短C肽門冬胰島素制備工藝的研究

付志成，馬妍，張增濤，劉日勇，何勇，范開

（1.重慶理工大學(xué)，重慶400054；2.富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶400041）

短C肽門冬胰島素制備工藝的研究

付志成1，馬妍1，張增濤2，劉日勇2，何勇2，范開1

（1.重慶理工大學(xué)，重慶400054；2.富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶400041）

為研究門冬胰島素制備工藝，參照畢赤酵母偏好密碼子，設(shè)計合成N-端連接引導(dǎo)肽EEAEAEAEPK，以KEWK作為短C肽，A、B鏈結(jié)構(gòu)完整的門冬胰島素cDNA序列。利用Xho I-Not I酶切位點將其插入表達質(zhì)粒pPICZαA，采用電轉(zhuǎn)移方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母x-33，篩選高拷貝重組子作為工程菌株進行高密度發(fā)酵，表達量可達到0.57 g/L。發(fā)酵液經(jīng)金屬螯合層析和SP陽離子層析純化后鑒定正確。建立CPB/Trypsin雙酶切工藝，對不同溫度及pH條件下產(chǎn)生的酶切產(chǎn)物進行分析，初步建立了酶切最佳pH值和溫度條件。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后制得純度為91.7%的門冬胰島素，副產(chǎn)物為B鏈30位缺失的門冬胰島素。該設(shè)計方法為含短C肽EWK門冬胰島素制備中選用Lys-c酶切成本過高的問題提供了備選解決方案。

門冬胰島素；畢赤酵母；短C肽；純化

門冬胰島素（Insulin Aspart，商品名Novo Rapid）由丹麥諾和諾德（Novo Nordisk）公司開發(fā)，是一種速效胰島素類似物，于2000年在美國上市［1］。其設(shè)計原理為通過基因重組將胰島素B鏈第28位脯氨酸（Pro）置換為天冬氨酸（Asp）。該陰離子的引入未改變其受體親和力、分離的速度及體內(nèi)的藥物效能，而是通過增大胰島素分子間的相互排斥阻止二聚體的形成，使其吸收速度為人胰島素的2倍［2］。Thim等［3］比較含不同長度C肽與去除C肽胰島素原在畢赤酵母中的表達情況，發(fā)現(xiàn)C肽長度由4個氨基酸殘基縮短至2 h，胰島素原的表達量上升。自此，C肽的設(shè)計成為胰島素重組表達中受到關(guān)注的問題，以期達到更高的表達量，降低胰島素的制備成本。Kjeldsen等［4］將去除B30蘇氨酸（Thr）后用小C肽代替人胰島素C肽或B29賴氨酸（Lys）與A1甘氨酸（Gly）直接連接的A、B鏈結(jié)構(gòu)連于前導(dǎo)肽α因子，提高了其在釀酒酵母中的分泌表達水平；而后發(fā)現(xiàn)在短C肽中引入一個芳香族氨基酸以及在分子疏水核心加入酚結(jié)合位點能夠使門冬胰島素在釀酒酵母中的表達量提高5倍［5］。Annibali［6］設(shè)計以賴氨酸（Lys）或精氨酸（Arg）構(gòu)成的2個氨基酸短肽的人胰島素原在畢赤酵母中得以表達。

國內(nèi)對于門冬胰島素的研究主要集中在以其為組成成分的預(yù)混胰島素類似物的藥理學(xué)特點［7］、在I型及II型糖尿病臨床應(yīng)用的研究［8］、在妊娠期糖尿病中應(yīng)用的安全性和有效性［9-10］，以及與二甲雙胍、阿卡波糖等降血糖藥物聯(lián)合用藥臨床效果［11］等方面，而對于門冬胰島素的重組表達和制備工藝所進行的研究鮮有報道。筆者所在實驗室曾設(shè)計構(gòu)建在α-MF信號肽序列后插入氨基酸序列EEAEAEAEPK作為引導(dǎo)肽，以EWK作為短C肽，B30Thr缺失的胰島素原，用pPICZαA為載體質(zhì)粒，畢赤酵母x-33作為表達菌株，構(gòu)建的表達Insulin Aspart的重組菌株發(fā)酵誘導(dǎo)64 hr表達量達到2.55 g/L。但在酶切處理過程中，常用的能切開賴氨酸（Lys，K）或精氨酸（Arg，R）的胰蛋白酶不能切除C肽，因此選用賴氨酸內(nèi)肽酶（Lys-c）進行酶切去除引導(dǎo)肽和C肽。但有關(guān)該酶的文獻報道較少，制備需培養(yǎng)天然篩選菌株，產(chǎn)量較低，使用需向日本W(wǎng)ako公司購買，成本較高。因此，設(shè)計N-端連接引導(dǎo)肽EEAEAEAEPK，以KEWK作為短C肽的A、B鏈結(jié)構(gòu)完整的門冬胰島素序列，IAsp：EEAEAEAEPK-B1-B28Asp-B29Lys-B30-K-E-W-K-A1-A21。以pPICZαA為載體質(zhì)粒，畢赤酵母x-33作為表達菌株，構(gòu)建篩選高表達菌株，建立成本較低的酶切工藝。

