草魚肝胰中CPIs初步分離鑒定及其活性測定

蔣然然，梁　宇，陳治光，楊　錦，李　新，但　靜，李　冉，鐘海霞，李美良，李樹紅

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

草魚肝胰中CPIs初步分離鑒定及其活性測定

蔣然然，梁宇，陳治光，楊錦，李新，但靜，李冉，鐘海霞，李美良，李樹紅*

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

首先比較了偶氮酪蛋白（Azocasein）法和熒光合成肽底物法，在監(jiān)測草魚肝胰半胱氨酸蛋白酶抑制劑CPIs（cysteine proteinase inhibitors）活性時的適用性。進而通過凝膠過濾高效液相色譜法、反相酶譜和免疫印跡法，對草魚肝胰中CPIs的分子量分布及可能的家族類型進行定性鑒定。結果表明在粗提液中加入絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑（40 mmol/L PMSF或0.4 mmol/L Pefabloc SC），或經(jīng)90℃加熱5 min，僅熒光合成肽底物法可準確地監(jiān)測到CPIs活性的變化。液相色譜結果顯示，草魚肝胰中存在分子量（98、26、12、5～1 ku）不同的CPIs活性部分。但反相酶譜法僅能夠判斷其中大于20 ku的CPIs。而免疫印跡法證明存在約12 ku的Cystatin（家族II）類型CPIs，發(fā)現(xiàn)小于12 ku的顯色條帶，可能是該蛋白降解形成的低分子量的活性片段。

草魚肝胰，半胱氨酸蛋白酶抑制因子，活性測定，分子量分布，分離鑒定

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國主要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚種之一，年產(chǎn)量478萬噸，位居全國淡水養(yǎng)殖的第二位［1］。其在加工過程中，會產(chǎn)生大量下腳料如內臟、魚皮等，約占魚體總重的40%～55%［2］。有研究表明，在魚類卵［3］、皮［4］、血漿［5］等加工廢棄物中，均存在半胱氨酸蛋白酶抑制因子CPIs活性。

半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors，CPIs）CPIs是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸殘基的蛋白酶的抑制因子［6］，Cystatins超家族［7］是動物源CPIs的最主要類群，其根據(jù)分子量和結構劃分為三個家族即Stefin（家族Ⅰ，約11 ku），Cystatin（家族Ⅱ，約13 ku），以及Kininogen（家族Ⅲ，約50～120 ku）［6，8］。但動物源CPIs群中，也包括其他類別或家族的成員。已有研究表明Cystatins超家族成員參與機體的多種生理和病理過程，如骨質疏松癥［9］、感染與免疫［10-11］、抗菌［12］，精子成熟與胚胎發(fā)育［13］，與腫瘤的侵襲和轉移抑制［14-15］等。此外，在食品領域的相關研究表明，CPIs能抑制引起魚糜凝膠劣變的相關內源性熱穩(wěn)定半胱氨酸組織蛋白酶，改善魚糜凝膠的質構［16-17］。目前，較多研究集中于陸生動植物CPIs的純化和活性特征及功能鑒定。關于魚類CPIs的研究報道較少，僅從幾種魚類組織中純化了CPIs，包括Cystatins超家族成員及其類似物［3-5，18］，以及其他類型的CPIs［19］。對于進化地位和生存環(huán)境不同的魚類，其CPIs在分類、結構、活性特征、生理功能等方面的研究尚存在較多空白。

鰱魚卵、皮等廢棄組織中高低分子CPIs的部分生化特性［18，20-22］和抑菌活性［23］，并且通過免疫組化法，鑒定了Cystatin（家族II）在鯉科魚建鯉肝胰組織中的分布和定位［24］。但是對草魚肝胰中CPIs及其特性的研究，目前仍未見報道。為此，本研究擬從草魚肝胰中分離CPIs，并對其活性、分子量分布等基本特性及可能的家族類型進行鑒定，以便為后續(xù)開展深入的分離純化及分析工作奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

