重組賴氨酸內(nèi)肽酶構(gòu)建表達(dá)及活性方法研究

馬 妍，付志成，范 開

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，至2025年全球糖尿病患者人數(shù)將是目前的2倍，達(dá)3億人［1］，而胰島素(insulin，Ins)是所有1型糖尿病和多數(shù)2型糖尿病患者的主要治療藥物。人類胰島素基因位于11號染色體短臂近末端處P15.5，由1789個堿基對組成，它包括3個外顯子和2個內(nèi)含子［2］。

在胰島素的生物合成過程中有一個疏水的肽鏈與胰島素原的B鏈N端相連，這種形式的胰島素被稱為前胰島素原(preproinsulin)［3］。這個接在B鏈N端的疏水肽鏈?zhǔn)切盘栯模渥饔檬且龑?dǎo)新合成的胰島素原穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。胰島素是胰島素原經(jīng)過胰蛋白酶和類羧肽酶B等類似蛋白酶的作用，切去C肽及兩端的堿性氨基酸產(chǎn)生的［4］。

胰島素的生物合成過程包括前胰島素原的mRNA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的向內(nèi)質(zhì)面被翻譯成一條肽鏈的前胰島素原，新生的多肽鏈在信號肽的引導(dǎo)下穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，同時移去信號肽成為胰島素原;然后胰島素原進(jìn)入高爾基體，經(jīng)過折疊、硫硫配對和包裝進(jìn)入分泌顆粒;最后由類似胰蛋白酶和羧肽酶B的專一的蛋白水解酶加工成兩條鏈的胰島素和C肽，并等分子釋放到血液中。由此可見，從合成到成熟，胰島素有3種存在形式:前胰島素原(mRNA翻譯產(chǎn)物，含信號肽);胰島素原(折疊產(chǎn)物，缺少信號肽);胰島素(成熟產(chǎn)物，由 A、B 兩條鏈組成，缺少 C 肽)［3］。

賴氨酸內(nèi)肽酶(Lysyl C-peptide，Lys-C)是可以特異性切除賴氨酸基團(tuán)C末端的多肽［5］的一種酶。目前使用的賴氨酸內(nèi)肽酶價格昂貴，必須從天然菌種中提取，而且不能很好地應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。本研究用重組方法克隆表達(dá)賴氨酸內(nèi)肽酶，該方法簡單，表達(dá)量高，具有價廉、無污染等特點(diǎn)。重組的賴氨酸內(nèi)肽酶應(yīng)用于胰島素的制備工藝中，與天然的賴氨酸內(nèi)肽酶相比具有相同的作用。

Achromobacter lyticus來源的Lys-C蛋白酶原前體由4部分組成:N端20AA信號肽(pre-peptide，signal peptide)、185AA 前導(dǎo)肽(pro-peptide)、268AA成熟 Lys-C蛋白酶(mature protein)及180AA C端延伸肽(C-terminal extension peptide)。本實(shí)驗前期研究結(jié)果表明，酵母重組表達(dá)448AA成熟Lys-C蛋白酶和C端延伸肽無法獲得活性Lys-C蛋白酶。根據(jù)文獻(xiàn)資料，需重組表達(dá)完整的Lys-C蛋白酶原前體方可得到活性Lys-C蛋白酶［6］。鑒于此，計劃全基因合成185AA前導(dǎo)肽cDNA，并將其與已有成熟Lys-C蛋白酶和C端延伸肽cDNA拼接，獲得全長Lys-C蛋白酶原前體，再次進(jìn)行畢赤酵母重組表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

PMD19-T-Lys-C，設(shè)計的cDNA委托寶生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成。

Lysyl Endopeptidase(以下簡稱 Wako酶)，購自日本和光純藥工業(yè)株式會社;羊抗兔二抗，購自Jackson;小量質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA小量膠回收試劑盒，購自美國Omega公司。

本研究設(shè)計了pPICZαA-Lys-C蛋白氨基酸序列，并根據(jù)酵母密碼子偏愛性原則設(shè)計cDNA序列。設(shè)計的cDNA委托寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.2 方法

1.2.1 pPICZαA-Lys-C 目的基因的獲得

根據(jù)Codon Usage database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)P.Pastoris 密碼子使用偏好性數(shù)據(jù)［7］，設(shè)計了 pPICZαA-Lys-C 的 CDNA，其中包括TGA和TAA兩個終止密碼子序列，并在序列5'端和3'端分別設(shè)計Xho I(CTCGAG)和Not I(GCGGCCGC)限制性酶切位點(diǎn)。其中Lys-C的序列為:

