臨床分離白念珠菌ERG4基因高表達與唑類抗真菌藥物耐藥的關(guān)系

馮文莉 楊靜 王一如 陳晉宇 喬祖莎 奚志琴 馬彥

·論著·

臨床分離白念珠菌ERG4基因高表達與唑類抗真菌藥物耐藥的關(guān)系

馮文莉 楊靜 王一如 陳晉宇 喬祖莎 奚志琴 馬彥

目的 探討臨床分離白念珠菌ERG4基因高表達與唑類抗真菌藥物耐藥的關(guān)系。方法 M27-A2微量肉湯稀釋法對34株臨床分離白念珠菌菌株進行體外藥物敏感性試驗。抽提白念珠菌ERG4基因的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR（FQ-RT-PCR）方法檢測ERG4基因mRNA表達水平。結(jié)果 白念珠菌耐氟康唑菌株組ERG4基因表達量（4.20±2.56）高于敏感組（1.72±1.33）（t=3.99，P<0.05）；耐伊曲康唑組（3.60±2.47）高于敏感組（1.66±1.61）（t=3.71，P<0.05）；耐伏立康唑組（3.99±2.72）高于敏感組（2.07±1.58）（t=2.91，P<0.05）；對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同時耐藥菌株組（4.49±2.73）顯著高于敏感組（1.69±1.82）（t=3.81，P<0.05）。結(jié)論 臨床分離白念珠菌耐藥菌株ERG4基因高表達與氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐藥及交叉耐藥有關(guān)，但白念珠菌ERG4基因高表達在耐藥中的作用還有待于通過基因下調(diào)進一步研究證實。

白色念珠菌；基因；抗藥性，真菌；抗真菌藥；基因表達；ERG4

近年來，隨著廣譜抗生素和糖皮質(zhì)激素的大量應(yīng)用，侵襲性治療、器官移植以及免疫功能低下患者的增多，念珠菌感染逐年增加［1-2］，耐藥現(xiàn)象日益嚴重［3］。有研究［4-5］認為，麥角甾醇合成途徑中一些關(guān)鍵酶的編碼基因如ERG11、ERG3、ERG5等的突變或過表達可導(dǎo)致麥角甾醇合成途徑中相應(yīng)編碼的酶缺陷，在一定程度上改變白念珠菌對藥物的敏感性，從而產(chǎn)生耐藥。但白念珠菌麥角甾醇合成通路中其他靶酶基因如ERG4的高表達是否與耐藥形成有關(guān)尚不清楚。本課題對臨床分離白念珠菌菌株進行體外藥物敏感性試驗，獲得耐藥和敏感菌株，采用實時熒光定量PCR檢測ERG4的mRNA表達水平，探討ERG4基因高表達與白念珠菌耐唑類抗真菌藥物的關(guān)系。

作者單位：030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科（馮文莉、楊靜、陳晉宇、喬祖莎、奚志琴、馬彥）；太原市婦幼保健院皮膚科（王一如）

材料與方法

一、材料

1.實驗菌株：來自2010年1月至2013年5月本科真菌實驗室臨床分離的白念珠菌34株，其中來自呼吸道分泌物19株、泌尿生殖道分泌物10株、血液1株、甲屑1株、皮膚鱗屑3株。標準菌株為白念珠菌ATCC11006，購自北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心。

2.主要試劑與儀器：CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）；API 20C AUX酵母菌鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）；氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑（天津力生制藥股份有限公司）；UNIQ柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］。Total RNA 提取試劑（TaKaRa RNAiso Reagent）、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix，RR036）、實時熒光定量（FQ-RT-PCR）反應(yīng)試劑盒（TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMII，RR820）均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。PCR引物、RT-PCR引物均委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，雙向測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠），LG16-W高速離心機（北京京方公司），ATB1525Expression電子比濁儀（法國生物梅里埃公司），GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司），Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀（德國艾本德股份公司），基因擴增儀Hema 4800（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），Qiagen Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀（德國Qiagen公司）。

二、方法

1.體外藥物敏感性試驗：參照美國國家臨床和實驗室標準化研究院（NCCLSI）推薦的M27-A2微量肉湯稀釋法測定實驗菌株的藥物敏感性，按照表1的判定標準，篩選耐藥菌株及敏感菌株。

2.ERG4基因表達水平定量測定：嚴格按照TaKaRa Yeast RNAiso Kit酵母Total RNA提取試劑盒說明書提取白念珠菌基因組RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ煤怂岬鞍讬z測儀測量所提取的總RNA濃度，校正各菌株RNA濃度為500 mg/L。反轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA，反應(yīng)體系（10μl）：5×PrimeScriptRTMasterMix 2 μl，總 RNA 1 μl，DEPC 水 7 μl。擴增條件：37 ℃15 min，85 ℃、5 s，4 ℃。