1　材料與方法

1.1材料

E.coli/Top10F'，P.Pastoris/x-33，表達質(zhì)粒pPICZαA均由重慶富進生物醫(yī)藥有限公司保存；限制性內(nèi)切酶Xho I，NotⅠ，T-4 DNA連接酶購自TAKARA公司；羧肽酶B（CPB），胰蛋白酶（Trypsin）由富進生物醫(yī)藥有限公司制備；中分子蛋白標準購自TIANGEN公司；Zeocin購自邁晨科技（北京）有限公司；金屬螯合層析柱和離子交換層析柱填料均購自GE公司。

LB培養(yǎng)基，MD、MY、YPG固體培養(yǎng)，BMMY、BMGY液體培養(yǎng)基等均參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊進行配制。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp的構(gòu)建

根據(jù)設(shè)計門冬胰島素原的氨基酸序列組成，選擇酵母偏愛密碼子設(shè)計cDNA序列，其中TGA和TAA為兩個終止密碼子序列，并在序列5＇端和3＇端分別設(shè)計Xho I（CTCGAG）和Not I（GCGGCCGC）限制性酶切位點。設(shè)計的cDNA委托寶生物工程（大連）有限公司全基因合成，連于pMD19-T質(zhì)粒。門冬胰島素基因序列如圖1所示。

圖1　門冬胰島素基因序列

將攜帶目的基因的甘油菌保接種于8 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)過夜后，取適量菌液，按Omega公司質(zhì)粒小提試劑盒操作，抽提重組質(zhì)粒pMD19-T-IAsp。利用Xho I-Not I分別雙酶切pMD19-T-IAsp質(zhì)粒和pPICZαA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別回收大小約200 bp和3300 bp片段并鏈接兩片段，構(gòu)建質(zhì)粒pPICZαAIAsp。重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp，用CaCl2法轉(zhuǎn)入E.coli Top10F'，涂布LB-Zeocin平板篩選重組子。挑取平板上菌落，搖瓶培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，經(jīng)Xho I-Not I雙酶切后，送大連寶生物公司測序。

1.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母x-33

Sac I單酶切重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp，線性化質(zhì)粒電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母x-33感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化液涂布在含有0.5，1，1.5，2 mg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃培養(yǎng)4 d，每24 h觀察平板上菌落的生長情況。

1.2.3重組子搖瓶誘導(dǎo)表達

根據(jù)重組拷貝數(shù)與Zoecin濃度計量依賴關(guān)系，于YPD-Zeocin平板（1.5 mg/mL）挑取pPICZαA -IAsp/x-33菌落，接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基；在30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)約16 h至OD600值約為10，換用BMMY培養(yǎng)液50 mL，30℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h，按終濃度0.5%每隔24 h補加無水甲醇，將誘導(dǎo)96 h后的各單菌落搖瓶培養(yǎng)液離心收集上清，通過SDS-PAGE鑒定其表達產(chǎn)物。

1.2.4重組酵母的高密度發(fā)酵

將鑒定正確的高表達的菌株所保菌種接種于1L YPD培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)約24 h。配制BSM培養(yǎng)基9 L，于瑞士比歐生物工程公司30 L發(fā)酵罐中滅菌降溫至28℃后，氨水自控pH值到4.8，補加PTM1，用種子液接種進行發(fā)酵。培養(yǎng)約24 h后培養(yǎng)基內(nèi)甘油耗盡，補加50%甘油補料，至菌體濕重約200 g/L，停止流加甘油并饑餓約1 h，開始流加含甲醇的甘油補料進行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)起始甲醇終濃度為0.2%，隨發(fā)酵過程逐漸提高甲醇誘導(dǎo)濃度至0.6%，過程中取樣HPLC檢測分泌表達產(chǎn)物含量。發(fā)酵進行至64 h后下罐收集離心上清。

