℃恒溫水浴鍋內(nèi)活化20 min。將活化好的酵母倒入模擬葡萄汁中，放置于27℃的酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在酵母生長的穩(wěn)定期，離心收集酵母細胞。

1.3酵母蛋白的提取

1.3.1蛋白測定方法參考韓富亮等方法，采用BCA法測定蛋白含量［17］。其配制方法為A液：BCANa21 g、Na2CO3·H2O 2 g、酒石酸鈉0.16 g、NaOH 0.4 g、NaHCO30.95 g溶于80 mL水中，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至11.25，定容至100 mL。B液：CuSO4·5H2O 4 g，加水定容至100mL。測定時取A液100體積與B液2體積混合，配制成工作液。取BSA標準品適量配制成1 mg/mL的標準蛋白溶液，配制一系列蛋白濃度梯度繪制標準曲線。取樣品溶液0.1 mL與工作液2.0 mL混合，37℃保溫30 min，于562 nm處測定吸光度A，根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白的濃度。標準曲線方程為y= 0.788X+0.020（R2=0.997）。

1.3.2單因素提取實驗在酵母生長的穩(wěn)定期（4.8× 109cfu），離心（10000 r/min，10 min）收集酵母，氮氣吹干。液氮研磨15 min，烘箱烘干。取5 mL離心管，分別稱取0.2 g干酵母，考察0%、0.1%、0.5%、1%、2%、4%（w/v，去離子水）濃度梯度的NaCl、NaOH、SDS、Triton X-100對蛋白提取的影響。提取方法的其他因素設定為料液比1∶3，提取2 h，共提取3次。合并提取液，測定蛋白含量。實驗重復2次。

1.3.3響應面設計在單因素實驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設計原理，選取NaCl、NaOH、SDS和Triton X-100四因素三水平（表1）的響應面設計，優(yōu)化酵母蛋白提取工藝。

表1　酵母蛋白提取響應面設計Table 1　Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.4數(shù)據(jù)分析

單因素實驗采用SPSS 17.0進行方差（ANOVA）分析（LSD法），響應面設計與分析采用Design Expert 7.0軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1NaCl添加量對酵母蛋白提取的影響

由圖1可以看出，氯化鈉法提取蛋白含量在60～70 mg/g（干重）。不同氯化鈉添加量處理之間的蛋白提取量差異不顯著（p＞0.05）。這表明酵母蛋白的親水性和電荷可能受氯化鈉離子強度的影響較小［23-24］。因此，在氯化鈉低添加量和高添加量處理的蛋白含量差異不顯著。在多因素實驗中，氯化鈉可能具有交互作用。在響應面實驗中，選取氯化鈉并設置添加量0.1%～1%。

圖1　NaCl添加量對酵母蛋白提取的影響Fig.1　Effect of NaCl on protein extraction from yeast

2.2NaOH添加量對酵母蛋白提取的影響

由圖2可以看出，氫氧化鈉法提取蛋白含量為60～107 mg/g（干重）。隨著氫氧化鈉添加量的增加，蛋白提取量增加到100 mg/g以上。因為隨氫氧化鈉添加量的增加，pH增加，蛋白質(zhì)與水之間的相互作用力增強，蛋白溶解度提高［25］。當氫氧化鈉添加量增加到2%，溶液的pH與蛋白的等電點相等，使得蛋白的溶解度降低。當添加量繼續(xù)增加，溶液的pH與蛋白的等電點不再相等，蛋白的溶解度增加［24］。雖然在2%氫氧化鈉處理的蛋白含量下降，但是與0.5%和1%處理之間差異不顯著（圖2）。方差分析表明，0.1%處理與對照差異不顯著；0.1%、0.5%、1%和2%處理間差異不顯著；0.5%、1%和4%處理間差異不顯著。在響應面實驗中，氫氧化鈉添加量選取0.1%～1%。

圖2　NaOH添加量對酵母蛋白提取的影響Fig.2　Effect of NaOH on protein extraction from yeast

2.3SDS添加量對酵母蛋白提取的影響

由圖3可以看出，SDS法提取蛋白含量為60～82 mg/g（干重）。隨著SDS添加量的增加，蛋白提取量有增加的趨勢。這可能是因為SDS在蛋白提取過程中可以抑制酵母內(nèi)源蛋白酶對蛋白的酶解［15，26］。但是方差分析（圖3）表明，4%處理顯著高于對照（0%）和0.1%處理，0.5%、1%、2%和4%處理之間差異不顯著。BCA法測定蛋白對SDS具有一定的耐受性。濃度過高，可能影響B(tài)CA定量蛋白的準確性。因此，在響應面實驗中，SDS添加量選取0.5～2%。

圖3　SDS添加量對酵母蛋白提取的影響Fig.3　Effect of SDS on protein extraction from yeast

2.4Triton X-100添加量對酵母蛋白提取的影響

由圖4可以看出，Triton X-100法提取蛋白含量為75～85 mg/g（干重）。隨著Triton X-100添加量的增加，蛋白提取量稍有增加，隨后又略有下降。Triton X-100是非離子型表面活性劑，在蛋白提取過程中有穩(wěn)定和增溶膜蛋白的作用［27-28］。但是方差分析（圖4）表明，不同處理間的蛋白提取量差異不顯著。因此，Triton X-100在0.1%～4%的添加量范圍內(nèi)對酵母蛋白的提取無顯著影響。考慮BCA法對曲拉通X-100的耐受性，以及在多因素提取中可能存在的交互效應，在響應面實驗中，曲拉通X-100的添加量選取0.1%～1%。