表1 美國國家臨床和實驗室標準化研究院推薦的念珠菌屬藥敏試驗結(jié)果分界點（mg/L）

實時熒光定量PCR反應(yīng)：①實時定量引物設(shè)計：在基因庫中查找白念珠菌基因組，獲取白念珠菌GAPDH、ERG4基因序列全長，采用primer 5.0軟件設(shè)計GAPDH和qERG4引物。GAPDH（112 bp）：上游 5′-GTGCCAAAAAAGTTATGATC-3′，下游 5′-AGTTCTACCACCTCTCCAGT-3′；qERG4（1410 bp）：上游 5′-GTTTATTTTATTCTTCTTATCATTTGGA-3′，下游 5′-GGCACAATCAATTCTTCACCT-3′；②采用SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑，分別以相同體積的cDNA擴增目的基因。反應(yīng)體系（25 μl）：SYBR? Premix Ex TaqTMII（2 ×）12.5 μl，目的基因上、下游引物各 1 μl，cDNA 模板 2 μl，DEPC水 8.5 μl。擴增條件：95℃ 5 min預(yù)變性，95℃10 s，60℃30 s，重復(fù)此循環(huán)40次。65℃~95℃每5 s由PCR擴增儀自動讀取1次熔解曲線，每個循環(huán)的熒光量由Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2系統(tǒng)軟件自動監(jiān)測并計算Ct值。ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH的Ct值，再通過與參照菌株ATCC11006相比獲得ΔΔCt以2-ΔΔCt為目的基因的相對表達量，觀察ERG4基因mRNA在實驗菌株中的表達水平。每個菌株重復(fù)測量3次，取平均值。

3.統(tǒng)計方法：應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用±s表示，兩組間ERG4基因mRNA表達量的比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實驗菌株藥敏試驗結(jié)果

34株白念珠菌臨床分離株對氟胞嘧啶均敏感（100.00%）；33株對兩性霉素B有較高的敏感性（97.06%），1株（2.94%，CA22菌株）耐藥；對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐藥菌株所占比例分別為52.94%（18/34）、70.59%（24/34）、50.00%（17/34），而對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑敏感的比例分別為47.06%（16/34）、29.41%（10/34）、41.18%（14/34），3 株菌（8.82%）對伏立康唑的敏感性為中介。1株（CA22來自龜頭分泌物）對兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同時耐藥，15株對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同時耐藥，2株對氟康唑、伊曲康唑同時耐藥，2株對伊曲康唑、伏立康唑同時耐藥。標準菌株ATCC11006和其中的9株臨床菌株對5種抗真菌藥物均敏感。

二、實時熒光定量PCR擴增結(jié)果

1.耐氟康唑白念珠菌ERG4基因mRNA表達量：18株耐氟康唑菌株組ERG4基因mRNA表達量（4.20±2.56）高于16株敏感菌株組（1.72±1.33），兩組比較，t=3.99，P<0.05。

2.耐伊曲康唑白念珠菌ERG4基因mRNA表達量：24株白念珠菌耐伊曲康唑菌株組ERG4基因mRNA表達量（3.60±2.47）高于10株敏感菌株組（1.66 ± 1.61），兩組比較，t=3.71，P<0.05。

3.耐伏立康唑白念珠菌ERG4基因mRNA表達量：17株耐伏立康唑菌株組ERG4基因mRNA表達量（3.99±2.72）高于14株敏感菌株組（2.07±1.58），兩組比較，t=2.91，P<0.05。

4.對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑交叉耐藥的白念珠菌ERG4基因mRNA表達量：15株同時耐氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑菌株和9株同時敏感菌株分為交叉耐藥組和敏感組，交叉耐藥組ERG4基因mRNA表達量（4.49±2.73）高于敏感菌株組（1.69±1.82），兩組比較，t=3.81，P<0.05。