草魚肝胰組織2014年5月采集于雅安鑫禧水產(chǎn)市場，草魚體重1000 g；樣品于冰上運回實驗室后立即液氮速凍，-80℃凍存，用前4℃解凍；熒光合成肽（Z-Phe-Arg-MCA）、偶氮酪蛋白（Azocasein）、木瓜蛋白酶（Papain）、熒光標品AMC、苯甲基磺酰氟（PMSF）、明膠、ASP-ARG-VAL-TYR-ILE-HIS-PROPHE（0.573 ku）、TYR-GLY-GLY-PHE-MET（1.046 ku）、乳鏈菌肽（3.35 ku）、細胞色素C（13 ku）、胰蛋白酶（23.3 ku）、胃蛋白酶原（43 ku）、牛血清白蛋白（66 ku）、r-球蛋白（150 ku）、藍色葡聚糖-2000（200 ku）、牛血清白蛋白（BSA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、過硫酸銨（Aps） 美國Sigma公司；Pefabloc SC德國Roche公司；蛋白濃度試劑盒南京建成生物工程研究所；寬分子量蛋白標品（6.5～200 ku） 日本Takara公司；中分子量蛋白標品（14.4～94 ku） 北京天根；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒、PVDF膜（0.45 μm） 碧云天生物技術研究所。

Scientz-IID超聲波細胞粉碎機蘇州江東精密儀器有限公司；B4i-BR4i Jouan大容量高速冷凍離心機、Varioskan全波長熒光/比色掃描讀數(shù)儀、Powerdry PL3000真空冷凍干燥設備美國Thermo Scientific公司；TSK G2000 SWXL凝膠過濾高效液相柱日本TOSOH；LC-2010C HT高效液相色譜儀日本SHIMADZU；Mini Protein電泳槽、PowerPac 3000電泳電源、Mini Trans-Blot電轉印槽、Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；Ultra-8050超濾杯美國Millipore公司。

1.2實驗方法

1.2.1草魚肝胰中CPIs的粗提取草魚肝胰中CPIs的提取方法在Matilde［25］的方法的基礎上做適當改進，方法如下：草魚肝胰（約30 g）4℃解凍后于冰上用剪刀充分剪碎，加入4倍體積的提取緩沖液（含5 mmol/L的PMSF，100 mmol/L Tris，3 mmol/L EDTA-Na2的磷酸鹽緩沖液，pH7.5）超聲破碎（30%功率）至樣品澄清，離心（10000×g，20 min），取上清液用四層紗布過濾，濾液經(jīng)1 mol/L NaOH調節(jié)pH至8.7，50℃水浴加熱處理1 h后再用1 mol/L HCl回調至pH7.0。隨后離心（10000×g，20 min）取上清得到肝胰CPIs粗提液。樣品液氮速凍后，于-80℃保存，使用前于4℃解凍。以上步驟均在4℃操作，分別以偶氮酪蛋白和ZPhe-Arg-MCA為底物，測定各步驟所得粗提取液的活性。

1.2.2蛋白質量濃度測定采用Bradford［26］方法，按照蛋白濃度試劑盒說明各步驟提取液的蛋白濃度。

1.2.3偶氮酪蛋白法測CPIs抑制活性根據(jù)Li等［5］方法，利用偶氮酪蛋白法監(jiān)測粗提各步驟活性。調節(jié)CPIs的加入量（1～100 μL），使測得的對木瓜蛋白酶的抑制率在30%～70%之間［27］。CPIs抑制活性單位定義為：反應條件（37℃、pH7.0）下，440 nm處吸光值降低0.01即為一個單位。

1.2.4熒光合成肽底物法測定CPIs抑制活性參考Anastasi等［28］和Barrett等［29］的方法，利用靈敏度高的Z-Phe-Arg-MCA法監(jiān)測凝膠高效液相色譜洗脫物對木瓜蛋白酶的抑制活性。激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。調節(jié)Cystatins的加入量（1～120 μL），使測定的抑制率在30%～70%之間［27］。一個酶活單位定義為：在反應條件（40℃、pH6.8）下，能夠在1 min內水解底物并釋放出1 nmol AMC產(chǎn)物的酶活性量（1 nmol AMC/min）。一個抑制活性單位定義為：抑制1個單位的酶活性。