MKRICGSLLLLGLSISAALAAPASRPAAFDYAN LSSVDKVALRTMPAVDVAKAKAEDLQRDKRGDIP RFALAIDVDMTPQNSGAWEYTADGQFAVWRQRV RSEKALSLNFGFTDYYMPAGGRLLVYPATQAPAG DRGLISQYDASNNNSARQLWTAVVPGAEAVIEAVI PRDKVGEFKLRLTKVNHDYVGFGPLARRLAAASG EKGVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSKSGT LACTGSLVNNTANDRKMYFLTAHHCGMGTASTAA SIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQS GSTVKATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDR RDQNYPGAIAIHHPNVAEKRISNSTSPTSFVAWGGG AGTTHLNVQWQPSGGVTEPGSSGSPIYSPEKRVLG QLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAA SRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTPNTPPVANF TSTTSGLTATFTDSSTDSDGSIASRSWNFGDGSTST ATNPSKTYAAAGTYTVTLTVTDNGGATNTKTGSVT VSGGPGAQTYTNDTDVAIPDNATVESPITVSGRTGN GSATTPIQVTIYHTYKSDLKVDLVAPDGTVYNLHNR TGGSAHNIIQTFTKDLSSEAAQRAPGSCG

將對應(yīng)的甘油菌接種并抽提質(zhì)粒，得到含有Lys-C目的基因的質(zhì)粒pMD19-T-Lys-C。

1.2.2 pPICZαA-Lys-C 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

本項目中擬構(gòu)建重組質(zhì)粒為pPICZαA-Lys-C，需要先構(gòu)建目的片段Lys-C和載體pPICZαA，再將Lys-C嵌入到 pPICZαA載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-Lys-C。

1)pPICZαA載體和Lys-C目的片段的雙酶切

用Xho I、Not I分別雙酶切空載體 pPICZαA質(zhì)粒及目的片段Lys-C質(zhì)粒。150 μL反應(yīng)體系如表1所示。

表1 Xho I+Not I雙酶切體系

混勻后放入37℃恒溫箱，反應(yīng)1 h。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)美國Omega公司小量膠回收試劑盒的方法，回收約3600 bp的 pPICZαA片段和1930 bp的 Lys-C片段。

2)pPICZαA載體與Lys-C目的片段的連接

利用ChampGel 5000數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)計算膠回收產(chǎn)物的DNA含量，按載體與插入目的片段摩爾比1∶5設(shè)計連接反應(yīng)體系，如表2所示。

將上述反應(yīng)體系放入 PCR儀，16℃連接過夜。

3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

根據(jù)文獻(xiàn)［8］中的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，將－80℃保存的 E.Coli Top10F’菌種迅速融化，取20 μL接種于5 mL滅菌LB培養(yǎng)液中，在30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12～16 h;將過夜培養(yǎng)的E.Coli Top10F’按1∶100比例轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)液中，37℃，220 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值為0.3～0.5;取1 mL菌液至1.5 mL EP管中，冰浴放置10 min，然后于4℃、5000 r/min離心5 min;棄上清，用400 μL 預(yù)冷0.1 mol/L CaCl2懸浮(輕輕吹打分散菌體)于冰水混合物中放置10 min，然后于4℃、5000 r/min離心5 min;棄上清，用100 μL 0.1 M CaCl2懸浮(輕輕吹打分散菌體)于冰水混合物中放置20 min，放－80℃冰箱備用。

表2 pPICZαA-Lys-C連接體系

4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

將－80℃保存的E.Coli Top10F’感受態(tài)細(xì)胞迅速融化，取20 μL連接液與感受態(tài)細(xì)胞混勻，于冰水混合物中放置30 min，然后于42℃水浴熱休克90 s，迅速放置冰水浴2 min;每管各加300 μL LB培養(yǎng)液，于37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)45 min;取100 μL培養(yǎng)菌液涂布 LB+Zeocin平板，于37℃培養(yǎng)箱中正放30 min后倒置培養(yǎng)過夜。

