甜櫻桃果實采后病原菌的分離鑒定及其生物學特性研究

杜小琴，李　杰，秦　文，李　玉，何靖柳，王瑋瓊，陳琴媛，葉昕軼（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

甜櫻桃果實采后病原菌的分離鑒定及其生物學特性研究

杜小琴，李杰，秦文*，李玉，何靖柳，王瑋瓊，陳琴媛，葉昕軼
（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

為研究危害采后甜櫻桃果實的病原菌，以‘拉賓斯’甜櫻桃果實為試材，對低溫貯藏過程中的病原菌進行分離鑒定，并對其生物學特性進行初步研究。根據病原菌形態(tài)學特征和18S rDNA序列分析結果將2個病原菌鑒定為子囊菌亞門錘舌菌綱柔膜菌目核盤菌科核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）和子囊菌亞門糞殼菌綱肉座菌亞綱肉座菌目生赤殼科螺旋聚孢霉屬（Clonostachys sp.）。核盤菌菌絲在以牛肉膏為氮源的SDA培養(yǎng)基、20℃、pH=5.0及黑暗條件下生長最好，產孢量最佳條件為以乳糖為碳源，牛肉膏為氮源的SDA培養(yǎng)基，30℃、pH=7.0，黑暗環(huán)境；螺旋聚孢霉菌絲在以硝酸鉀為氮源的SDA培養(yǎng)基、30℃、pH=6.0及光照條件下生長最好，產孢量最佳條件為20℃、pH=6.0，光照培養(yǎng)。

甜櫻桃，病原菌，鑒定，生物學特性

甜櫻桃（Prunus avium L.）又名大櫻桃、車厘子、西洋櫻桃，原產歐洲和西亞，為薔薇科（Rosaceae）櫻桃屬（Cerasus）植物。甜櫻桃果實營養(yǎng)價值高［1］，具有良好的補血功效［2］，長期食用可以有效減輕關節(jié)炎引起的疼痛［3］、減少患神經退行性疾病的風險［4］。甜櫻桃果實皮薄、柔軟多汁，易受到病原微生物的侵染，加上采收時氣溫較高，采后極不耐貯藏，據報道每年甜櫻桃果實因微生物侵染引起的腐爛損失可占采后損失的1/2以上［5］。引起甜櫻桃果實采后腐爛的微生物主要是真菌，包括擴展青霉（Penicillium expansum）［6］、鏈核盤菌（Monilinia sp.）［7］、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）［8］、鏈格孢菌（Alternaria alternata）［9］、炭疽菌（Colletotrichum sp.）、灰霉菌（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）［5］等。目前對甜櫻桃果實的研究主要集中在采后生理和保鮮技術這兩個方面［10-12］，而對其采后致病菌的研究較少［13］。本文主要對‘拉賓斯’甜櫻桃果實采后低溫貯藏過程中的病原菌進行分離鑒定，并對其生物學特性進行研究，旨在為甜櫻桃果實采后貯藏過程中的微生物病害防治提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試甜櫻桃品種為‘拉賓斯’，購于雅安漢源農貿市場，選擇顏色均勻、無病蟲害、無機械損傷的果實預冷24 h后于（4±1）℃冷庫中貯藏，待果實自然發(fā)病后進行分離；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒上海生工生物工程有限公司；沙保弱培養(yǎng)基（SDA）配方葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂14～16 g，pH6.0～6.5，蒸餾水1000 mL，121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

LDZX-40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海三申醫(yī)療核子儀器廠；SW-CJ-1F潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；PHS-3C型數顯酸度計中國雷磁儀器分析廠；DHG-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；尼康E200生物顯微鏡。

1.2實驗方法

參照董維［14］的方法，略作修改。

1.2.1潛在病原菌的分離及純化將具有相同病癥的發(fā)病果實分組，采用組織分離法分離病原菌。剪取病健交接處約2 mm的組織，用75%酒精表面消毒5 s后，用無菌水清洗3次，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，每一病癥組5皿，25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。當菌落直徑生長至1 cm時，用接種針挑取菌絲尖端，置入另一PDA培養(yǎng)基內培養(yǎng)（同上），重復上述操作3～5次，直至獲得純培養(yǎng)物，4℃冰箱保存。

