EGCG-CS-PAA納米粒制備及其穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究

侯紹云，洪志勇，應(yīng)　浩，侯善欣，黃美蓉，杜琪珍（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310000）

EGCG-CS-PAA納米粒制備及其穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究

侯紹云，洪志勇，應(yīng)浩，侯善欣，黃美蓉，杜琪珍*
（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310000）

為保護(hù)EGCG的抗氧化活性，利用殼聚糖（CS）和聚天冬氨酸（PAA）之間離子交聯(lián)作用制備CS-PAA納米粒載體，裝載表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）。結(jié)果表明：CS/PAA質(zhì)量比、溶液pH、攪拌時(shí)間以及鹽濃度對(duì)納米體系的粒徑、Zeta電位、包埋率等具有顯著影響。在CS/PAA（w/w）為1.0、pH為3.5、反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，制備的EGCG-CS-PAA納米粒在粒徑和表面電荷等物理特征為最佳。采用FRAP法對(duì)EGCG-CS-PAA納米粒的抗氧化活性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示納米體系對(duì)EGCG活性具有良好的保護(hù)作用。同時(shí)EGCG-CS-PAA納米體系能在高溫、堿性等環(huán)境下起到較好的保護(hù)EGCG的作用。

EGCG，殼聚糖，納米粒，抗氧化活性

EGCG是一種酯型兒茶素，是茶多酚中活性最強(qiáng)的一種兒茶素單體［1］。近年的研究表明，EGCG具有抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管疾病、降低血糖血脂、提高機(jī)體免疫力等多種生理功能［2-5］。然而EGCG性質(zhì)很不穩(wěn)定，易受光、氧、溫度、pH等外界因素的影響而發(fā)生變化［6-7］。其次EGCG在腸胃滯留時(shí)間短、滲透性差、容易受胃腸環(huán)境（如pH、酶等）的影響而變得不穩(wěn)定，從而使EGCG口服的生物利用度大大降低［8］。因此，EGCG在食品、醫(yī)藥保健等方面的實(shí)際應(yīng)用具有較大的局限性。

納米微膠囊，其顆粒微小，易于分散和懸浮在水中，形成均一穩(wěn)定的膠體溶液，并且具有良好的靶向性和緩釋作用［9］。通過將功能因子包裹于納米粒子內(nèi)部，能夠提高功能因子的穩(wěn)定性，促使其活性的最大發(fā)揮。近年來，采用納米微膠囊技術(shù)包埋兒茶素以及茶多酚已經(jīng)有很多報(bào)道［10-12］。殼聚糖擁有較好的生物相容性、生物可降解性和粘膜粘附作用等特性［13］，常被用來作為制備納米載體材料。同時(shí)，聚天冬氨基酸（PAA）具有無毒和生物降解性，也是理想的載體材料［14］。因此，本文研究通過殼聚糖（CS）和聚天冬氨酸（PAA）之間離子交聯(lián)作用制備CS-PAA納米粒載體，以此裝載EGCG，并且研究了EGCG-CS-PAA納米分散體系對(duì)EGCG抗氧化活性的保護(hù)作用。研究結(jié)果對(duì)于EGCG在食品、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用具有參考價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

EGCG（98%）無錫太陽綠寶科技有限公司；PAA（分子量30～50 ku） 張家港星宇科技有限公司；CS（分子量3～10 ku）浙江澳興生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，華東醫(yī)藥股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

5810R型離心機(jī)美國Eppendorf公司；Zetasizer Nano-ZS激光粒度儀英國Malvern；UV3600紫外-可見分光光度計(jì)、LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司；JEM-1230透射電鏡日本JEOL；JB-3漩渦儀

上海雷磁新涇儀器有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Millipore Amicon Ultra-15超濾離心管上?？￡缮锟萍加邢薰?。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CS-PAA納米分散體系和EGCG-CS-PAA納米分散體系的制備參照Deh-Wei Tang等［15］制備殼聚糖納米粒的方法。稱取一定質(zhì)量的CS溶解在1%乙酸溶液中，將10 mL CS溶液緩慢滴加到10 mL濃度為2 mg/mL PAA水溶液中，邊滴邊攪拌，以每秒一滴速度滴加，攪拌速度800 r/min，滴加完畢繼續(xù)攪拌60 min，得到CS-PAA納米分散體系。