5)重組質(zhì)粒pPICZαA-Lys-C篩選及鑒定

利用重組子上帶有的博萊霉素抗性基因進(jìn)行篩選。比較pPICZαA-Lys-C與陰性對照平板上單菌落個數(shù)，如果陰性對照平板生長的菌落較多，說明載體酶切不完全，則要重新酶切、連接。若pPICZαA-Lys-C平板上菌落明顯多于陰性對照平板單克隆，則可進(jìn)行下一步陽性克隆篩選。

挑取5個pPICZαA-Lys-C轉(zhuǎn)化子分別接種于5 mL LB-Zeocin液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行重組質(zhì)粒雙酶切鑒定。按照美國Omega公司小量質(zhì)粒抽提試劑盒的方法，將培養(yǎng)過夜菌體提取質(zhì)粒并利用Xho I、Not I進(jìn)行雙酶切。將反應(yīng)體系混勻放置于37℃恒溫箱1 h，酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

6)pPICZαA-Lys-C重組質(zhì)粒保存

將上述鑒定正確的重組克隆宿主菌命名為pPICZαA-Lys-C/Top10F’。將該菌體在 LB-Zeocin平板擴(kuò)增后，挑取菌苔，接種于含25 μg/L Zeocin的LB液體培養(yǎng)基中于37℃、220 r/min培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.6時分裝，每管補(bǔ)入終濃度為15%的甘油后放置于－80℃低溫冰箱中保存。同時用質(zhì)粒提取試劑盒提取一定量該質(zhì)粒，分成10 μL/支，保存于-80℃低溫冰箱中。保存質(zhì)粒前進(jìn)行了Xho I、Not I雙酶切鑒定，以確保經(jīng)鑒定的質(zhì)粒正確。

1.2.3 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建和篩選

1)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒線性化以及感受態(tài)細(xì)胞的制備

根據(jù)文獻(xiàn)［9－10］，挑取畢赤酵母X-33單菌落接種到裝有5 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，30℃、250 r/min培養(yǎng)過夜。取1 mL過夜菌液到20 mL YPD 中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)，OD600值為1.2～2.0時收菌。將20 mL菌液移入離心管，4℃、1500 g離心5 min，無菌徹底去掉上清。用1 mL 1 mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，裝入 1.5 mL EP管中，4℃、1500 g離心3 min，無菌去掉上清。用1 mL 1mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，4℃、1500 g離心3 min反復(fù)5次。用500 μL 1 mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，冰水浴備用。

根據(jù)DNA濃度及限制性內(nèi)切酶使用說明設(shè)計反應(yīng)體系如表3所示。

混勻，37℃恒溫箱3 h，電泳鑒定線性化酶切效率，用酚氯仿法回收線性化質(zhì)粒。酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液抽提一次，取上清后加入0.1倍體積的3M乙酸鈉(pH值3.0)，混勻后加入2.5倍體積－20℃預(yù)冷的無水乙醇，在－20℃放置2 h以上以沉淀DNA。然后以10000 g離心5 min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次;在37℃恒溫箱放置15 min左右使乙醇揮發(fā)，晾干DNA沉淀。用20 μL DDW 重新溶解DNA。

表3 重組pPICZαA-Lys-C質(zhì)粒線性化體系

電泳鑒定回收后的質(zhì)粒線性化是否完全，并估計DNA的濃度，保存于－20℃，使用前按需要濃度溶解DNA。

取100 μL菌液至預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，加入線性化的質(zhì)粒10 μL混勻，置冰上10 m(或－20℃放置1 min)。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀中電轉(zhuǎn) (電壓1.5 kV，電擊時間1.5 ms)。立即用1 mL 1 mol/L預(yù)冷的D-Sorbitol到電轉(zhuǎn)杯懸浮菌體。取200 μL菌液涂布YPD－Zeocin平板，平放30℃烘箱20～60 min，再倒放培養(yǎng)3～7天。

2)pPICZαA-Lys-C畢赤酵母重組子的篩選與鑒定

將pPICZαA-Lys-C/X-33轉(zhuǎn)化混合液轉(zhuǎn)接于含 200 μg/mL Zeocin 的 YPD 培養(yǎng)基中［11-12］，30℃過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物接種于100 mL BMGY培養(yǎng)液的1 L搖瓶中，30℃搖床培養(yǎng)約16 h至OD600為10時換用BMMY培養(yǎng)液100 mL 30℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h，按終濃度為0.5% 每隔24 h補(bǔ)加甲醇并取樣保存。誘導(dǎo)96 h后離心收集上清，保存。將不同誘導(dǎo)表達(dá)時間的上清進(jìn)行TCA沉淀，8 M Urea溶解后還原Buffer處理，進(jìn)行12% 預(yù)置膠SDS-PAGE電泳檢測上清中 pPICZαA-Lys-C表達(dá)情況。