1.2.5凝膠高效液相色譜法純化鑒定CPIs凝膠過濾高效液相柱（7.8 mm×30 cm，5 μm，125 ?）用bufferA（含0.1 mol/L Na2SO4和0.05%NaN3的0.1 mol/L的PBS緩沖液，pH=6.7）平衡。將濃縮（截留分子量3 ku的超濾膜）的草魚肝胰CPIs提取液透析（截留分子量3 ku的透析袋）、微濾（0.22 μm的微濾膜）后上柱，上樣量為100 μL，用Buffer A以0.5 mL/min的流速進行洗脫。每0.5 min收集一管，采用熒光合成肽底物法監(jiān)測收集液的CPIs抑制活性。以藍葡聚糖-2000測定凝膠過濾高效液相的空體積V0，分別以ASP-ARG-VALTYR-ILE-HIS-PRO-PHE（0.573 ku）、TYR-GLY-GLYPHE-MET（1.046 ku）、乳鏈菌肽（3.35 ku）細胞色素C（13 ku）、胰蛋白酶（23.3 ku）、胃蛋白酶原（43 ku）、牛血清白蛋白（66 ku）、γ-球蛋白（150 ku）作為標準蛋白，相同條件下進行色譜分析，求得各自的洗脫體積Ve。以Ve與V0的比值作為縱坐標（y），標準蛋白分子質量對數(shù)為橫坐標（x）作圖，求得凝膠過濾高效液相色譜分離的標準曲線。然后根據(jù)該標準曲線分析提取的草魚肝胰中CPIs分子量分布情況。

1.2.6CPIs的SDS-PAGE及明膠底物-SDS-反相酶譜鑒定草魚肝胰粗提取液中CPIs的SDS-PAGE電泳參考Laemmli［30］的方法。采用4%濃縮膠和14%分離膠。每泳道上樣20 μL?？捡R斯亮藍R-250染色后，脫色液（95%乙醇、冰醋酸、蒸餾水體積比4.5∶0.5∶5）脫色至背景顏色消失，條帶清晰為止。其明膠底物-SDS-反相酶譜分析法在Li等［5］的方法的基礎上做適當改進，不同之處在于，根據(jù)李樹紅等［21］前期的報道，需另以比樣品濃度稍高的BSA做CPIs反相酶譜電泳的對照。復性后的凝膠用含0.4 mg/mL木瓜蛋白酶的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）在4℃反應1 h，隨后用含1%明膠的50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）在37℃反應12 h，染色脫色同SDS-PAGE。

1.2.7CPIs免疫蛋白印記法鑒定根據(jù)李松等［24］的方法制備建鯉Cystatin（家族II）的抗血清，效價為1∶512000。收集凝膠過濾高效液相純化所得的小分子CPIs活性部分，真空冷凍干燥后上SDS-PAGE，分離膠濃度17%，然后濕轉膜至PVDF膜。PVDF膜于封閉液（含5%BSA的TBST）中室溫封閉2 h；加入1∶500稀釋的Cystatin小鼠抗血清，4℃孵育過夜，用TBST漂洗4次，每次10 min；加入1∶1000稀釋的辣根酶標記的羊抗小鼠抗體，37℃孵育1 h；TBST液漂洗4次，每次10 min；取出膜進行DAB顯色。

2　結果與討論

2.1偶氮酪蛋白法及熒光合成肽法監(jiān)測CPIs抑制活性

在粗分離過程中，分別采用偶氮酪蛋白法和熒光合成肽法測定草魚肝胰粗提取各步驟中CPIs抑制活性。結果發(fā)現(xiàn)采用兩方法的常規(guī)操作方式，均無法準確監(jiān)測到各步驟CPIs抑制活性，因其CPIs抑制反應的對照管值，即偶氮酪蛋白法的0.07、0.032（表1）和熒光合成肽法的68.06、51.44（表2）都分別遠高于兩種方法中木瓜蛋白酶酶反應的對照管值0.009（表1）和6.01（表2）。其原因可能是在成分相對復雜的草魚肝胰粗提液中存在同樣能夠水解偶氮酪蛋白和ZPhe-Arg-MCA的干擾酶類，如熱穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶）活性［31-34］等，在50℃加熱和較高濃度（5mmol/L）的PMSF（其正常工作濃度0.1～1mmol/L）下，仍沒有得到充分的失活。

