鱈魚骨膠原肽的制備及其對成骨樣MG-63細(xì)胞作用機(jī)制的研究

王珊珊，張朝輝，趙　雪，侯　虎，李八方，*（.中國海洋大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，黃海水產(chǎn)研究所，山東青島26607）

鱈魚骨膠原肽的制備及其對成骨樣MG-63細(xì)胞作用機(jī)制的研究

王珊珊1，2，張朝輝1，趙雪1，侯虎1，李八方1，*
（1.中國海洋大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071）

以水產(chǎn)加工下腳料鱈魚骨為原料，對其進(jìn)行基本組成分析與組織結(jié)構(gòu)觀察。從鱈魚骨中提取膠原蛋白并酶解制得不同分子量段的膠原肽。探討不同分子量膠原肽組分對MG-63細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性及相關(guān)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、骨保護(hù)素（OPG）與核因子-κB受體活化因子配基（RANKL）mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明：鱈魚骨中蛋白質(zhì)含量較高（14.5%），Van Gieson染色發(fā)現(xiàn)鱈魚骨中含有大量的膠原蛋白纖維。鱈魚骨膠原肽能夠提高細(xì)胞ALP活性，同時(shí)顯著上調(diào)細(xì)胞BMP-2 mRNA的表達(dá)水平；鱈魚骨膠原肽可有效提高細(xì)胞OPG/RANKL mRNA的相對表達(dá)量，以間接對破骨細(xì)胞的成熟及活化進(jìn)行調(diào)控。鱈魚骨可作為一種優(yōu)良的天然蛋白源，鱈魚骨膠原肽能夠作為一種有效的抗骨質(zhì)疏松營養(yǎng)強(qiáng)化劑加以開發(fā)。

鱈魚骨，膠原肽，酶解制備，成骨細(xì)胞

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。為了維持骨的相對穩(wěn)定狀態(tài)，在多種激素、細(xì)胞因子和其他調(diào)節(jié)因子的協(xié)調(diào)作用下，骨組織不斷吸收舊骨，生長新骨，骨形成與骨吸收維持在相對平衡的穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)這種平衡被打破后，骨形成與骨吸收的比例逐漸下降，骨量隨之丟失，逐漸發(fā)展為骨質(zhì)疏松。骨重建的失衡是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［1-4］。因此任何物質(zhì)如果能直接或間接作用于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞，在抑制破骨細(xì)胞活化的同時(shí)刺激骨的形成，則有可能作為促進(jìn)骨形成和增加骨量的有效途徑。目前治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)藥物雖然種類繁多，但是普遍具有一定的副作用，作為預(yù)防措施使用時(shí)不能長期服用，因此尋找副作用小、可以長期服用的能夠預(yù)防骨質(zhì)疏松的生物活性物質(zhì)已經(jīng)成為重要的研究方向［5］。

鱈魚是我國遠(yuǎn)洋漁業(yè)的重要捕撈對象之一，在加工生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物，其中魚骨約占魚體重量的15%［6］。魚骨蘊(yùn)含豐富的膠原蛋白，是優(yōu)良的天然蛋白源。譚洪亮等從金槍魚骨中制備出具有抗氧化活性的膠原肽，對羥自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用［7］。趙玲等［8］酶解制備的鱈魚骨膠原肽對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，其中對羥自由基的清除能力最強(qiáng)且有較好的量效關(guān)系。陸劍鋒等［9］以斑點(diǎn)叉尾魚骨為原料制備膠原肽螯合鈣，其肽鈣螯合率達(dá)82.53%。因此從鱈魚骨中制備具有抗骨質(zhì)疏松活性的膠原肽，不僅可以增加鱈魚骨的綜合利用價(jià)值，還可為新型抗骨質(zhì)疏松營養(yǎng)強(qiáng)化劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用商品蛋白酶水解制備鱈魚骨膠原肽，并探討其對MG-63細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性，以及對細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響，為鱈魚骨膠原肽的生物活性研究和綜合開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

冷凍鱈魚（Gadus macrocephalus）魚排青島福生食品有限公司；人成骨樣MG-63細(xì)胞中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胰蛋白酶（2.4×105U/g），中性蛋白酶（1.8×105U/g）南寧龐博生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清美國Gibco公司；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）測定試劑盒南京建成生物工程研究所；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、β-actin上海生工生物有限公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶普洛麥格生物技術(shù)有限公司；DNA marker DL2000 TaKaRa生物工程有限公司。