1.2.2致病性實驗取健康果實，先用清水洗凈，再用75%的酒精表面消毒5 s后無菌水清洗3次，晾干備用。取在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)2代后的新鮮菌株供試，在平板上生長7 d后，用無菌打孔器打取菌餅，直徑約為6 mm，采用有傷接種，用滅菌牙簽將果實刺破3個孔（孔眼集中在一起），將準備好的菌餅移植在刺破處，對照為同樣大小的無菌培養(yǎng)基塊。

將處理完的甜櫻桃置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察發(fā)病情況，顯癥后再次分離鑒定，將分離出的菌株與所接菌株的菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)進行比較，以判斷是否一致，若一致則為病原菌。

1.2.3病原菌的18S rDNA序列測定測定病原菌18S rDNA序列，通過進化樹分析確定病原菌種屬。18S rDNA序列PCR擴增引物為NS1：5，GTAGTCATAT GCTTGTCTC3；NS6：5，GCATCACAGACCTGTTATTG CCTC3。PCR反應體系：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，酶0.2 μL，F(xiàn)（10 μmmol/L）0.5 μL，R（10 μmmol/L）0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。PCR循環(huán)條件為94℃預變性4 min，94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min共30個循環(huán)，72℃修復延伸10 min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖進行凝膠電泳，電壓150 V，時間20 min。

1.2.4病原菌的進化樹構建將病原菌的18S rDNA序列提交至NCBI，通過Blast程序與GenBank中相似DNA序列進行比對，并以相似度較高的序列使用MEGA5.1軟件構建進化樹。

1.2.5病原菌生物特性研究將分離病原菌接種到PDA平板上，25℃暗培養(yǎng)3～7 d后，以直徑6 mm的無菌打孔器沿各菌落邊緣打孔，將打好的菌餅以接種環(huán)轉移至PDA平板中心。實驗設不同的溫度、pH、光照條件和碳、氮源處理。連續(xù)6 d測量菌落直徑，并于培養(yǎng)13 d時以血球計數板法觀察并記錄產孢量。

1.2.5.1碳、氮源對菌落生長和產孢量的影響采用SDA為基礎培養(yǎng)基，供試碳源有5種：葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和可溶性淀粉，按照葡萄糖的量分別稱取等量的供試碳源進行置換，配制成5種培養(yǎng)基。供試氮源有5種：酵母膏、硝酸銨、牛肉膏、氯化銨、檸檬酸銨，按照蛋白胨的量進行等量置換。將打好的菌餅轉移至不同碳氮源的平板中心，25℃暗培養(yǎng)。

1.2.5.2培養(yǎng)溫度對菌落生長和產孢量的影響將打好的菌餅轉移至新的PDA平板中心，分別放置在5、10、15、20、25、30、35℃的溫度中培養(yǎng)，光照條件為黑暗。

1.2.5.3培養(yǎng)基pH對菌落生長和產孢量的影響將打好的菌餅轉移至含不同pH的PDA平板中心，培養(yǎng)基pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調節(jié)，25℃暗培養(yǎng)。

1.2.5.4光照條件對菌落生長和產孢量的影響光照條件設置為暗培養(yǎng)、光培養(yǎng)和光暗交替（光、暗各12 h）培養(yǎng)，培養(yǎng)基為PDA，培養(yǎng)溫度為25℃。

1.3數據處理

所有數據均重復3次，利用SPSS軟件進行統(tǒng)計處理，采用ANOVA進行鄧肯式多重差異分析，Origin繪圖，圖中的豎線代表標準偏差。

2　結果與分析

2.1甜櫻桃果實采后病原菌的分離、純化及致病性測試

圖1　病原菌D2菌絲形態(tài)Fig.1　Morphology of pathogen D2

圖2　病原菌B3菌落形態(tài)Fig.2　Morphology of pathogen B3

從甜櫻桃果實的發(fā)病部位分離出兩種微生物，編號為D2、B3。致病性實驗結果表明，有傷接種時D2在第2 d就出現(xiàn)病癥，B3在第3 d出現(xiàn)，5 d后可以明顯觀察到D2、B3的染病率為100%，對照組未見染病。將發(fā)病部位的組織進行再次分離，結果得到的菌株與所接菌株的菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)一致，由此可證明D2、B3兩種微生物均是采后甜櫻桃果實的病原菌，D2、B3的菌絲形態(tài)分別如圖1、圖2所示。

