在線固相萃取-高效液相色譜法快速檢測(cè)辣椒粉中的蘇丹紅

朱群英，朱玉玲，索莉莉，李　良（南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330038）

在線固相萃取-高效液相色譜法快速檢測(cè)辣椒粉中的蘇丹紅

朱群英，朱玉玲，索莉莉，李良
（南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330038）

建立在線固相萃取-高效液相色譜快速檢測(cè)辣椒粉中蘇丹紅染料的方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取離心過濾后直接進(jìn)樣，在富集柱上進(jìn)行純化和富集，通過閥的切換把富集柱上的被測(cè)組分蘇丹紅轉(zhuǎn)移至分析柱上分離，外標(biāo)峰面積法定量。四種蘇丹紅在1～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r≥0.9992），檢出限為1.0～1.95 ng/g，加標(biāo)回收率為86.2%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.18%。該方法簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確可靠，滿足辣椒粉中蘇丹紅染料的快速檢測(cè)要求。

在線固相萃取，高效液相色譜，蘇丹紅，快速檢測(cè)，辣椒粉

蘇丹紅是化學(xué)合成的紅色偶氮類工業(yè)染料，主要包括蘇丹紅Ⅰ號(hào)、蘇丹紅Ⅱ號(hào)、蘇丹紅Ⅲ號(hào)、蘇丹紅Ⅳ號(hào)。經(jīng)毒理學(xué)研究表明，蘇丹紅具有致突變性和致癌性［1-2］，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將蘇丹紅歸為三類致癌物，歐盟和我國(guó)已明令禁止將蘇丹紅作為色素添加于食品中，因此，為防止蘇丹紅染料在食品中的濫用，必需建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，以保障食品安全及消費(fèi)者健康。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蘇丹紅的檢測(cè)常用的方法有液相色譜法［3-11］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［12-16］，由于食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，為不干擾檢測(cè)，提取后的樣品需采用柱層析［3-4，13］、固相萃取［6，10，15］、固相分散萃取［5，9］、凝膠色譜［7，11-12，14，16］等方式對(duì)樣品進(jìn)行凈化和濃縮，這些樣品凈化方法耗時(shí)長(zhǎng)，不利于快速分析。本文采用在線固相萃?。∣nline SPE）-高效液相色譜法檢測(cè)辣椒粉中蘇丹紅染料，該方法無須經(jīng)過繁瑣的前處理過程，樣品經(jīng)乙腈超聲提取過濾后直接進(jìn)樣，樣品的凈化和濃縮完全由在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)自動(dòng)完成，大大節(jié)約了樣品檢測(cè)的時(shí)間。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甲醇、乙腈色譜純，Honeywell公司；超純水（18.2 MΩ cm） 由純水機(jī)制備；標(biāo)準(zhǔn)品：蘇丹紅Ⅰ號(hào)（CAS：842-07-9）、蘇丹紅Ⅱ（CAS：3118-97-6）、蘇丹紅Ⅲ（CAS：85-86-9）、蘇丹紅Ⅳ（CAS：85-83-6）號(hào)均購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于98.5%。

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀美國(guó)賽默飛世爾公司（配制在線脫氣機(jī)，雙三元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，帶有六通閥的柱溫箱，二極管陣列檢測(cè)器（DAD），變色龍7.1色譜管理軟件）；富集柱為AcclaimTMPAⅡ120 C18（3 μm，4.6 mm×50 mm） Themo Fisher公司；ACQUITY BEH Phenyl（1.7 μm，2.1 mm× 100 mm） Waters公司；Milli-Q Direct8超純水機(jī)默克密理博；KQ-500DB型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1在線固相萃取與色譜分離條件柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：478 nm（蘇丹紅Ⅰ號(hào)）和520 nm（蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ號(hào)）；進(jìn)樣量1.0 mL；流速：左泵（富集泵））為1.2 mL/min，右泵（分析泵）為0.6 mL/min；兩泵的梯度洗脫程序及六通閥的切換程序見表1；在線固相萃取-液相色譜分析流路見圖1。

表1　梯度洗脫程序及閥切換程序Table 1　Gradient elution program and valve switching program

圖1　在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)連接圖Fig.1　The system linking graph of on line solid phase extraction-high performance liquid chromatography