討 論

念珠菌ERG4基因編碼甾醇C-24（28）還原酶（sterol C-24（28）reductase），是麥角甾醇生物合成途徑中的最后一個酶，催化最終合成麥角甾醇［6］。有研究［7］表明，ERG4刪除可導(dǎo)致麥角甾醇完全缺乏和其前體物質(zhì)24（28）-脫氫麥角甾醇的積累，1株Erg4突變株表現(xiàn)出多效性的缺陷，如對二價陽離子和許多藥物（如，放線菌酮、咪康唑、4-硝基喹啉、氟康唑和十二烷基硫酸鈉）超敏反應(yīng)。在釀酒酵母菌中，ERG4基因高表達可導(dǎo)致細胞中麥角甾醇含量提高［8-9］。由此推測，在對唑類藥物耐藥的白念珠菌中，為了補償因唑類藥物致使的麥角甾醇耗竭，白念珠菌負反饋上調(diào)ERG4基因的表達，生成大量麥角甾醇，使得真菌細胞內(nèi)藥物濃度不足以抑制14α-去甲基化酶，最終導(dǎo)致耐藥［10-11］。是否通過此機制對耐藥產(chǎn)生影響目前尚無研究證明。

在本研究中，白念珠菌耐氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑菌株組ERG4基因的表達量分別明顯高于敏感菌株組，且對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑同時耐藥菌株組ERG4基因的表達量也明顯高于同時敏感菌株組，表明ERG4基因表達增高可能會導(dǎo)致白念珠菌產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥現(xiàn)象。1株菌株（CA137）對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑同時耐藥，ERG4基因mRNA表達量（2.06±0.20）較高。而1株菌株（CA133）對5種抗真菌藥物均敏感，其ERG4基因mRNA表達量（0.01±0.00）很低。這一結(jié)果似乎也提示我們白念珠菌ERG4基因表達增高可能會導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥現(xiàn)象。但尚需擴大樣本量進一步證實。

值得一提的是，菌株CA22（來自龜頭分泌物）對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和兩性霉素B同時耐藥，但其ERG4基因表達量（1.70±0.14）并不太高，提示白念珠菌對兩性霉素B的耐藥機制可能與ERG4基因的改變無明顯相關(guān)性，或者ERG4基因高表達可能與多藥耐藥現(xiàn)象無關(guān)。但由于標本量過少，從上述結(jié)果尚不能輕易下結(jié)論，需進一步通過基因下調(diào)、人工耐藥性誘導(dǎo)標準株、蛋白表達水平檢測等方法來深入明確ERG4基因高表達與白念珠菌耐藥之間的關(guān)系。

本研究中，有4株對5種抗真菌藥物均敏感的白念珠菌菌株 CA11、CA44、CA91、CA24 的 ERG4 基因表達量分別為 2.49± 0.60、5.28±0.45、3.03±0.17、1.91±0.03，較標準菌株 ATCC11006（1.13±0.15）稍高，但還有6株敏感菌株的ERG4基因表達量并沒有增高，說明白念珠菌耐唑類藥物機制可能還存在某種調(diào)控因子如鋅簇轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用［12］，尚待進一步研究。

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2016年中華醫(yī)學(xué)會-歐萊雅中國人健康皮膚/毛發(fā)研究項目評審結(jié)果

“2016年中華醫(yī)學(xué)會-歐萊雅中國人健康皮膚研究項目”從2015年3月開始申報，共收到課題申請書38份，其中毛發(fā)7份，皮膚31份。中法評委通過函審和會審兩個階段的雙盲評審，評選出14項資助課題，資助經(jīng)費共計人民幣90萬元。2015年7月17日，在中華醫(yī)學(xué)會第二十一次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會上舉行了項目評審結(jié)果發(fā)布儀式，中華醫(yī)學(xué)會邀請有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)和專家為資助課題代表頒發(fā)了證書和中華醫(yī)學(xué)會-歐萊雅杯。

獲資助人員名單：慕彰磊（北京大學(xué)人民醫(yī)院）；索丹鳳（天津市第一中心醫(yī)院）；紀超（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院）；曾躍平（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院）；姚燕（吉林大學(xué)）；劉琴（武漢大學(xué)中南醫(yī)院）；李化國（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院）；鐘鏵（西藏大學(xué)）；張寶旭（北京大學(xué)）；陽泰（成都醫(yī)學(xué)院）；韓麗敏（北京大學(xué)）；趙玉磊（常州市第一人民醫(yī)院）；李偉（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院）；程毅（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院）。

詳情請關(guān)注中華醫(yī)學(xué)會網(wǎng)站“科技評審”欄目之“中華醫(yī)學(xué)會-歐萊雅項目”子欄目。

2016中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會征文通知

經(jīng)中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會批準，中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會定于2016年4月21-25日在昆明市云安會都酒店召開中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會。此次會議將發(fā)揚歷次年會的優(yōu)良傳統(tǒng)，注重中西醫(yī)結(jié)合治療皮膚病的新方法及新的研究進展等方面的學(xué)術(shù)交流，內(nèi)容密切聯(lián)系臨床，切合皮膚科醫(yī)師的實際需求。會議將邀請知名專家做特邀演講，闡述皮膚科相關(guān)領(lǐng)域的最新研究進展，創(chuàng)造形式多樣、內(nèi)容充實、緊張熱烈、活躍互動的學(xué)術(shù)交流形式，達到全國皮膚科中醫(yī)、西醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師共同展現(xiàn)才華、獲取知識和信息、增進友誼的目的。欲參加者請仔細閱讀本通知，并在規(guī)定時間內(nèi)按要求投稿。