針對上述草魚肝胰組織提取液中存在明顯的干擾CPIs活性測定因素，本實驗分別采用兩種改進的方法進行測定，即其一向草魚肝胰粗提液中，加入足夠濃度的絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑PMSF或Pefabloc SC（已知該兩種抑制劑在高濃度下，對木瓜蛋白酶酶活性無影響），25℃反應30 min；其二，將草魚肝胰粗提液在90℃下加熱5 min。然后再分別按照偶氮酪蛋白法和熒光合成肽法常規(guī)操作順序進行反應。結果發(fā)現(xiàn)，當粗提液中加入終濃度0.4 mmol/L的Pefabloc SC或40 mmol/L PMSF時，或90℃加熱5 min后，各步驟的CPIs抑制反應對照管值0.017、0.018和9.14、7.34，都已經(jīng)接近或等于木瓜蛋白酶酶反應的對照管值0.009（表1）和6.01（表2）。但是由于40 mmol/L濃度下PMSF已經(jīng)無法徹底溶解，因此說明該方法可行性差（該法的測活數(shù)據(jù)未在表1和表2中列出）。

表1　偶氮酪蛋白法測定草魚肝胰粗提各步驟CPIs活性（n=3）Table 1　Inhibitory activities of CPIs of the crude extracts from Grass carp hepto-pancreas by azocasein（n=3）

表2　熒光合成肽法測定草魚肝胰粗提各步驟CPIs活性（n=3）Table 2　Inhibitory activities of CPIs of the crude extracts from Grass carp hepto-pancreas with Z-Phe-Arg-MCA（n=3）

此外，還發(fā)現(xiàn)對于偶氮酪蛋白法，無論采用哪種測定方式，其CPIs抑制反應測得的酶活值，即0.130、0.141、0.141、0.124、0.121（表1）均反而高于木瓜蛋白酶酶活值0.118，無法正常監(jiān)測CPIs抑制活性，可能是草魚肝胰粗提液中仍存在其他能夠水解偶氮酪蛋白底物的耐熱性非絲氨酸蛋白酶。相對于Z-Phe-Arg-MCA，偶氮酪蛋白是更為廣泛的酶類（即所有可水解酪蛋白的內切蛋白酶）的底物，除木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶外，堿性金屬蛋白酶［35］，酸性蛋白酶等［36］均可作用于偶氮酪蛋白，而PMSF和Pefabloc SC不能抑制提取液中可能存在的該類蛋白酶的水解作用。而熒光合成肽底物法優(yōu)于偶氮酪蛋白法，能準確監(jiān)測各提取步驟的CPIs活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿酸處理后，其CPIs的抑制比活得到了較明顯的提高。

2.2凝膠高效液相色譜法純化鑒定草魚肝胰中CPIs

草魚肝胰CPIs粗提液經(jīng)凝膠過濾高效液相分離后，各組分收集液即使不加Pefabloc SC或PMSF，或不加熱處理，采用高靈敏度的熒光合成肽底物法即可監(jiān)測CPIs抑制活性，這可能是抑制因子CPIs和干擾酶分子量不同，凝膠過濾高效液相使得二者徹底分離開，除去了CPIs活性測定時的干擾因素。