PHS-2F精密酸度計(jì)上海精密科學(xué)儀器公司；680型酶標(biāo)儀美國BIO-RAD公司；BH-2型顯微鏡OLYMPUS公司；TDL-5大容量低速離心機(jī)上海市安亭儀器廠；ZHCHENG恒溫培養(yǎng)振蕩箱上海智誠儀器制造有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì)日本Shimadzu公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基本組成分析水分測定：恒溫干燥法（GB 5009.3-2010）；蛋白質(zhì)測定：凱氏定氮法（GB 5009.5-2010）；灰分的測定：灰化法（GB 5009.4-2010）；粗脂肪的測定：索氏抽提法（GB/T 14772-2008）。

1.2.2組織結(jié)構(gòu)觀察將魚骨于中性甲醛中固定24 h，流水沖洗12 h。將固定后的樣品置于0.5 mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）溶液（pH7.2）中脫鈣5 d。對脫鈣魚骨進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行Van Gieson染色［10］。

1.2.3鱈魚骨膠原肽的酶解制備

1.2.3.1鱈魚骨明膠的制備將魚排切成5 cm左右，取1 kg原料，加入5 g中性蛋白酶和1000 mL水進(jìn)行酶解（55℃，pH7.5）2 h。酶解結(jié)束后洗去雜質(zhì)，將魚骨放入0.1 mol/L NaOH溶液（w/v，1∶10）攪拌24 h，以去除殘留的鹽溶性蛋白。將清洗后的魚骨使用4%HCl溶液處理18 h，溶脹結(jié)束后魚骨清洗至中性勻漿。熱水抽提溫度設(shè)置為70℃，提取時(shí)間設(shè)置為8 h。熱水抽提后離心（4000 r/min，15 min）獲得上清液，冷凍干燥后得到鱈魚骨膠原蛋白［11］。

1.2.3.2鱈魚骨膠原肽的制備將鱈魚骨膠原蛋白溶液調(diào)至濃度為5%，使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為8.0。使用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，條件設(shè)置為：酶解溫度50℃，酶解時(shí)間90 min，加酶量1.5%。酶解結(jié)束后于沸水浴中滅活5 min，迅速冷卻至室溫后以4000 r/min離心15 min，取上清液即為鱈魚骨膠原肽酶解液（Bone Collagen Hydrolysates，BCH）。依次使用截留分子量為2000 U與6000 U的超濾膜截留得到不同分子量的膠原肽溶液，其分子量范圍分別為：BCH1：2000 U＜Mw＜6000 U；BCH2：Mw＜2000 U。將溶液透析除鹽后凍干備用。

1.2.4對細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，以DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為4×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。貼壁24 h后棄培養(yǎng)液，分別加入含BCH1、BCH2（濃度為12.5、25、50、100、200、500、1000 μg/mL）的完全培養(yǎng)液，對照組加等體積的完全培養(yǎng)液；每一濃度分別有5個(gè)復(fù)孔?？瞻渍{(diào)零孔僅加入完全培養(yǎng)液以用于調(diào)零。在溫度設(shè)定為37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱（5%CO2）中分別培養(yǎng)24、48 h。每孔加入20 μL噻唑藍(lán)（MTT）溶液（5 g/L），孵育4 h。吸棄每孔的上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩10 min，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測定吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.5對細(xì)胞ALP活性的影響以DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔板。貼壁24 h后棄培養(yǎng)液，分別加入含BCH1、BCH2（濃度為200 μg/mL）的完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h與96 h。對照組加等體積的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后吸取上清液，PBS清洗3遍后在冰浴中對細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，按照ALP測定試劑盒說明進(jìn)行操作，測定細(xì)胞ALP活性。

1.2.6對細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

1.2.6.1細(xì)胞培養(yǎng)以DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板。貼壁24 h后棄培養(yǎng)液，分別加入含BCH1、BCH2（濃度為100、200 μg/mL）的完全培養(yǎng)液。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d，每2 d換液一次。

1.2.6.2總RNA的提取采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒對培養(yǎng)細(xì)胞提取總RNA。取所提取RNA樣品4 μL進(jìn)行稀釋，測其在260 nm及280 nm下吸光度A值，確定RNA純度并計(jì)算其含量，電泳檢測其完整性。

1.2.6.3逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)取1 μg樣品RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以得到cDNA，采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：Random Primer 1.5 μL，5×Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，M-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，使用DEPC水將總體積補(bǔ)足至25 μL。

