響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取工藝條件

李　　潁，楊　　婷，?！　∠迹n舜愈，楊學(xué)山

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄酒泥酵母甘露聚糖提取工藝條件

李潁1，楊婷1，祝霞1，韓舜愈1，楊學(xué)山2，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

目的：優(yōu)化熱水浸提法提取葡萄酒泥酵母甘露聚糖工藝條件。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對影響熱水浸提甘露聚糖的主要因素進(jìn)行研究。結(jié)果：熱水浸提法提取葡萄酒泥酵母甘露聚糖的最佳工藝條件為料液比1∶23（g/mL），浸提溫度124℃，浸提時間5 h，浸提次數(shù)3次。在此條件下甘露聚糖得率為14.27%，提取效果最佳。結(jié)論：此方法綠色環(huán)保，成本低，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

葡萄酒泥酵母，甘露聚糖，熱水浸提，得率

隨著葡萄酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，葡萄酒副產(chǎn)物的資源化開發(fā)利用已引起高度關(guān)注［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)每生產(chǎn)100 kL葡萄酒，大約形成2.5～4.0 t葡萄酒泥酵母［2-3］。葡萄酒泥酵母含有豐富的甘露聚糖，占酵母細(xì)胞壁干重的35%～45%［4］。甘露聚糖是動物機(jī)體發(fā)揮細(xì)胞免疫和體液免疫的有效誘導(dǎo)物［5］，具有結(jié)合外源性病原體、抗腫瘤、抗輻射等功效［6］，并能作為抗氧化劑來阻斷自由基的氧化損傷［7-8］。此外，酵母甘露聚糖應(yīng)用于葡萄酒中可以起到穩(wěn)定酒石、蛋白質(zhì)，提高氣味和口感，提升葡萄酒品質(zhì)，是一種極具開發(fā)潛力的多糖［9-11］。

利用葡萄酒泥酵母開發(fā)甘露聚糖，不僅可以大大降低原料生產(chǎn)成本，而且可保護(hù)生態(tài)環(huán)境，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。傳統(tǒng)制備酵母多糖的方法主要以全細(xì)胞為原料，不僅酸堿用量大、污染環(huán)境，而且會引起多糖降解，影響其生理活性［12］。本實(shí)驗(yàn)以誘導(dǎo)自溶后的酵母細(xì)胞壁為原料，采用清潔、安全、操作簡單、易工業(yè)化生產(chǎn)的高溫?zé)崴岱ㄖ苽浣湍父事毒厶?，以甘露聚糖得率為評價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面法優(yōu)化甘露聚糖提取工藝，旨在為開發(fā)利用葡萄酒泥酵母甘露聚糖提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄酒酵母泥甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司；甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%；醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、三氯乙酸、無水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、硼酸均為分析純。

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；TDZ5-WS型湘儀離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SL-1001型電子天平上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)上海雷磁有限公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程葡萄酒泥→預(yù)處理→誘導(dǎo)自溶→熱水浸提→脫蛋白→乙醇醇析（室溫下2倍體積乙醇醇沉12 h）→丙酮、乙醚洗滌（2次）→干燥（60℃干燥10 h）→成品。

操作要點(diǎn)：

葡萄酒泥的預(yù)處理：收集葡萄酒酒泥，與蒸餾水以1∶1混合，用80目篩篩分，4000 r/min離心15 min。重復(fù)上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無色透明為止，收集濕酵母備用［13］。

自溶：取5.0 g酵母懸浮于30 mL添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%NaCl、pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，47.5℃誘導(dǎo)自溶33 h。

提?。鹤匀芎?000 r/min離心15 min獲得酵母細(xì)胞壁，稱取2.5 g細(xì)胞壁，添加蒸餾水配成不同的料液比，并在不同的溫度及時間下浸提不同次數(shù)。

脫蛋白：向提取后獲得的含有甘露聚糖的上清液中加入質(zhì)量濃度9%的三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為3，4℃靜置12 h，以除去其中的蛋白質(zhì)［14］。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別對浸提溫度、浸提時間、料液比、浸提次數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。以甘露聚糖成品得率為評價(jià)指標(biāo)，為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選擇因素水平。