HPLC檢測選用Welch UltimateR XB-C18（5μm 4.6×100 mm）；A液：DDW+0.1%三氟乙酸；B液：100%乙腈+0.1%三氟乙酸，為流動相；流速為1 mL/min，0%～95%B；檢測波長為214 nm，上樣20 μL。目的蛋白保留時間為12.5 min，18 000 000 mAU峰面積為1 mg/L。

1.2.5表達產(chǎn)物的純化

金屬螯合柱純化：1 mol/L NaCl沖洗柱填料2個柱體積后，以20 mmol/L Na2HPO4，0.3 mol/L NaCl，pH值為6.5～7.0的緩沖液洗柱，直至穿出液pH值約為7.0；用0.1 mol/L CuSO4和0.3 mol/L NaCl混合液進行再生，DDW沖洗未結(jié)合Cu2+；柱層析平衡液平衡（20 mmol/L Na2HPO4、0.3 mol/L NaCl、pH值為6.5～7.0）后上樣（發(fā)酵液離心取上清，將pH值調(diào)到7.0）；平衡液（20 mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、pH值7.0）復(fù)平衡至吸收基線，開始用洗脫液（20 mM Na2HPO4、50 mM咪唑、pH值6.5～7.0）洗脫，收集目的蛋白峰。

SP柱純化：平衡液（20 mmol/L CH3COONa、pH值為3.0～3.5）平衡柱填料，直至穿出液pH值約為3.5；上述洗脫液用去離子水稀釋至電導(dǎo)小于10 Ms/cm2，調(diào)pH值為3.0～3.5后上樣；平衡液復(fù)平衡至基線，洗脫液洗脫（20 mmol/L CH3COONa、1 mol/L NaCl、pH值為3.0～3.5），收集目的蛋白。與層析柱填料結(jié)合的色素可用1 mol/L NaOH除去。

1.2.6酶切體系建立

根據(jù)蛋白序列，需切除引導(dǎo)肽-EEAEAEAEPK-及C肽-KEWK-，形成正確的B1-B28Asp -B29-B30-A1-A21門冬胰島素序列。將SP陽離子柱層析收集樣品，采用HPLC法標定濃度后，稀釋至濃度1 mg/mL，分裝后分別調(diào)節(jié)pH值至7.5和8.5，按以下比例設(shè)置實驗組。表1中比例均為酶與底物質(zhì)量比，酶切過夜。HPLC檢測酶切結(jié)果，并通過質(zhì)譜比照判斷各個酶切條件的酶切效果。

表1Trypsin/CPB雙酶切比例

1.2.7酶切產(chǎn)物回收與分析

將樣品pH值調(diào)低到3.0，通過反相Source 15RPC純化回收目的蛋白。以Source 15RPC（75 mL）為制備柱。A液：0.1 M（NH4）2SO4，10%乙腈，0.1%H2SO4；B液：70%乙腈，10%甲醇為流動相。洗脫梯度：5%B至25%B 5 min；25%B至40%B 30 min，收集各洗脫峰。

利用RP-HPLC對收集到的各個洗脫峰進行鑒定，因C18普通反相不能有效分離Insulin Aspart與IAsp-DesB30組分，因而選用Kromasil 100 -10-C8分析柱。A液：90%緩沖，10%乙腈；B液：40%緩沖，60%乙腈作為流動相。30%B至80%B 50 min，檢測波長214 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定

構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp后，經(jīng)Xho INot I雙酶切，結(jié)果如圖2所示，可見在3 300 bp和200 bp左右有明亮條帶，與理論值相符，證明重組質(zhì)粒含有設(shè)計的基因序列。測序結(jié)果與設(shè)計序列一致，說明編碼含短C肽門冬胰島素序列已連接入pPICZαA質(zhì)粒。

圖2　重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2重組菌株的篩選與搖瓶誘導(dǎo)表達

重組畢赤酵母表達外源蛋白的表達量一定程度上受到基因組內(nèi)所整合編碼外源蛋白的基因拷貝數(shù)影響。由于選用的質(zhì)粒pPICZαA帶有Zeocin抗性基因，且重組子對Zeocin的抗性與外源基因的拷貝數(shù)在一定范圍內(nèi)成正比關(guān)系，故挑取1.5 mg/mL Zeocin濃度YPD平板上菌落作為工程菌株，搖瓶誘導(dǎo)表達并進行高密度發(fā)酵，考察表達量。