此外，經(jīng)計算得到標品蛋白在凝膠過濾高效液相上的標準曲線為y=-0.426x+3.399，R2=0.98。根據(jù)液相上各目的峰尖（圖1）處的Ve與V0的比值，經(jīng)標準曲線公式測定草魚肝胰中CPIs主要分布于：12.5 min，超出凝膠過濾高效液相柱計算上限150 ku，可能是CPIs的二聚體形式或復合物形式（活性峰1）；15.5 min，98 ku（活性峰2）；18.5 min，26 ku（活性峰3）、21～22 min約12 ku（活性峰4）、23～25.5 min約5～1 ku（活性峰5）?？梢姡诓蒴~肝胰中存在著高分子量和低分子量形式的多種CPIs，且高分子量形式的CPIs（＞150 ku和98 ku）的抑制活性量明顯高于其他各低分子量CPIs（約26、12、5～1 ku）。其原因可能是由于高分子量的kininogen，在某些魚類中的表達模式與哺乳動物相似，如其在鰻魚肝臟中表達量最高［37］，因此表現(xiàn)出大量CPIs抑制活性。此外，約5～1 ku的活性峰5也表現(xiàn)出CPIs抑制活性。其原因，一方面可能是因為魚類當中存在多種形式的CPIs，據(jù)報道，在魚類中除發(fā)現(xiàn)10～20 ku間的類Stefin（家族I）［4］、Cystatin（家族II）［18，38］外，也證實存分子量更低（6、9、11 ku）Thyropins家族的CPIs［39-40］。另一方面，有文獻報道鯉魚卵巢12 ku的Cystatin（家族II），結構不穩(wěn)定，容易斷裂成5和7 ku的片段［41］。此外，草魚肝胰組織中含有豐富的熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶）活性［33-34，36］，因此本實驗中出現(xiàn)的低分子量CPIs活性峰，還可能是完整成熟形式CPIs發(fā)生部分程度的降解，形成了仍保留著活性中心的活性片段。

圖1　草魚肝胰CPIs的凝膠過濾高效液相色譜分離Fig.1　Separation of grass carp hepto-pancreas CPIs by HPLC of TSK-GEL G2000SW

2.3草魚肝胰提取液中CPIs的反相酶譜鑒定

將得到的草魚肝胰CPIs提取液經(jīng)明膠底物-SDS-反相酶譜法進行抑制條帶的鑒定，以濃度稍高于樣品的BSA做對照，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)對照蛋白BSA條帶（泳道2）及樣品中非抑制蛋白的條帶（泳道3），經(jīng)反相酶譜處理后，被水解殆盡（泳道4和泳道5），而3條明顯的CPIs抑制條帶（泳道5）則仍然清晰可見。且其在反相酶譜上的分子量分布，也恰好分別對應凝膠過濾高效液相色譜分離所得的12 min的活性峰1，15.5 min的活性峰2（98 ku）條帶和19 min的活性峰3（26 ku）。已知kininogen（家族III）的分子量范圍在50～120 ku，因此初步判斷草魚肝胰中存在著98 ku和26 ku形式的活性CPIs。而反相酶譜上＞200 ku的活性帶（對應的＞150 ku的活性峰1），可能是魚肝胰中CPIs與某些蛋白結合形成了復合物，或是CPIs的二聚體形式。有研究表明鯉魚卵膜Cystatin可以共軛鍵與卵膜中的兩種蛋白成分結合形成60～200 ku的高分子復合物，并沒有發(fā)現(xiàn)14 ku的Cystatin單體［42］。此外，也有研究表明CPIs，在室溫條件下可通過域交換易形成二聚體［43］，如利用SDS-PAGE檢測重組表達的虹鱒魚Cystatin C時，也發(fā)現(xiàn)其易形成二聚體［44］。

盡管凝膠過濾高效液相色譜分離出活性峰4（約12 ku）、活性峰5（5～1 ku），但是在反相酶譜上這些峰對應的抑制條帶，并沒有得到鑒定；另一方面，在SDS-PAGE上，觀察到有明顯的小分子蛋白或多肽形成的彌散狀拖尾（見圖2泳道3）。因此，推測草魚肝胰粗提液中可能含有反向酶譜法無法鑒定的小分子形式的CPIs，它們可能是CPIs蛋白降解的片段但其保留了活性中心的結構域，所以仍能發(fā)揮抑制作用，或是其他家族或類別的小分子CPIs。