挑取pPICZαA-Lys-C/X-33的YPD平板(含200 μg/mL Zeocin)接種于100 mL BMGY 培養(yǎng)液的1 L搖瓶中，30℃搖床培養(yǎng)約16 h至OD600為10時換用BMMY培養(yǎng)液100 mL 30℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h，按終濃度為0.5% 每隔24 h補(bǔ)加甲醇并取樣保存。誘導(dǎo)96 h后的各單菌落搖瓶培養(yǎng)液離心收集上清，保存。取不同誘導(dǎo)表達(dá)時間的上清同上處理后電泳檢測。

1.2.4 Lys-C酶免疫斑點(diǎn)鑒別實(shí)驗

TG緩沖液:稱取三羥甲基氨基甲烷15.12 g和甘氨酸72 g，加水溶解并稀釋至500 mL，4℃保存。EBM緩沖液:取 TG緩沖液 20 mL、甲醇40 mL，加水稀釋至200 mL，4℃保存。TTBS緩沖液:稱取三羥甲基氨基甲烷12.1 g，氯化鈉9.0 g，吐溫－201.0 mL，加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至7.5，加水稀釋至1000 mL，4℃保存。底物緩沖液:取 3，3‘-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)15 mg，加甲醇 5 mL，30% 過氧化氫 15 μL，并加入25 mL TTBS 緩沖液使其溶解［13］。

封閉液:TTBS緩沖液+5%脫脂奶粉。稀釋液:TG緩沖液稀釋4倍加1%BSA，即50mM Tris-Gly+1%BSA。樣品的制備:Wako公司Lys-C酶作為陽性對照;本公司酵母誘導(dǎo)表達(dá)Lys-C酶上清TCA沉淀處理回收處理樣品;陰性對照為稀釋液，分別取5～10 μL點(diǎn)膜。

將硝酸纖維素膜用EBM緩沖液浸泡15 min后，取出干燥30 min;陽性對照品、供試品及陰性對照品分別取樣點(diǎn)膜。室溫干燥60 min;硝酸纖維素膜浸入封閉液中封閉處理，在雜交搖床上室溫?fù)u動溫育60 min;棄去液體，加入含1∶1000抗Lys-C兔多抗的TTBS緩沖液25 mL，室溫?fù)u動溫育2 h;取出硝酸纖維素膜，用TTBS緩沖液淋洗1次，再用TTBS緩沖液洗3次，每次8 min;棄去液體，加入含1∶5000 HRP酶聯(lián)標(biāo)記羊抗兔IgG的TTBS緩沖液25 mL，室溫?fù)u動溫育60 min;取出硝酸纖維素膜，用TTBS緩沖液淋洗1次，再用TTBS緩沖液洗4次，每次8 min;棄去液體，加入適量底物緩沖液置于室溫避光條件下顯色，斑點(diǎn)顯色清晰時用水洗終止反應(yīng)。結(jié)果判定:陽性結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)明顯色帶，陰性結(jié)果不顯色。

1.2.5 重組賴氨酸內(nèi)肽酶酶切RP-HPLC法活性測定

根據(jù)免疫斑點(diǎn)法，得到 pPICZαA-Lys-C有表達(dá)的菌體，將有表達(dá)的pPICZαA-Lys-C誘導(dǎo)96 h的上清用3M硫酸銨沉淀，在操作過程中要注意邊加邊搖，4°C靜置12 h。將加有3M硫酸銨的pPICZαA-Lys-C上清5000 g，10 min離心棄上清，并用50 mM，pH值 9.0的 Tris溶液溶解，再用50 mM，pH值8.0的Tris溶液透析，4℃過夜。用透析過夜的pPICZαA-Lys-C酶切門冬胰島素前體，RP-HPLC法檢測其酶切活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 pPICZαA-Lys-C/Top10F’重組質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定結(jié)果