目的蛋白理論相對分子質(zhì)量為7 853.86，利用中分子蛋白Marker作為對照，能夠看到在低于14.4 kDa處有明顯條帶，初步判斷目的蛋白在重組菌株中能夠得以分泌表達。

圖3　重組子誘導(dǎo)表達SDS-PAGE

2.3工程菌發(fā)酵表達量

對所篩菌株進行小規(guī)模高密度發(fā)酵，不僅能夠?qū)?gòu)建的工程菌株發(fā)酵條件進行初步摸索，還能為后續(xù)純化及酶切提供足夠的樣品。依據(jù)筆者所在實驗室對以EWK作為短C肽pPICZαAIAsp（EWK）/x-33發(fā)酵工藝為參照，對本菌株進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)64 h對目標蛋白表達量進行檢測，表達量約為0.57 mg/L，見圖4。

圖4　發(fā)酵誘導(dǎo)表達64 h上清RP-HPLC檢測

2.4目的蛋白純化

發(fā)酵上清經(jīng)金屬螯合層析，SP柱純化后，以除去絕大部分雜蛋白和可能干擾酶切的色素，純化結(jié)果如圖5所示。雖經(jīng)Zn2+沉淀復(fù)溶后，能夠更加徹底地清除溶液中的色素，但Zn2+沉淀引入Zn2+可能干擾蛋白酶的酶切效率，而復(fù)溶需加入EDTA螯合Zn2+，EDTA為蛋白酶活性抑制劑。因此，經(jīng)兩步純化的樣品，多數(shù)色素被除去。純化終樣品RP-HPLC檢測如圖5，目的峰為單一峰，保留時間為12.5 min左右。

圖5　純化產(chǎn)物RP-HPLC檢測

2.5酶切處理結(jié)果

經(jīng)酶切處理樣品，利用C-18 RP-HPLC檢測，除可見引導(dǎo)肽C肽外，有3種主要酶切產(chǎn)物，結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果分析，分別為錯切B22Arg剩余多肽和帶有C肽未能切除的門冬胰島素原形式。在正確酶切產(chǎn)物峰中，混合了切除TKEWK的結(jié)構(gòu)，即B30Thr缺失的IAsp-DesB30。各個組分在不同酶切條件下所占比例如表2、3所示。

表2、3中：組分I為未被酶切門冬胰島素原；組分II為在B22Arg位點錯誤切開的肽段；組分III為酶切正確的門冬胰島素蛋白；組分IV為帶有C肽KEW（K）而被切去引導(dǎo)肽的多肽鏈。由表2、3可知，pH值對酶切效率有一定的影響，高pH值可能造成錯切率升高，低pH值則會造成未被酶切的門冬胰島素原過多。Trypsin1∶500，CPB1∶200，pH值8.5實驗組雖然錯切B22Arg的產(chǎn)物最多，但是其產(chǎn)物中酶切正確的Insulin Aspart所占比例也最高。由此，參照該實驗方案，將制備樣品稀釋至4 mg/mL，Typsin與目的蛋白質(zhì)量比為1∶800，CPB與目的蛋白比為1∶200，pH值為8.5，20℃酶切5 h后，RP-HPLC檢測結(jié)果如圖6所示。13.191 min保留峰經(jīng)高分辨質(zhì)譜測定分子量為5 826 Da，與理論分子量一致。

表2　酶切產(chǎn)物組分表（pH值為7.5）

表3　酶切產(chǎn)物組分表（pH值為8.5）

圖6　酶切產(chǎn)物RP-HPLC檢測

2.6酶切產(chǎn)物的回收與分析結(jié)果

利用15RPC對酶切產(chǎn)物進行純化，洗脫時分別收集4個洗脫峰，見圖7。對4個洗脫峰RP-HPLC進行分析，并與標準品比照，可知峰3收集即為Insulin Aspart，見圖8。

圖7　酶切產(chǎn)物15RPC純化

圖8　15RPC收集峰RP-HPLC檢測

因副產(chǎn)物IAsp-DesB30與目的蛋白Insulin Aspart結(jié)構(gòu)類似，只有B30Thr缺失，C18-HPLC難以分離，因此選用Kromasil 100-10-C8柱對純化后酶切產(chǎn)物進行分析，結(jié)果見圖9。純化后的酶切產(chǎn)物已為純度較高的Insulin Aspart，其純度達到91.71%。