1.2.6.4PCR反應(yīng)取2 μL cDNA模板，采用30 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因的引物序列、產(chǎn)物長度、退火溫度和循環(huán)數(shù)如表1所示。反應(yīng)條件為94℃、45 s變性，Tm退火30 s，72℃、45 s延伸，循環(huán)結(jié)束后72℃、10 min延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，在100 V恒定電壓下進(jìn)行電泳。使用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行檢測，采用Image J圖像分析軟件分析各目的條帶的灰度值。內(nèi)參校正為β-actin，目的基因的相對表達(dá)量（%）=目的基因灰度值/β-actin灰度值×100。

表1　目的基因的引物序列、退火溫度、循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物長度Table 1　The primer sequence，annealing temperature，cycles number and products length of different genes

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果與分析

2.1基本組成分析

如表2所示，魚骨中粗蛋白含量為14.5%，是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白原料。魚骨中羥脯氨酸含量為1.2%，羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，通過測定羥脯氨酸的含量可以計(jì)算出膠原蛋白的大致含量，對水生生物的換算系數(shù)一般采用11.1［12］。因此得出鱈魚骨中膠原蛋白的含量約占原料（濕基）的13.3%，這說明鱈魚骨是一種良好的膠原蛋白制備原料。

表2　基本成分分析（g/100 g）Table 2　Proximate analysis of samples（g/100 g）

2.2組織結(jié)構(gòu)觀察

使用EDTA-2Na溶液（pH7.2）能夠?qū)悠分袌?jiān)固致密的鈣鹽晶體脫除，露出魚骨中的有機(jī)間質(zhì)。骨組織的有機(jī)間質(zhì)主要是膠原纖維和無定型基質(zhì)，其中膠原纖維是骨間質(zhì)中的有形成分。如圖1所示，魚骨的有機(jī)間質(zhì)主要為膠原蛋白組成的膠原纖維。一般來說，膠原纖維約占骨間質(zhì)中有機(jī)物質(zhì)的93%，在未礦化的類骨基質(zhì)中，膠原纖維所占的比例可達(dá)96%［13］。從圖1中可見，由于鈣鹽的脫除，有機(jī)間質(zhì)中部膠原纖維呈交錯(cuò)樣分布，形成空隙區(qū)域。

圖1　膠原纖維的組織分布Fig.1　Histological examination of collagen fibril in samples

2.3對細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，培養(yǎng)24 h時(shí)BCH1與BCH2在不同的濃度下對MG-63細(xì)胞的增殖并無明顯影響（p＞0.05）。培養(yǎng)48 h時(shí)在200、500、1000 μg/mL濃度下BCH2表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用（p＜0.05）。初步說明鱈魚骨膠原肽沒有明顯細(xì)胞毒害作用，具有較好的安全性。

圖2　不同濃度膠原肽（BCH1、BCH2）對MG-63細(xì)胞增殖的影響Fig.2　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH）with various concentrations on cell growth in MG-63 cells

2.4對細(xì)胞ALP活性的影響

在成骨細(xì)胞分化時(shí)胞漿內(nèi)有豐富的ALP，ALP分泌到胞外是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的標(biāo)志之一，該酶對后續(xù)的鈣化過程有著重要作用，可以降解鈣化抑制因子并促進(jìn)基質(zhì)釋放磷酸根離子，增加局部鈣離子及磷酸根離子的濃度以促進(jìn)鈣化結(jié)晶的形成，因此常被用來作為成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志［14-15］。由圖3可知，培養(yǎng)96 h時(shí)BCH1與BCH2均能顯著（p＜0.05）提高ALP的活性，且膠原肽對細(xì)胞ALP活性的促進(jìn)作用呈時(shí)間依賴性。

圖3　膠原肽（BCH1、BCH2）對MG-63細(xì)胞ALP活性的影響Fig.3　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH）on ALP activity in MG-63 cells

2.5對細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)的影響

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）是TGF-β超家族成員，是一族分子量約為30～38 ku的二聚體，是促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵細(xì)胞蛋白因子。其中，BMP-2通過促進(jìn)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）的產(chǎn)生來刺激成骨細(xì)胞的分化，以促進(jìn)堿性磷酸酶等基因的表達(dá)［16-17］，在極短時(shí)間內(nèi)即能引發(fā)成骨細(xì)胞的分化并抑制其凋亡［18-19］。如圖4所示，BCH兩個(gè)組分均能上調(diào)BMP-2因子mRNA的表達(dá)水平。與對照組相比，在200 μg/mL濃度下，BCH1、BCH2處理組分別上調(diào)了22.13%和19.98%（p＜0.01）。結(jié)果表明鱈魚骨膠原肽能夠有效提高細(xì)胞因子BMP-2 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

圖4　不同濃度膠原肽（BCH1、BCH2）對MG-63細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH1，BCH2）with various concentrations on mRNA expression of BMP-2 in MG-63 cells