本研究考察下述4個(gè)制備因素對(duì)CS-PAA納米粒的影響：（1）攪拌時(shí)間（5、10、20、30、40、60、90 min），其他條件為CS/PAA（w/w）為1.0；（2）溶液的pH（pH= 2.0、2.5、3.5、4.5、5.0、6.0、7.0），其他條件為CS/PAA（w/w）為1.0，攪拌時(shí)間60 min；（3）CS與PAA的質(zhì)量比（0.75、1.0、1.5、2.0、2.5），其他條件為攪拌時(shí)間60 min，pH為3.5；（4）NaCl的濃度（0、10、20、30、40、50 mg/mL），其他條件為CS/PAA（w/w）為1.0，攪拌時(shí)間60 min，pH為3.5。

選用CS-PAA納米粒優(yōu)化的制備參數(shù)，稱取一定質(zhì)量的CS和EGCG（濃度為1、2、3、4、5 mg/mL）溶解在1%醋酸溶液中，移取10 mL含有EGCG的CS溶液緩慢滴加到10 mL濃度為2 mg/mL PAA水溶液中，邊滴邊攪拌，以每秒一滴速度滴加，攪拌速度800 r/min，滴加完畢繼續(xù)攪拌60 min，得到EGCG-CS-PAA納米分散體系。

1.2.2粒徑及Zeta電位的測定CS-PAA納米粒和EGCG-CS-PAA納米粒的平均粒徑（Dh）和粒徑的分散情況（PDI）采用英國Malvern公司的Nano-ZS型激光粒度儀，散射角為90°，測試溫度（25±0.1）℃，掃描波長633 nm。

1.2.3包埋率的測定取2 mL EGCG納米粒溶液于超濾濃縮離心管，4℃條件下4000×g離心30 min，收集離心后的液體，通過HPLC對(duì)超濾離心管中游離的EGCG進(jìn)行定量測定。HPLC的檢測條件：流動(dòng)相A相為0.2%的乙酸；流動(dòng)相B相為100%乙腈；梯度洗脫條件：0～16 min，6.5%～25%；16～30 min，25%～6.5%；30～35 min，6.5%；色譜柱Symmetry?C18（5 μm，4.6 mm× 250 mm），柱溫40℃，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量10 μL。配制0.5～2.5 mg/mL共5個(gè)濃度梯度EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=8×10-7X-0.0024（R2=0.9999），其中X為峰面積，Y為EGCG濃度（mg/mL）。

1.2.4EGCG-CS-PAA納米粒的微觀結(jié)構(gòu)采用透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察EGCG-CS-PAA納米粒（1 mg/mL）的表面形態(tài)及大小。將EGCG-CS-PAA納米溶液樣品滴在銅網(wǎng)表面，磷鎢酸染色后，用濾紙擦凈多余的樣品溶液，在空氣中風(fēng)干后進(jìn)行電鏡觀察。測試加速電壓為80 kV。

1.2.5FRAP測定EGCG-CS-PAA納米粒的抗氧化活性采用FRAP法測定抗氧化活性［16］，取0.1 mL待測溶液加入到2.9 mL TPTZ工作液（25 mL pH=3.6的300 mmol/L醋酸鹽緩沖液、2.5 m 10 mmol/L TPTZ溶液、2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配）混勻后于37℃水浴孵育30 min，于593 nm處測定其吸光值，以PBS緩沖液與TPTZ工作液混合作為空白對(duì)照。EGCG自由液與EGCG納米液在室溫下存放，每隔24 h取樣測定。

1.2.6高溫下EGCG-CS-PAA納米粒對(duì)EGCG的保護(hù)作用取50 mL EGCG納米液（1 mg/mL）置于80℃的恒溫條件下孵育，在不同時(shí)間段取樣（2、4、6、8、10、12、14、20、44、68、92 h），采用HPLC分析納米體系中EGCG的含量，計(jì)算EGCG的保留率。以相同濃度的EGCG溶液為對(duì)照。

1.2.7堿性條件下（pH7.2）EGCG-CS-PAA納米體系對(duì)EGCG的保護(hù)作用取一定量的EGCG-CS-PAA納米粒，加入到15 mL的pH 7.2的磷酸緩沖液中，于37℃的恒溫條件下孵育，在1、2、3、4 h時(shí)間點(diǎn)，用HPLC分析EGCG納米液中EGCG的含量，計(jì)算EGCG的保留率。用磷酸緩沖液配制相同濃度的EGCG溶液作為對(duì)照。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS V8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組樣品間的差異顯著性分析采用Student’s t檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)，p＜0.05表示差異顯著性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1CS/PAA質(zhì)量比對(duì)CS-PAA納米粒的影響