圖4　Triton X-100添加量對酵母蛋白提取的影響Fig.4　Effect of Triton X-100 on protein extraction from yeast

2.5Box-Behnken響應面實驗

2.5.1回歸模型的建立根據(jù)響應面設計，得到29組實驗結(jié)果（表2）。采用Design Expert 7.0軟件，對其進行響應面分析，得到回歸模型：

表2　酵母蛋白提取響應面分析設計與結(jié)果Table 2　Experimental design and results for response surface analysis

2.5.2響應面二次模型的方差分析由表3可知，模型極顯著（p＜0.01），說明該模型具有統(tǒng)計學意義。模擬方程的決定系數(shù)R2=0.8819，說明因變量與自變量之間呈高度相關。失擬項不顯著（p＞0.05），表明擬合程度較好，實驗擬合的二次回歸方程可較好地對響應值進行預測。由該模型的方差分析結(jié)果表明，A、B、C、B2對Q值的影響極顯著（p＜0.01）；交互項均不顯著（p＞0.05），無統(tǒng)計學差異。在所選擇的實驗范圍內(nèi)，由F值的大小可以推斷，四個因素影響酵母蛋白提取的大小排序為NaOH＞NaCl＞SDS＞Triton X-100。

根據(jù)a=0.05的顯著水平剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為：

2.5.3響應面分析優(yōu)化由圖5可以看出，隨著NaOH和SDS添加量的增加，從酵母中提取的蛋白含量增加。但當因素水平進一步增加，從酵母中提取的蛋白含量有下降的趨勢。而隨著NaCl和Triton X-100添加量的增加，從酵母中提取的蛋白含量有下降的趨勢。從響應面坡度的陡峭度可以看出各因素之間交互作用的強弱。但是從等高線圖可以看出，各因素之間的交互作用不顯著。利用Design Expert 7.0軟件，分析蛋白提取量的極大值點及對應的因素水平，得到最佳提取方法為0.1%NaCl、0.97%NaOH、2.0%SDS和0.77%Triton X-100，此時酵母蛋白提取量理論預測值為168.68 mg/g（干重）。

2.5.4響應面分析驗證根據(jù)上述優(yōu)化出的提取工藝0.1%NaCl，0.97%NaOH，2.0%SDS，0.77%Triton X-100，驗證Box-Behnken實驗設計所得結(jié)果的可靠性。實驗測得酵母蛋白提取量為147.57 mg/g（干重），與理論值的相對誤差為12.5%。因為擬合方程的決定系數(shù)為0.8819，因此其相對誤差較高。但是擬合方程具有統(tǒng)計學意義，表明數(shù)學模型優(yōu)化的酵母蛋白提取方法可行［29-30］。

表3　回歸模型的方差分析Table 3　Analysis of variance for the regression equation

圖5　各因素交互作用響應曲面圖Fig.5　The response surface of interaction between factors

3　結(jié)論

響應面實驗結(jié)果表明，四個因素對酵母蛋白提取的影響為NaOH＞NaCl＞SDS＞Triton X-100。最佳提取工藝為0.1%NaCl、0.97%NaOH、2.0%SDS和0.77% Triton X-100。在此條件下，蛋白實際提取量可達147.57 mg/g（干重），占干酵母重的14.76%。復合提取法可有效提取酵母蛋白，為酵母蛋白的進一步研究提供了方法基礎。實驗優(yōu)化了氯化鈉、氫氧化鈉、SDS和曲拉通X-100提取酵母蛋白的最佳比例，下一步應考察其他提取因素（例如料液比、提取溫度、時間和提取次數(shù)等）對蛋白提取的影響。

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Optimization of protein extraction from Saccharomyces cerevisiae

YUE Hong-wei，HAN Fu-liang*
（College of Enology，Northwest A&F University，Yangling 712100，China）

The response surface analysis was employed to optimize the protein extraction from yeast.The results showed that the best protein extraction conditions were 0.1%NaCl，0.97%NaOH，2.0%SDS and 0.77%Triton X-100.Under the condition，the maximum theoretical concentration of protein extraction was 168.68 mg/g，the actual concentration was 147.57 mg/g which accounted for 14.76%of dry yeast weight.This method could extract protein effectively and provide a support for yeast protein extraction.

Saccharomyces cerevisiae；protein；extraction；response surface design

TS261.9

B

1002-0306（2015）16-0304-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.053

2015－01－04

岳紅衛(wèi)（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)，E-mail：yhwflier@163.com。

韓富亮（1979-），男，博士，講師，研究方向：食品營養(yǎng)，E-mail：hanfl@nwsuaf.edu.cn。

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD31B07）；西北農(nóng)林科技大學基本科研創(chuàng)新一般項目（Z109021202）。