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ號(hào)各1 mg（精確到0.01 mg），分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈超聲溶解并定容至刻度，于4℃冰箱中保存，有效期6個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取各蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ號(hào)儲(chǔ)備液各0.1 mL，用乙腈定容到10 mL，于4℃冰箱中保存，有效期2個(gè)月。

用移液器吸取蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（1 μg/mL）適量，用乙腈配制成濃度分別為2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，臨用時(shí)現(xiàn)配。

1.2.3樣品的制備稱取2.00 g辣椒粉于50 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦漩振蕩1 min，超聲提取20 min，10000 r/min高速離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，待凈化分析。

1.2.4回收率和精密度實(shí)驗(yàn)取空白辣椒粉，分別加入高、中、低三個(gè)濃度的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3的樣品前處理方法處理樣品后上機(jī)測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次。

2　結(jié)果與討論

2.1On line SPE條件的優(yōu)化

2.1.1上樣泵流動(dòng)相在線固相萃取樣品處理過程中，樣品經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣后是通過上樣泵的流動(dòng)相將其從進(jìn)樣器引入到在線SPE柱上進(jìn)行富集和純化的。因此流動(dòng)相的選擇對(duì)在線固相萃取效果有顯著影響，為得到合適的上樣泵流動(dòng)相，本實(shí)驗(yàn)首先考察了不同比例的乙腈和水作為上樣泵流動(dòng)相時(shí)的萃取效果。結(jié)果表明當(dāng)乙腈比例為10%時(shí)，蘇丹紅Ⅰ保留在富集柱上不被洗脫下來，但是蘇丹紅Ⅰ峰前置。經(jīng)研究，加入一定量的甲醇后峰形有所改善，考慮到用乙腈提取的樣品雜質(zhì)在富集柱上保留比較強(qiáng)，最后選用表1的梯度洗脫程序。

2.1.2閥切換時(shí)間一個(gè)完整的在線固相萃取-液相色譜分析過程主要樣品組分的凈化富集、目標(biāo)組分的轉(zhuǎn)移和色譜分離3個(gè)過程。即樣品組分首先由上樣泵流動(dòng)相從進(jìn)樣器引入到在線SPE柱上進(jìn)行富集（純化），分析物蘇丹紅被保留在SPE柱上而樣品基質(zhì)干擾物則從柱上流出并排至廢液瓶中；然后切換閥的位置，通過分析泵流動(dòng)相將分析物蘇丹紅從SPE柱上反向洗脫至分析柱；再將閥切換至初始位置，分析泵對(duì)分析柱上分析物繼續(xù)進(jìn)行分離分析，而上樣泵則對(duì)SPE小柱進(jìn)行清洗和平衡，為下一針進(jìn)樣準(zhǔn)備。因此，閥的切換時(shí)間是影響蘇丹紅在線富集和凈化效果的另一個(gè)重要因素，為了確定合適的閥切換時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)兩次閥切時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)谝淮伍y切換的時(shí)間小于5 min時(shí)，雜質(zhì)清洗不完全，而閥切時(shí)間大于8 min時(shí)，蘇丹紅有部分流失到廢液，回收率降低，因此實(shí)驗(yàn)最后選擇6 min作為第一次閥切換的時(shí)間。為了更好地對(duì)富集柱進(jìn)行平衡，提高分析效率，在保證被測(cè)組分完全轉(zhuǎn)移到分析柱后，需將閥切換回初始狀態(tài)，當(dāng)閥切換時(shí)間小于11 min時(shí)，蘇丹紅Ⅳ回收率降低，故最后選在13 min時(shí)將閥切換回到初始位置。

2.2分析泵流動(dòng)相的優(yōu)化

當(dāng)選用100%的乙腈為流動(dòng)相時(shí)，蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液能夠分離，但當(dāng)對(duì)樣品加標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，因樣品中含有部分雜質(zhì)，雜質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不能分離，所以在流動(dòng)相中加入不同比例的甲醇和水，結(jié)果表明，當(dāng)選用表1的梯度洗脫程序洗脫時(shí)，四種物質(zhì)加標(biāo)溶液能完全分離，出峰時(shí)間快，峰形也較好，標(biāo)準(zhǔn)和樣品加標(biāo)圖譜見圖2。

圖2　不同溶液經(jīng)在線固相萃取后的高效液相色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms obtained after online-SPE

2.3方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法的檢出限和定量限進(jìn)1.2.2中標(biāo)準(zhǔn)系列各1 mL，以待測(cè)化合物峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（見表2）。