表1　不同CS/PAA質(zhì)量比制備的CS-PAA納米粒的平均粒徑、分散系數(shù)、Zeta電位（mean±SD，n=3）Table 1　The diameter，polydispersity index and Zeta potential of the nanoparticles（CS-PAA NP）prepared with various ratio of chitosan/polyaspartic acid（mean±SD，n=3）

CS/PAA質(zhì)量比對(duì)CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表1所示。Zeta電位是反應(yīng)納米體系穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，Zeta電位絕對(duì)值越高，小顆粒間斥力越大，不易聚集，從而更有利于穩(wěn)定性。通常認(rèn)為，穩(wěn)定體系納米粒Zeta電位的絕對(duì)值應(yīng)大于30 mV［17］。隨著CS/PAA質(zhì)量比的增加，納米粒的粒徑、Zeta電位以及分散指數(shù)逐漸增大。Zeta隨著殼聚糖用量的增加，纏繞在納米粒表面的CS越來越多，納米粒表面電荷增多，Zeta電位逐漸增加，從而形成親水性保護(hù)膜。在CS/PAA質(zhì)量比為1.0時(shí)，Zeta電位已經(jīng)顯示出較穩(wěn)定（31.8 mV）。所以本研究選用CS/PAA質(zhì)量比為1作為后續(xù)研究。

2.2pH對(duì)CS-PAA納米粒的影響

pH對(duì)CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表2所示，納米粒粒徑隨著pH的不斷增大，粒徑先減小后增大，在pH＞5溶液出現(xiàn)渾濁。在pH=3.5時(shí)，粒徑最小，Zeta電位的絕對(duì)值最大，納米體系比較穩(wěn)定。

表2　不同pH所制備的CS-PAA納米粒粒徑，PDI及Zeta電位Table 2　Effect of solution pH values on mean particle size and zeta-potential of CS-PAA nanoparticles

2.3攪拌時(shí)間對(duì)CS-PAA納米粒的影響

攪拌時(shí)間對(duì)CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表3所示，不同的攪拌時(shí)間，平均粒徑具有顯著性差別，60 min效果最佳。體系反應(yīng)60 min后，納米粒交聯(lián)達(dá)到充分飽和，繼續(xù)反應(yīng)納米顆粒之間容易聚集，納米粒粒徑增大，后續(xù)研究選用攪拌時(shí)間為60 min。

表3　不同攪拌時(shí)間制備的納米粒粒徑，PDI和Zeta電位Table 3　Effect of reaction time on the mean size，PDI and Zeta-potential of nanoparticles

2.4NaCl的濃度對(duì)CS-PAA納米粒的影響

NaCl的濃度對(duì)CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表4所示，隨著體系NaCl濃度的增加，納米粒子的平均粒徑逐漸增大，且分散指數(shù)不斷增大，粒子的分散呈不均勻狀態(tài)，粒子表面電荷也逐漸減小。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到50 mg/mL時(shí)，體系出現(xiàn)明顯的沉淀。后續(xù)研究選用NaCl的濃度為0。

2.5EGCG-CS-PAA納米體系的表征

選用上述制備CS-PAA納米的最佳條件（CS/PAA質(zhì)量比1.0，pH為3.5，NaCl的濃度為0，攪拌時(shí)間60 min）制備EGCG-CS-PAA納米粒。EGCG-CS-PAA納米粒的平均粒徑Dh、PDI、Zeta電位、包封率EE如表5所示，隨著EGCG濃度的增加，粒徑有所增加，電位下降，包封率下降。相比于CS-PGA（聚谷氨酸）包埋，CS、PAA所制備的納米粒具有更高的包封率［18］。

表5　EGCG-CS-PAA納米粒的粒徑Dh、PDI、Zeta電位、包封率EETable 5　The average diameter，polydispersity index and Zeta potential of the EGCG loaded nanoparticles（EGCG-CS-PAA NP）prepared with chitosanand polyaspartic acid

2.6EGCG-CS-PAA納米粒的微觀形態(tài)觀察

通過透射電子顯微電鏡（TEM）觀察納米粒微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示，圖1-A顯示納米粒經(jīng)透射電鏡在0.2 μm觀察范圍內(nèi)，納米粒子呈均勻的球形，分布均勻，無明顯的聚集。圖1-B顯示，所測的納米粒徑在90 nm左右，由于TEM測量過程中需要干燥，測量的粒徑比動(dòng)態(tài)光散射測得水合粒徑?。?9］。

圖1EGCG-CS-PAA納米粒透射電鏡觀察的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1　TEM micrographs of EGCG-CS-PAA nanoparticles：A×50K，B×150K