1.2.2.1浸提溫度對甘露聚糖得率的影響取5份各2.5 g酵母自溶后細(xì)胞壁，添加蒸餾水配成料液比為1∶25（g/mL）的懸浮液，分別于85、95、105、115、125℃（高于100℃時用高壓滅菌鍋實(shí)現(xiàn)）下浸提4 h，4000 r/min離心15 min后沉淀再次在相同條件下提?。缓喜纱紊锨逡?，用三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為3，4℃靜置12 h后，4000 r/min離心15 min脫蛋白，向上清液中加入2倍體積無水乙醇醇沉12 h，4000 r/min離心15 min取沉淀，分別用20 mL丙酮、乙醚洗滌2次，每次15 min；60℃干燥得甘露聚糖成品。取20 mg樣品進(jìn)行甘露聚糖質(zhì)量濃度的測定。

1.2.2.2浸提時間對甘露聚糖得率的影響取5份各2.5 g酵母自溶后細(xì)胞壁，添加蒸餾水配成料液比為1∶25（g/mL）的懸浮液，于115℃下分別浸提2、3、4、5、6 h；后續(xù)步驟同1.2.2.1，取20 mg樣品進(jìn)行甘露聚糖質(zhì)量濃度的測定。

1.2.2.3料液比對甘露聚糖得率的影響取5份各2.5 g酵母自溶后細(xì)胞壁，添加蒸餾水配成料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）的懸浮液，于115℃下高溫浸提4 h；后續(xù)步驟同1.2.2.1，取20 mg樣品進(jìn)行甘露聚糖質(zhì)量濃度的測定。

1.2.2.4浸提次數(shù)對甘露聚糖得率的影響取5份各2.5 g酵母自溶后細(xì)胞壁，添加蒸餾水配成料液比為1∶20（g/mL）的懸浮液，于115℃下浸提4 h，分別提取1、2、3、4、5次；后續(xù)步驟同1.2.2.1，取20 mg樣品進(jìn)行甘露聚糖質(zhì)量濃度的測定。

1.2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以甘露聚糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化提取條件。

表1　響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Levels and factors for the response surface optimization test

1.2.4甘露聚糖含量測定方法采用紫外分光光度法［15］。

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)［16］的方法，準(zhǔn)確配制甘露糖質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、150、175、200 μg/mL的系列溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2樣品處理稱取20 mg左右的酵母甘露聚糖，不斷碾磨使其溶解于2.5 mL 72%H2SO4中，室溫放置3 h，加蒸餾水使硫酸的最終濃度為4 mol/L，然后100℃酸水解4 h，取出冷卻至室溫，用NaOH調(diào)pH至中性，再用0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液定容至100 mL并搖勻［16］。

1.2.4.3樣品甘露聚糖質(zhì)量濃度的測定吸取0.2 mL樣液，按1.2.4.1步驟操作在280 nm處測吸光值，求得△OD，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甘露糖質(zhì)量濃度，最終得出甘露聚糖質(zhì)量。

1.2.5甘露聚糖得率的計(jì)算

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品，紫外分光光度法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0013x+ 0.0021（y為△OD；x為甘露糖質(zhì)量濃度，μg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.9974。

2.2單因素結(jié)果與分析

2.2.1浸提溫度對甘露聚糖得率的影響由圖2可知，在115℃時，甘露聚糖得率達(dá)到最大值9.38%，所以選擇115℃為提取甘露聚糖的較佳溫度。當(dāng)溫度小于115℃時，甘露聚糖得率隨溫度的升高幾乎呈直線上升，說明溫度對甘露聚糖的提取影響明顯。在溫度較低時，很難誘發(fā)酵母細(xì)胞壁上化學(xué)鍵的充分?jǐn)嗔?，影響甘露聚糖的提??；?dāng)溫度高于115℃時，得率有輕微下降，可能是由于溫度過高，破壞了糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致甘露聚糖得率下降。

2.2.2浸提時間對甘露聚糖得率的影響由圖3可知，浸提時間為4 h時，甘露聚糖得率最大，達(dá)到9.81%，因此選擇4 h為提取甘露聚糖的較佳時間。當(dāng)浸提時間大于或小于4 h時，都會使甘露聚糖得率下降，造成該結(jié)果可能是由于時間較短時，反應(yīng)不充分，提取不徹底；時間過長，導(dǎo)致甘露聚糖降解，得率降低。

圖1　甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of mannose

圖2　浸提溫度對甘露聚糖得率的影響Fig.2　Effect of different temperature on the yield of mannan

圖3　浸提時間對甘露聚糖得率的影響Fig.3　Effect of different time on the yield of mannan

2.2.3料液比對甘露聚糖得率的影響由圖4可知，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時，甘露聚糖得率最大，達(dá)到10.08%，所以1∶20（g/mL）為熱水浸提甘露聚糖的較佳料液比。料液比小于1∶20（g/mL）時，甘露聚糖得率呈上升趨勢，根據(jù)固液萃取基本理論，溶劑的增多，有利于溶質(zhì)的析出。但過大的料液比不僅增加了水的消耗，而且容易導(dǎo)致后續(xù)處理過程中溶質(zhì)的丟失。