圖2　草魚肝胰中CPIs的反相酶譜分析Fig.2　Gelatin substrate-SDS-reverse zymography of CPIs from Grass carp hepto-pancreas

2.4Western blotting鑒定低分子部分的CPIs

鑒于反相酶譜中不能鑒定＜20 ku的低分子CPIs，同時也不清楚其家族歸屬情況，因此，為了鑒定其中可能的CPIs成分，首先采用鯉科魚類建鯉的Cystatin多克隆抗體，對高效液相上收集的＜20 ku組分（見圖3）進行了Western blotting鑒定。結果檢測到1條分子量稍大的清晰的特異性條帶（如圖3B箭頭所示，其位置對應圖3（A）中約12 ku處的蛋白條帶），以及分子量更?。ǎ?2 ku）的條帶（圖3B中菱形箭頭所示），顯色強度較弱。因此，表明草魚肝胰粗提液中小于20 ku的低分子部分，的確存在Cystatin（家族II）類型的CPI活性組分或其降解物。

圖3　草魚肝胰CPIs中小于20 ku部分的SDS-PAGE及其Western blotting鑒定Fig.3　SDS-PAGE and Western blotting of CPIs（＜20 ku）from Grass carp hepto-pancreas

3　結論

在草魚肝胰粗提液中加入絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑（40 mmol/L PMSF或0.4 mmol/L Pefabloc SC），或經(jīng)90℃加熱5 min，采用熒光合成肽底物法可準確地監(jiān)測到CPIs活性的變化。該結果對于后續(xù)研究中，準確監(jiān)測層析純化過程中CPIs比活性變化和純化倍數(shù)，提供了科學可行的方法。

采用凝膠過濾高效液相色譜法結合反相酶譜及免疫印跡法，初步鑒定出草魚肝胰組織中存在著不同分子量（98、26、12、5～1 ku）形式的CPIs，并確定存在約12 ku的Cystatin（家族II），而小于12 ku顯色條帶，可能是該蛋白降解形成的低分子量的活性片段。目前尚需進一步的系統(tǒng)分離純化，以便對草魚肝胰中各分子形式的CPIs的家族分類和生物學活性特征進一步探究。

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Separation and identification of CPIs from grass carp hepto-pancreas and its activity assay

JIANG Ran-ran，LIANG Yu，CHEN Zhi-guang，YANG Jin，LI Xin，DAN Jing，LI Ran，ZHONG Hai-xia，LI Mei-liang，LI Shu-hong*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

The applicability of the methods of azocasein and fluorescence synthetic peptide in monitoring the inhibitory activity of CPIs（cysteine proteinase inhibitors）from grass carp hepto-pancreas was firstly evaluated. Then the molecular weight distribution and the possible superfamily classification of CPIs were identified by gel filtration HPLC combining with reversed-phase enzyme spectrometry and western blotting methods.The results showed that after adding serine protease inhibitors（40 mmol/L PMSF or 0.4 mmol/L Pefabloc SC）into the crude extract or heating treatment at 90℃for 5 min，the inhibitory activity of CPIs could accurately monitored only by the fluorescence synthetic peptide method.Furthermore，the results of HPLC disclosed that there were several forms of active CPIs with different molecular weight（98，26，12，5～1 ku）in grass carp hepto-pancreas. However，only the CPIs more than 20 ku could be determined by the reverse zymography method.In addition，the results from western blotting revealed the existence of CPIs belonging to Cystatin（family II）with the molecular weight about 12 ku and the developing band less than 12 ku was speculated to be the active fragment degraded from the Cystatin protein.

grass carp hepto-pancreas；cysteine protease inhibitors；activity assay；molecular weight distribution；isolation and identification

TS254.1

A

1002-0306（2015）16-0118-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.016

2014－10－27

蔣然然（1990-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工理論與技術，E-mail：ranranj1004@163.com。

李樹紅（1975-），女，博士，副教授，研究方向：水產(chǎn)品加工理論與技術，E-mail：lish@sicau.edu.cn。

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101249）；四川省科技支撐計劃項目（2014NZ0003）。