利用重組子上帶有的博萊霉素抗性基因進(jìn)行篩選。比較pPICZαA-Lys-C與陰性對照平板上單菌落個數(shù)，如果陰性對照平板生長的菌落較多，說明載體酶切不完全，則要重新酶切、連接。若pPICZαA-Lys-C平板上菌落明顯多于陰性對照平板單克隆，則可進(jìn)行下一步陽性克隆篩選。

pPICZαA-Lys-C平板長出100多個菌落，陰性對照平板僅長出少于10個菌落，說明載體酶切完全。重組質(zhì)粒PPICZαA-Lys-C大腸桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖1，其中左邊為陰性對照，右邊為pPICZαALys-C/Top10F’轉(zhuǎn)化平板。

圖1 pPICZαA-Lys-C重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10F’陰性陽性對比

挑取pPICZαA-Lys-C轉(zhuǎn)化子接種于5 mL LBZeocin液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)過夜菌體提取質(zhì)粒并利用Xho I、Not I進(jìn)行雙酶切。將反應(yīng)體系混勻放置于37℃恒溫箱1 h，酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如圖2所示，菌落質(zhì)粒雙酶切后分別形成3600 bp左右和1930 bp左右兩個線性片段，分別對應(yīng)于pPICZαA片段和Lys-C片段，表明上述質(zhì)粒已重組了pPICZαA-Lys-C目的片段。

2.2 SDS-PAGE電泳法檢測重組賴氨酸內(nèi)肽酶表達(dá)結(jié)果

①M(fèi)arker

② X-33誘導(dǎo)表達(dá)上清1 mL+10 μL Wako酶

③ pPICZαA-Lys-C/X-33誘導(dǎo)表達(dá)上清1 mL

④ X-33 BMGY上清1 mL+10 μL Wako酶

⑤ pPICZαA-Lys-C/X-33 BMGY上清1 mL

⑥ 4 μL Wako 酶 +8 μL DDW+4 μL 還原上樣Buffer

⑦ 4 μL Wako 酶 +8 μL DDW+4 μL 非還原上樣Buffer

進(jìn)行TCA處理后，電泳檢測，結(jié)果見圖3。

圖2 pPICZαA-Lys-C/Top10F’單菌落抽提質(zhì)粒雙酶切鑒定圖

圖3 SDS-PAGE法檢測表達(dá)量結(jié)果

如圖3所示，Wako酶在還原與非還原條件下均呈主帶分子量為26 kDa的目的條帶，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［14-15］，即常規(guī)電泳檢測條件可準(zhǔn)確分析Wako公司Lys-C蛋白酶;將Lys-C蛋白酶還原至BMGY培養(yǎng)基上清，在還原條件下，主帶仍清晰可見，且其條帶粗細(xì)與還原前相似，即BMGY培養(yǎng)基上清未影響Lys-C蛋白酶電泳檢測;pPICZαALys-C/X-33表達(dá)菌誘導(dǎo)48 h上清液在Lys-C目的條帶處均未見明顯蛋白條帶，表明上述兩重組菌誘導(dǎo)48 h仍未產(chǎn)生明顯表達(dá)Lys-C蛋白酶。但pPICZαA-Lys-C/X-33表達(dá)菌誘導(dǎo)48 h上清液在44 kDa和80 kDa左右處有明顯蛋白條帶，可能為相關(guān)蛋白，可通過免疫斑點(diǎn)進(jìn)一步驗證。

2.3 免疫斑點(diǎn)法鑒定重組賴氨酸內(nèi)肽酶表達(dá)結(jié)果

檢測結(jié)果見圖4，其中:

第1排1～8號分別為:Wako酶100 μg/mL、10 mg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、Lys-C 硫酸銨沉淀上清+20 μL Wako酶、Lys-C硫酸銨沉淀上清+100 μL Wako 酶、稀釋液、100 μg/mL Trypsin。

第2排1～8號分別為:pPICZαA-Lys-C-1(未稀釋)、pPIC9K-ZαA-C-1(稀釋 10 倍)、pPICZαALys-C-2(未稀釋)、pPICZαA-Lys-C-2(稀釋10 倍)、pPICZαA-Lys-C-3(未稀釋)、pPICZαA-Lys-C-3(稀釋10 倍)、pPICZαA-Lys-C-4(未稀釋)、pPICZαALys-C-4(稀釋10倍)。