2.7FRAP法對(duì)EGCG-CS-PAA納米?？寡趸钚苑治?/p>

通過FRAR法對(duì)EGCG-CS-PAA納米?？寡趸钚苑治鋈鐖D2所示，隨著時(shí)間的延續(xù)，EGCG-CS-PAA納米粒抗氧化活性大于自由EGCG，說明納米粒對(duì)EGCG具有較好的保護(hù)作用。

圖2FRAP法測EGCG納米粒的抗氧化活性Fig.2　Antioxidant activities of EGCG nanoparticles by FRAP

2.8EGCG-CS-PAA納米粒在高溫條件對(duì)EGCG的保護(hù)作用

EGCG-CS-PAA納米粒在高溫條件下對(duì)ECGG的保護(hù)作用如圖3所示，納米粒組中EGCG含量下降的趨勢明顯緩于自由EGCG，在高溫92 h過后，EGCG納米體系中EGCG保留率依然45.7%，遠(yuǎn)高于EGCG自由液的含量。這表明所制備的EGCG-CS-PAA納米體系能在高溫條件下對(duì)EGCG的穩(wěn)定性具有較好的保護(hù)作用。

圖3　80℃下EGCGG納米粒中EGCG的保留率Fig.3　The EGCG remaining in EGCG nanoparticles at high temperature

2.9EGCG-CS-PAA納米粒在堿性條件（pH7.2）對(duì)EGCG穩(wěn)定性的保護(hù)作用

EGCG-CS-PAA納米粒在高溫條件下對(duì)ECGG的保護(hù)作用如圖4所示，EGCG在堿性環(huán)境下迅速分解，經(jīng)過2 h EGCG保留率迅速下降為11.6%，再經(jīng)過2 h EGCG幾乎分解完全。EGCG-CS-PAA納米粒在前1 h EGCG保留率下降較快56%，可能因?yàn)镋GCG納米粒表面吸附的游離EGCG迅速被分解，隨后下降趨勢平緩，經(jīng)過4 h后其EGCG保留率還有33.1%。說明EGCG-CS-PAA納米粒對(duì)EGCG在堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性具有較好的保護(hù)作用。

圖4　EGCG納米粒在pH7.2堿性環(huán)境下對(duì)EGCG的保護(hù)作用Fig.4　The EGCG remaining of EGCG nanoparticles at alcaline environment，pH7.2

3　結(jié)論

利用CS和PAA之間離子交聯(lián)作用制備CS-PAA納米粒載體，以此裝載EGCG。CS/PAA質(zhì)量比、pH、攪拌時(shí)間及離子濃度對(duì)納米粒的粒徑、Zeta電位、載藥率都有顯著的影響。在CS/PAA質(zhì)量比為1.0、pH為3.5、反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，制備出的EGCG-CS-PAA納米粒在粒徑和表面電荷等物理特征為最佳。FRAP法對(duì)EGCG-CS-PAA納米粒的抗氧化活性分析表明：納米體系對(duì)EGCG的抗氧化活性具有良好的保護(hù)作用。EGCG-CS-PAA納米體系能在高溫、堿性等環(huán)境下起到較好的保護(hù)EGCG的作用，對(duì)EGCG在食品、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

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Preservation of EGCG antioxidant properties by loading CS-PAA nanoparticles

HOU Shao-yun，HONG Zhi-yong，YING Hao，HOU Shan-xin，HUANG Mei-rong，DU Qi-zhen*
（Institute of Food and Biological Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310000，China）

（-）-Epigallocatechin-3-gallate（EGCG）was loaded in chitosan nanoparticles for the preservation of antioxidant activity.The effects of the weight ratio of CS to PAA，pH，the reaction time and the concentration of NaCl on the properties of EGCG-CS-PAA complexes were studied.All four factors significantly influenced the particle size，the Zeta potential，and the entrapment efficiency of EGCG.A stable and clear solution system could be obtained at pH3.5.The best EGCG-CS-PAA nanoparticles was obtained with the reaction time at 1 hour and the weight ratio of 1∶1（CS∶PAA）．Sustained free radical（ABTS＋·）scavenging assays showed that the antioxidant activity of EGCG was retained by the nanoparticles.Meanwhile，EGCG nanoparticles were found to be a better protection of EGCG at high temperature and alkaline.

EGCG；chitosan；nanoparticles；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.016

2015－04－09

侯紹云（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與功能因子，E-mail：15700070466@163.com。

杜琪珍（1963-），男，教授，研究方向，食品化學(xué)與功能因子，E-mail：qizhendu@163.com。

十二五國家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD36B06）。