一、投稿要求：①投稿內(nèi)容：皮膚科基礎(chǔ)研究論文、皮膚科臨床診斷和治療等方面的論文、典型與疑難病例等；②投稿方式：中文全文和400字以內(nèi)的中文摘要，請通過電子郵件投稿，Email：pfkxh@126.com。來稿請注明2016會議征文，截稿日期：2016年3月3日；③會議交流形式：特邀講演、大會發(fā)言、分會發(fā)言、書面交流。

二、聯(lián)系方式：上海市黃浦區(qū)成都北路500號峻嶺廣場19樓1908室，上海長征醫(yī)院《中國真菌學(xué)雜志》編輯部，郵編200003，Email：pfkxh@126.com，聯(lián)系人：施慧，021-81885497，手機 13764560811。

第五屆國際大皰病學(xué)術(shù)研討會通知

2015年10月24-25日在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院召開“第五屆國際大皰病學(xué)術(shù)研討會”。屆時，美國賓夕法尼亞大學(xué)John Stanley、愛荷華大學(xué)Janet Fairley、北卡羅來納大學(xué)Zhi Liu、日本慶音大學(xué)Masayuki Amagai、德國呂貝克大學(xué)Detlef Zillinkens和法國魯昂大學(xué)醫(yī)院Pascal Joly等著名教授和國內(nèi)專家將做專題報道。此次會議還安排1天中國學(xué)者的發(fā)言，應(yīng)國外同行請求，PPT以雙語展示，用中文發(fā)言。這是一次純學(xué)術(shù)、顯示國際大皰病最高研究水平的會議，歡迎參加。會議不收注冊費，交通住宿費自理。擬發(fā)言交流者請于2015年6月30日前將姓名、單位、聯(lián)系方式、發(fā)言題目和摘要發(fā)給聯(lián)系人；參加者請于2015年8月31日前將姓名、單位、聯(lián)系方式發(fā)給聯(lián)系人。聯(lián)系人：袁勇勇，Email：yyyluofan@163.com。

Relationship between ERG4 gene overexpression and azole resistance in clinicalCandida albicansstrains

Feng Wenli*,Yang Jing,Wang Yiru,Chen Jinyu,Qiao Zusha,Xi Zhiqin,Ma Yan.*Department of Dermatology and Venereology,Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

ObjectiveTo explore the relationship between ERG4 gene overexpression and azole resistance in clinicalCandida albicansstrains.MethodsThe National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）M27-A2 broth microdilution method was conducted to evaluate antifungal susceptibility of 34 clinicalCandida albicansisolates in vitro.Total RNA was extracted from theseCandida albicansstrains and transcribed into cDNA.Real-time fluorescencebased quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression of ERG4 gene.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test.ResultsThe expression level of ERG4 mRNA was significantly higher in fluconazoleresistant than in-sensitiveCandida albicansstrains（4.20±2.56 vs.1.72±1.33,t=3.99,P<0.05）,higher in itraconazole-resistant than in-sensitiveCandida albicansstrains（3.60±2.47 vs.1.66±1.61,t=3.71,P<0.05）,and higher in voriconazole-resistant than in-sensitiveCandida albicansstrains（3.99±2.72 vs.2.07±1.58,t=2.91,P<0.05）.Further more,increased ERG4 mRNA expression was also observed in isolates cross-resistant to all the three azole antifungal agents compared with those susceptible to all of them （4.49±2.73 vs.1.69±1.82,t=3.81,P<0.05）.ConclusionsThe overexpression of ERG4 gene may be associated with cross resistance to fluconazole,itraconazole and voriconazole in clinicalCandida albicansstrains,but its exact role is expected to be investigated through downregulation of the ERG4 gene.

Candida albicans;Genes;Drug resistance,fungal;Antifungal agents;Gene expression;ERG4

Feng Wenli,Email:fwl92@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.003

山西省基礎(chǔ)研究項目（2012011045-3）；山西省青年科技研究基金（2012021035-3）；山西省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題計劃（2014044）；山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金（01201013）

馮文莉，Email：fwl92@hotmail.com

2014-10-30）

（本文編輯：吳曉初）