圖4　料液比對甘露聚糖得率的影響Fig.4　Effect of different solid-liquid ratio on the yield of mannan

2.2.4浸提次數(shù)對甘露聚糖得率的影響由圖5可知，浸提次數(shù)為2次時，甘露聚糖得率最大，達(dá)到10.34%，提取效果最好，所以選擇2次為提取的較佳浸提次數(shù)。當(dāng)浸提次數(shù)小于2次時，提取不徹底，甘露聚糖尚未完全溶于浸提液中；當(dāng)浸提次數(shù)大于2次時，盡管總糖量有所增加，但所測總糖中甘露聚糖的含量卻是降低的，究其原因，可能是高溫長時間的處理過程導(dǎo)致甘露聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞，最終使獲得的甘露聚糖得率下降。

圖5　浸提次數(shù)對甘露聚糖得率的影響Fig.5　Effect of different extraction times on the yield of mannan

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1回歸模型的確定利用Design-Expert 7.0軟件對表2進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合實(shí)驗(yàn)和方差分析，反映料液比、浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)對甘露聚糖得率的影響，擬合所得多元二次回歸方程如下：

Y=-253.0546+3.5787X1+4.7001X2+16.3074X3-18.4378X4-6.5000X1X2+0.0665X1X3-0.0165X1X4+ 0.0198X2X3+0.1803X2X4+1.3050X3X4-0.0922X12-0.0211X22-2.7403X32-1.2553X42

該方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.9785，響應(yīng)變量R2為0.9571，因此，可以充分描述獨(dú)立變量對甘露聚糖得率的影響。該模型prob（P）＞F值為0.0001，模型極顯著，模型擬合程度良好。

2.3.2回歸方程的方差分析由表3可以看出，甘露聚糖得率方程的一次項(xiàng)（除X1外）和二次項(xiàng)極其顯著（p＜0.01），說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。交互項(xiàng)X2X4、X3X4極其顯著（p＜0.01），說明X2和X4，X3和X4之間的交互作用極顯著，整個響應(yīng)面基于各因素間的交互作用構(gòu)成。另外，模型的變異系數(shù)C.V.為9.84%，證明回歸方程擬合程度較好，說明實(shí)驗(yàn)具有很高的可信性和準(zhǔn)確性。失擬項(xiàng)不顯著，說明實(shí)驗(yàn)的誤差很小。

各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映各因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。從方差分析表可知各因素對甘露聚糖得率的影響程度大小順序?yàn)椋航釡囟龋窘岽螖?shù)＞浸提時間＞料液比。

2.3.3各因素之間的交互作用根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)面分析圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，反映料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提次數(shù)對響應(yīng)值的影響。觀察曲面的傾斜度確定兩因素對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，說明兩者交互作用越顯著。

表2　Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of Box-Behnken response surface experiments

表3　回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 3　Variance analysis for each item of the regression equation

由圖6及回歸方程方差分析可知，因素X2與X4，X3與X4交互作用顯著，而X1與X2、X1與X3、X1與X4及X2與X3之間的交互作用不顯著。

2.3.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析由響應(yīng)曲面圖以及回歸方程分析可知，熱水浸提法提取葡萄酒泥酵母甘露聚糖的最佳工藝條件為料液比1∶22.6（g/mL），浸提溫度123.84℃，浸提時間4.98 h，浸提次數(shù)2.63次。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件提取酵母甘露聚糖，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為料液比1∶23（g/mL），浸提溫度124℃，浸提時間5 h，浸提次數(shù)3次。按上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，重復(fù)3次實(shí)際測得的甘露聚糖的得率分別為13.93%、14.63%、14.25%，平均得率為14.27%，與理論預(yù)測值（14.00%）相比，其相對誤差約為1.86%。說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提法對葡萄酒泥酵母甘露聚糖進(jìn)行提取，通過單因素實(shí)驗(yàn)及Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理以及響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬合了料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提次數(shù)4因素對甘露聚糖得率的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，能較好的預(yù)測葡萄酒泥酵母中甘露聚糖的得率。由該模型確定的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶23（g/mL），浸提溫度124℃，浸提時間5 h，浸提次數(shù)3次，在此條件下獲得的甘露聚糖得率最大，達(dá)14.27%。通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到各因素對甘露聚糖得率的影響大小順序?yàn)榻釡囟龋窘岽螖?shù)＞浸提時間＞料液比。

圖6　料液比、浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)對甘露聚糖得率影響的響應(yīng)面Fig.6　Effect of response surface of solid-liquid ratio，extraction temperature，time and times on the yield of mannan

［1］張斌，張福慶，鄭鶴齡.紅葡萄酒“酒腳”的綜合開發(fā)利用［J］.中國葡萄與葡萄酒，2006（4）：48.