圖9　酶切回收峰3 Kromasil 100-10-C8檢測

3　結(jié)論

胰島素及胰島素類似物在畢赤酵母中的表達量不僅受到編碼外源蛋白基因特性的影響，蛋白本身結(jié)構(gòu)也是決定性因素之一。對于在畢赤酵母中表達胰島素及其前體，在質(zhì)粒信號肽α-MF序列和胰島素基因之間加入EEAEAEAEPK信號肽序列能有效地提高表達量。國內(nèi)多選擇以AAK作為短C肽提高胰島素或胰島素類似物Detmir前體（B30Thr缺失的人胰島素）［11］，而對門冬胰島素的報道并不多見。設(shè)計短C肽KEWK，在C肽中引入芳香族類氨基酸，以期能夠提高表達量。在工程菌株高密度表達的發(fā)酵過程中，外源蛋白表達量決定于菌種本身和外源蛋白的性質(zhì)，同時也受到的發(fā)酵環(huán)境的影響。參照畢赤酵母表達人胰島素前體發(fā)酵條件［11］，對構(gòu)建工程菌進行高密度培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達門冬胰島素前體，64 h表達量為0.57 g/L。就本實驗結(jié)果而言，為了酶切而在EWK序列前引入的氨基酸增加了C肽的長度，很有可能是限制表達量的因素之一。發(fā)酵的表達量通過改變補料流加的時機和誘導(dǎo)模式，有進一步提升的潛力。

發(fā)酵上清液中所含無機鹽、色素及背景蛋白均會對門冬胰島素制備中的酶切造成干擾。畢赤酵母分泌表達胰島素原早期運用硫酸銨沉淀后陰離子柱層析分離［12］，之后多用超濾或大孔樹脂吸附層析后經(jīng)SP離子交換層析，再經(jīng)Zn2+沉淀制得［11，13］。本文發(fā)現(xiàn)在目的蛋白不帶有組氨酸標簽的情況下，胰島素前體能與銅金屬螯合層析柱填料結(jié)合，有效除去發(fā)酵液中背景蛋白，但對色素清除能力不強，故仍需使用SP離子交換層析去除部分色素。因酶切工藝易受到Zn2+和EDTA的干擾，故未進行Zn2+沉淀與復(fù)溶的步驟，所得樣品經(jīng)HPLC檢測為單一峰，殘留少許色素，能夠滿足酶切需要，色素可在酶切后純化中被除去。

因含C肽的胰島素原不具有生物學(xué)活性，需切除短C肽的胰島素原［14］。故設(shè)計短C肽時，不僅需要考慮C肽對表達量的影響，還要考慮其在后續(xù)處理中純化酶切。羧肽酶B和胰蛋白酶常在重組蛋白表達后酶切加工時使用［15］，目前已經(jīng)完成了基因工程重組表達的研究，可利用工程菌大量制備，使得其生產(chǎn)或購買的成本降低。使用CPB/Trypsin雙酶切體系，能夠被酶切的位點為B22Arg，B29Lys，以及C肽第1位和第4位的Lys，因此，若CPB作用與C肽第1位Lys切斷C端肽鍵，會在B鏈C端引入一個多余的Lys，而B29Lys仍可被內(nèi)肽酶作用，多余Lys連同B30Thr一同被切除，形成B鏈第30位缺失的門冬胰島素（IAsp-DesB30）。門冬胰島素B30缺失對藥效和藥代動力學(xué)的影響研究目前還未見相關(guān)報道，所以需進一步純化分離IAsp-DesB30，并應(yīng)用分離度較好的檢測方法作為質(zhì)量控制的手段。經(jīng)Kromasil 100-10-C8反相色譜檢測15 RPC制備柱純化后的樣品，酶切純化制得樣品門冬胰島素純度達到91.7%，雜質(zhì)即為IAsp-DesB30。該類物質(zhì)經(jīng)純化分離后可繼續(xù)加工，在B鏈末尾連接一個Thr，以制備門冬胰島素。

本實驗將在以后的研究中對發(fā)酵的工藝進行進一步優(yōu)化，提高產(chǎn)量，改進酶切體系，提高酶切效率，減少錯誤酶切的副產(chǎn)物，提高純化收率，為速效胰島素工業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。

［1］滕香宇.新型胰島素類似物的研究進展［J］.世界臨床藥物，2004，25（12）：714-717.