2.6對細(xì)胞OPG與RANKL mRNA表達(dá)的影響

骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）屬于可溶性假受體，它能夠競爭性結(jié)合核因子-κB受體活化因子配基（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）以阻斷骨吸收信號的傳遞［20-21］。RANKL能夠與破骨細(xì)胞表面信號受體核因子-κB受體活化因子（Receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）作用，是破骨細(xì)胞存活及其最終形成多核細(xì)胞并進(jìn)行骨吸收的關(guān)鍵因子［22-23］。如圖5所示，100 μg/mL的BCH2，200 μg/mL的BCH1與BCH2處理組能夠極顯著促進(jìn)MG-63細(xì)胞的OPG因子mRNA表達(dá)水平（p＜0.01），且具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；BCH兩個(gè)組分同時(shí)能夠抑制RANKL的mRNA表達(dá)水平（p＜0.01）。

圖5　不同濃度膠原肽（BCH1、BCH2）對MG-63細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響Fig.5　The effects of bone collagen hydrolysates（BCH1，BCH2）with various concentrations on mRNA expression of OPG and RANKL in MG-63 cells

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是成骨細(xì)胞作用于破骨細(xì)胞的重要途徑，可作為抗骨吸收活性物質(zhì)作用的標(biāo)靶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鱈魚骨膠原肽可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞OPG與RANKL的mRNA表達(dá)水平以間接對破骨細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而從該角度解釋了膠原肽改善骨代謝的機(jī)理。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以人成骨樣MG-63細(xì)胞為體外模型，初步探討了不同分子量組分鱈魚骨膠原肽（BCH1、BCH2）對MG-63細(xì)胞的作用效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鱈魚骨膠原肽對MG-63細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒副作用，具有較好的安全性。在培養(yǎng)96 h時(shí)樣品可有效提高細(xì)胞ALP的活性。鱈魚骨膠原肽能夠上調(diào)細(xì)胞BMP-2、OPG的表達(dá)水平，同時(shí)抑制RANKL的表達(dá)（p＜0.01），這表明膠原肽能夠在轉(zhuǎn)錄水平上提高成骨細(xì)胞BMP-2蛋白因子的表達(dá)，同時(shí)通過提高成骨細(xì)胞OPG/RANKL的相對表達(dá)量以間接對破骨細(xì)胞的成熟及活化進(jìn)行調(diào)控。在骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療研究中，尋找副作用小、在促進(jìn)骨形成的同時(shí)能夠抑制骨吸收的生物活性物質(zhì)已經(jīng)成為重要的研究方向。鱈魚骨膠原肽具有以上特點(diǎn)，因此可作為潛在的抗骨質(zhì)疏松活性肽進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)利用。

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Preparation of cod bone collagen hydrolysates and its osteogenic effect on MG-63 cells

WANG Shan-shan1，2，ZHANG Zhao-hui1，ZHAO Xue1，HOU Hu1，LI Ba-fang1，*
（1.Collagen of Food Science and Technology，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China）

The cod bone collagen hydrolysates were prepared by commercial protease.Utilizing cultured MG-63 cells，the osteogenic effect of collagen hydrolysates with different molecular weights was studied in vitro. Compositional analyses and histological observation was performed.Cod bone collagen hydrolysates with different molecular weights were obtained.The cultured MG-63 cells were used to investigate the osteogenic effect by detecting the ALP activity and the mRNA expression of Bone morphogenetic protein（BMP-2），Osteoprotegerin（OPG）and Receptor activator of nuclear factor-κB ligand（RANKL.The proximate analysis of fish bone exhibited that protein content in bone reached 14.5%.Large amounts of collagen fibrils in fish bone were observed using Van Gieson staining technology.Cod bone collagen hydrolysates could increase the ALP activity and BMP-2 mRNA expression level，meanwhile remarkably increase the ratio of OPG/RANKL mRNA expression in order to indirectly influence the osteoclast differentiation and maturation.Cod bone was a good collagen resource，the collagen hydrolysates extracted from cod bone exhibited osteogenic effect and could be used as a natural anti-osteoporotic supplement.

cod bone；collagen hydrolysates；enzymatic hydrolysis；osteoblast

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0095-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.011

2015－01－22

王珊珊（1984-），女，博士，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)，E-mail：wsstougao@126.com。

李八方（1953-），男，博士，教授，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)、功能食品與制品，E-mail：bfli@ouc.edu.cn。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2014AA093508）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471606）；青島市博士后研究人員應(yīng)用研究項(xiàng)目。