表2　四種蘇丹紅的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 2　Four kinds of Sudan linear equations，linear range，correlation coefficient，the lower limit of detection and quantitation

用空白樣品作為基質(zhì)，添加不同量的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)，按1.2.3的樣品前處理方法進(jìn)行處理后上機(jī)檢測(cè)，以S/N=3為檢出限，S/N=10為定量限（見表2）。

由表2可知，采用外標(biāo)峰面積法定量，四種被蘇丹紅的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.9992，與國(guó)標(biāo)方法比較，可較好地克服樣品濃縮、凈化等樣品前處理過程帶來的誤差，該方法線性范圍寬，檢出限低于國(guó)標(biāo)方法的10 ng/g，可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)。

2.3.2方法的回收率和精密度根據(jù)1.2.4的實(shí)驗(yàn)，計(jì)算四種化合物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表3　四種蘇丹紅的回收率和精密度（n=6）Table 3　Four kinds of Sudan’s recovery and precision（n=6）

由表3可知，樣品經(jīng)乙腈超聲提取后直接測(cè)定，可以避免繁瑣的前處理過程帶來的誤差，所以，在線性范圍內(nèi)，四種化合物都有較好的回收率且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取高、中、低三個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化好的色譜條件每隔1 h進(jìn)樣一次，連續(xù)6次，四種蘇丹紅峰面積的RSD%在1.21%～2.33%之間；每隔5 d進(jìn)樣一次，連續(xù)6次，四種蘇丹紅峰面積的RSD在1.80%～4.50%之間；由此可知，在線固相萃取-液相色譜法檢測(cè)辣椒粉中的蘇丹紅，具有良好的日間和日內(nèi)穩(wěn)定性，四種蘇丹紅在一個(gè)月內(nèi)濃度無明顯變化。

2.3.4實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用該方法分別檢測(cè)市場(chǎng)上的20件辣椒粉樣品，均未檢測(cè)出蘇丹紅。

3　結(jié)論

本文將固相萃取與高效液相色譜相技術(shù)在線聯(lián)用，建立了一種快速測(cè)定辣椒粉中蘇丹紅染料的在線固相萃取-高效液相色譜分析方法。該方法實(shí)現(xiàn)了樣品的進(jìn)樣、富集和凈化過程的完全自動(dòng)化，成功地完成了辣椒粉中蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ4種染料的同時(shí)測(cè)定，有效地避免了離線固相萃取中人工操作帶來的誤差，并克服了標(biāo)準(zhǔn)方法中使用特定活性的中性氧化鋁凈化樣品耗時(shí)、耗力的缺陷。方法操作簡(jiǎn)便快速、且具有很好的精密度和準(zhǔn)確度，可用于辣椒粉中蘇丹紅染料的日常監(jiān)測(cè)。

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Rapid determination of sudan dyes in chilli power by online solid phase extraction-high performance liquid chromatography

ZHU Qun-ying，ZHU Yu-ling，SUO Li-li，LI Liang
（Nanchang Center for Disease Prevetion and Control，Nanchang 330038，China）

A novel method was developed for the rapid determination of sudan dyes in chilli power by online solid-phase extraction coupled to high liquid performance chromatography（online SPE-HPLC）.Chilli power was extracted with acetonitrile.Then the extract was centrifuged and filtered.After that，1 mL of extract was injected into online SPE system by autosampler and delivered to the SPE column for purification and enrichment using loading pump.After clean-up step，the online SPE column was switched to the analytical flow path by valve switching and the analytes were back flushed to the analytical column using analytical pump for the further determination.Under the optimized conditions，good linearities were obtained in the range from 1 ng/mL to 200 ng/mL for the four sudan dyes，with correlation coefficients above 0.9996.The limits of detection for all the analytes ranged from 1.0 ng/g to 1.95 ng/g.The method recoveries of four analytes at three spiked levels ranged between 86.2%and 101.6%，with relative standard deviations less than 6.18%.The proposed method was simple，rapid，accurate and reliable，and could be applied to the rapid determination of sudan dyes in chilli power.

onlinesolidphaseextraction；highperformance liquid chromatography；sudan dye；rapid determination；chilli power

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0067-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.005

2015－04－07

朱群英（1980-），女，碩士，主管技師，研究方向：食品理化檢驗(yàn)，E-mail：zqy0797@163.com。

江西省科技計(jì)劃（20142BBG70032）。