第3排 1～6號分別為:GS115、X-33、X-33+Wako酶、GS115+Wako 酶、pPICZαA-RL2、pPIC9KHVGL。

圖4 免疫斑點(diǎn)法檢測結(jié)果

由圖4中免疫斑點(diǎn)結(jié)果可知:陽性對照Wako酶正常顯色，誘導(dǎo)表達(dá)上清硫酸銨沉淀回收補(bǔ)加20 μL 和100 μL 的 Wako 酶均顯色，且補(bǔ)加100 μL的Wako酶比20 μL的 Wako酶顯色較深，非相關(guān)酶 100 μg/mL Trypsin 未顯色;pPICZαALys-C-3(未稀釋)顯色并顏色較深，可以判斷pPICZαA-Lys-C-3為重組賴氨酸內(nèi)肽酶有表達(dá)菌株;GS115未顯色，X-33輕微顯色，GS115+Wako酶和X-33+Wako酶均顯色，非相關(guān)物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)上清pPICZαA-RL2、pPIC9K-HVGL硫酸銨沉淀樣品均為顯色。

免疫斑點(diǎn)法結(jié)果分析后可以得知，Wako酶還原到硫酸銨沉淀法中依然可以檢測到其活性，說明硫酸銨沉淀法對此實(shí)驗結(jié)果無影響，非相關(guān)酶以及非相關(guān)物質(zhì)對免疫斑點(diǎn)結(jié)果亦無影響，pPICZαA-Lys-C-3為有活性表達(dá)的菌株，可將其保存并進(jìn)行下一步RP-HPLC法酶切活性鑒定試驗。

2.4 RP-HPLC法鑒定重組賴氨酸內(nèi)肽酶酶切活性結(jié)果

實(shí)驗樣品:將pPICZαA-Lys-C表達(dá)上清樣品用硫酸銨沉淀法沉淀，后用1 mL 50mMTris溶解，DDW透析過夜，得到樣品;酶切底物為門冬胰島素前體(PI-Asp、2 mg/mL)。實(shí)驗組設(shè)置:① PIASP+硫酸銨沉淀法沉淀的pPICZαA-Lys-C/X-33誘導(dǎo)表達(dá)上清;②PI-ASP未酶切樣品;③ PI－ASP+Wako酶(用50 mM Tris pH值8.7稀釋250倍)。

上述實(shí)驗組①～③按體積比1∶20與2.0 mg/mL門冬胰島素前體混合(即Lys-C蛋白酶與門冬胰島素前體酶切比例為1∶10000)，37℃酶切過夜處理，RP-HPLC檢測。門冬胰島素前體濃度:2 mg/mL;Wako酶濃度:1 mg/mL。檢測結(jié)果見圖5。

圖5 RP-HPLC法檢測酶切活性結(jié)果

由圖5可見:在50 mM Tris pH值8.7的條件下，Wako公司Lys-C蛋白酶可對門冬胰島素前體進(jìn)行較好的酶切;門冬胰島素前體出峰時間為12.264 min，門冬胰島素出峰時間為13.533 min;pPICZαA-Lys-C/X-33表達(dá)菌誘導(dǎo) 48 h上清液1∶20與門冬胰島素前體混合后，門冬胰島素前體峰未見明顯降低，且其圖譜與PI-ASP未酶切樣品無明顯差異，表明上述重組菌誘導(dǎo)48 h仍未產(chǎn)生明顯有活性的Lys-C蛋白酶。

3 結(jié)束語

在本實(shí)驗中，經(jīng)過核酸蛋白電泳、SDS-PAGE電泳(聚丙烯酰胺凝膠電泳法)和免疫斑點(diǎn)法檢測結(jié)果表示，重組的賴氨酸內(nèi)肽酶在結(jié)構(gòu)和表達(dá)上都能重現(xiàn)賴氨酸內(nèi)肽酶的特性，然而在RP-HPLC酶切活性法檢測中，重組菌誘導(dǎo)的48 h后的 Lys-C不能完整地酶切門冬胰島素前體，說明重組賴氨酸內(nèi)肽酶的活性不穩(wěn)定。在后續(xù)的實(shí)驗中方案，可以適當(dāng)延長誘導(dǎo)時間，分別取不同時間點(diǎn)的誘導(dǎo)上清進(jìn)行酶活性檢測。同時也可使用蛋白純化方法對重組菌誘導(dǎo)上清進(jìn)行純化，以提高其活性，使重組賴氨酸內(nèi)肽酶能夠更好地應(yīng)用于胰島素的制備工藝中，并與天然的賴氨酸內(nèi)肽酶相比具有相同的酶切作用。

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