［2］鄭鶴齡，張斌，潘潔，等.葡萄酒泥農(nóng)業(yè)應(yīng)用效果研究［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，12（3）：47-48.

［3］李瑩，蘇婷婷，王戰(zhàn)勇.葡萄加工副產(chǎn)品的綜合利用研究［J］.食品科學(xué)，2012，28（4）：106-108.

［4］周義發(fā)，張翼伸，梁忠?guī)r.酵母甘露聚糖的結(jié)構(gòu)確定與核磁共振譜的解析［J］.生物化學(xué)雜志，1991，7（1）：74-78.

［5］LIU H Z，WANG Q，LIU Y Y，et al.Statistical optimization of culture media and conditions for production of mannan by Saccharomycescerevisiae［J］.BiotechnologyandBioprocess Engineering，2009，14（5）：577-583.

［6］高松.改性魔芋葡甘露聚糖硫酸酯的制備及其性能研究［D］.武漢：武漢理工大學(xué)，2012.

［7］MACHOVA E，BYSTRICKY S.Antioxidant capacities of mannans and glucans are related to their susceptibility of free radical degradation［J］.International journal of biological macromolecules，2013，61：308-311.

［8］KRIZKOVA L，ZITNANOVA I，MISLOVICOVA D，et al. Antioxidantandantimutagenicactivityofmannan neoglycoconjugates：mannan-human serum albumin and mannanpenicillin G acylase［J］.Mutation Research，2006，60（1）：72-79.

［9］李華.多糖對葡萄酒香氣及酒石穩(wěn)定的作用［J］.釀酒，2000，5（14）：64-66.

［10］李華，楊新元，胡博然，等.酵母甘露糖蛋白對葡萄酒酒石穩(wěn)定性影響的研究［J］.食品科學(xué)，2003，24（10）：104-107.

［11］楊新元，李華，劉樹文，等.酵母甘露糖蛋白對白葡萄酒酒石和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，6：26.

［12］劉紅芝，王強(qiáng)，周素梅.酵母甘露聚糖分離提取及功能活性研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2008，29（5）：465-468.

［13］杜娜，楊學(xué)山，韓舜愈，等.葡萄酒泥酵母SOD分離提取工藝條件優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（15）：242-245.

［14］Huang G L，Yang Q，Wang Z B.Extraction and deproteinization of mannan oligosaccharides［J］.Z Naturforsch C，2010，65（5）：387-390.

［15］張運(yùn)濤，谷文英.紫外分光光度法測定啤酒酵母中甘露糖［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25（5）：32-36.

［16］STEFAN F，SANDRO J，EVA A，et al.Optimised quantification method for yeast-derived 1，3-β-D-glucan and α-D-mannan［J］.Eur Food Res Technol，2005，220（1）：101-105.

Optimization of extraction conditions of mannan from waste wine yeast by response surface methodology

LI Ying1，YANG Ting1，ZHU Xia1，HAN Shun-yu1，YANG Xue-shan2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Life Science&Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Objective：To optimizing process condition of mannan from waste wine yeast by hot water extraction. Method：The main factors affecting mannan yield were studied by using Box-Behnken experimental design based in single factor experiments.Result：The results showed that the optimal conditions were：solid-liquid ratio 1∶23（g/mL），extracting temperature 124℃，extracting time 5 h，extracting times 3.Under these conditions，the yield of mannan reached 14.27%and the effect of extracting was the best.Concultion：This method was green，beneficial for environmental protection，inexpensive and applied to industrialized production.

wine yeast；mannan；hot water extraction；yield

TS209

B

1002-0306（2015）16-0294-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.051

2014－12－05

李潁（1988-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及利用，E-mail：liying@163.com。

楊學(xué)山（1977-），男，副教授，研究方向：生物化學(xué)與生物產(chǎn)品研發(fā)，E-mail：yangxs@gsau.edu.cn。

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2013-21）。