［2］Home P D，Lindholm A，Hylleberg B，et al.Improved glycemic control with insulin aspart：a multicenter randomized double-blind crossover trial in type 1 diabetic patients［J］.Diabetes Care，1998，21（11）：1904-1909.

［3］Thim L，Hansen M T，Norris K.et al.Secretion and processing of insulin precursors in yeast［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1986，83（18）：6766-6770.

［4］Kjeldsen T.Yeast secretory expression of insulin precursors［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2000，54（3）：277 -286.

［5］Kjeldsen T，Ludvigsen S，Diers I，et al.Engineering enhanced protein secretory expression in yeast with application to insulin［J］.J Biol Chem，2002，277（21）：18245 -18248.

［6］Annibali.Expression of a human insulin precursor in P［P］.pastoris US Patent，7，091，032.2006-08-15.

［7］董超.門冬胰島素30臨床應(yīng)用進展［J］.山西醫(yī)藥雜志，2009，38（11）：991-992.

［8］李淑穎.胰島素類似物的研究進展［J］.河北醫(yī)藥，2005，27（9）：693-694.

［9］于四永，王慧麗，陳永立，等.胰島素類似物治療妊娠期糖尿病的患者的臨床觀察［J］.臨床薈萃，2013，28（5）：573-575.

［10］呂詩詩，徐勇，劉霜，等.胰島素類似物治療妊娠期糖尿病的研究進展［J］.臨床薈萃，2015，30（2）：228 -230.

［11］李紅亮.不同啟動子對重組畢赤酵母高密度表達人胰島素前體的影響［D］.重慶：重慶理工大學(xué)，2012.

［12］高劍坤.一種新型長效人胰島素類似物的研制［D］.重慶：重慶大學(xué)，2007.

［13］Xie T，Liu Q，Xie F，et al.Secretory expression of insulin precursor in Pichia pastoris and simple procedure for producing recombinant human insulin［J］.Prep Biochem Biotechnol，2008，38：308-317.

［14］吳穎.小C肽人胰島素原在甲醇酵母中的分泌表達［D］.浙江：浙江大學(xué)，2005：6-7.

［15］Chunsheng Leng，Hang Cui.Application of recombinant enzymes in the production of human insulin［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Science，2011，23（5）：335 -337.

（責(zé)任編輯何杰玲）

Research on Preparation of Insulin Aspart with Short C-Peptide

FU Zhi-cheng1，MA Yan1，ZHANG Zeng-tao2，LIU Ri-yong2，HE Yong2，F(xiàn)AN Kai1
（1.Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China；2.FAGEN Biological Medicine Co.Ltd.，Chongqing 400041，China）

In order to study the preparation techniques of insulin aspart，we designed and linked EEAEAEPK to its N-terminal，referring to the preference codons of pichia pastoris，and took KEWK as C-peptide，which was a synthetise insulin aspart cDNA sequence with integrated A，B chain structure.We inserted the target sequence into expression plasmid pPICZαA by the restriction enzyme sites Xho I and Not I.The combination of P.Pastoris/x-33 was constructed by electrotransformation and the high-yield strain was selected.The combinant strain expressed 0.57 g/L at the 64th hours of fermentation.We obtained the purer insulin aspart precursor from broth through metal ion-affinity chromatography，SP ion-exchange chromatography and the result of authentication was correct.The system of enzyme digestion by CPB/Trypsin was established and probed the effect in different pH and temper-ature.The product after enzyme digestion was made into insulin aspart and the by-product was insulin aspart DesB30.The purity of insulin aspart reached 91.7%.This design would be another choice to the preparation of insulin aspart，compared with which with short C-peptide EWK，as its high cost in use of Lys-c.

insulin aspart；pichia pastoris；short C-peptide；purification

R977.15

A

1674-8425（2015）04-0060-07

10.3969/j.issn.1674-8425（z）.2015.04.012

2015-01-26

付志成（1990—），男，碩士研究生，主要從事基因工程藥物方面研究。

付志成，馬妍，張增濤，等.短C肽門冬胰島素制備工藝的研究［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015（4）：60-66.

format：FU Zhi-cheng，MA Yan，ZHANG Zeng-tao，et al.Research on Preparation of Insulin Aspart with Short CPeptide［J］.Journal of Chongqing University of Technology：Natural Science，2015（4）：60-66.