D2在甜櫻桃果實上引起的病癥表現(xiàn)為果實表面有淡灰色菌絲，染病后果肉迅速變軟，發(fā)褐，且病癥很快會擴散至全果，從而失去商品性。D2菌落在PDA平板上呈圓形，淺灰色；菌絲光滑，分支較少，有明顯的隔膜。B3引起的病癥為果實表面有白色菌絲生長，呈圓心輪紋狀排列，發(fā)病組織具有明顯的邊緣，較干爽，沒有軟腐癥狀，菌落在PDA平板上呈圓形，致密，短絨狀，乳白色，邊緣輪廓清晰，培養(yǎng)初期菌落反面為白色，2～3 d后呈淺黃色，之后顏色逐漸加深，菌絲光滑，呈樹枝狀，長而無隔膜。

2.2甜櫻桃果實采后病原菌18S rDNA序列測定與進化樹構建

以通用引物進行PCR擴增，D2、B3菌株分別獲得大小1418、1416 bp的特異條帶，PCR結果見圖3。膠回收后用病原菌18SrDNA序列在GeneBank中進行搜素和比對，使用MEGA5.1軟件以Neighbor-Joining法構建進化樹（圖4）。

圖3　B2、D3電泳圖Fig.3　Electrophoregram of B2、D3

圖4　核盤菌，螺旋聚孢霉進化樹Fig.4　Evolutionary tree of Sclerotinia sclerotiorum，Clonostachys sp.

進化樹分析結果表明，D2菌株與核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）有較高的同源性，包括AY187065.1、AY187078.1和KJ522780.，與膠鼓菌（Bulgaria inquinans）關系較遠，結合其形態(tài)學特征鑒定為為子囊菌亞門錘舌菌綱柔膜菌目核盤菌科核盤菌屬核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）；B3菌株與生赤殼屬（Bionectria sp.）關系較近，與淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca GU112755.1）同源性為70%，與疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria AJ302003.1）關系較遠，結合其形態(tài)學特征鑒定為子囊菌亞門糞殼菌綱肉座菌亞綱肉座菌目生赤殼科螺旋聚孢霉屬（Clonostachys sp.）。

2.3甜櫻桃果實采后病原菌生物學特性研究

2.3.1不同碳源對病原菌菌落生長及產孢量的影響不同碳源對病原菌菌落生長的影響見圖5，Sclerotinia sclerotiorum菌落在以乳糖、蔗糖、葡萄糖為碳源時生長均較佳，菌落直徑分別為54.11、57.63、67.03 mm，顯著大于其他碳源的菌落直徑（p≤0.05），當以可溶性淀粉為碳源時菌落直徑為41.81 mm，顯著低于其他碳源（p≤0.05），該結果說明乳糖、蔗糖、葡糖糖均適合作為培養(yǎng)Sclerotinia sclerotiorum的培養(yǎng)基碳源；培養(yǎng)Clonostachys sp.的5中供試碳源中麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖的菌落直徑之間差異均不顯著（p≥0.05），而以可溶性淀粉為碳源時菌落直徑僅為23.59 mm，顯著低于其他碳源（p≤0.05），說明相對于其他四種，可溶性淀粉不適合作為培養(yǎng)Clonostachys sp.的碳源。

圖5　不同碳源對病原菌菌絲生長的影響Fig.5　Effect of different carbon source on the growth of pathogens

圖6　不同碳源對病原菌產孢量的影響Fig.6　Effect of different carbon source on the influence of spore yields

不同碳源對病原菌孢子產量的影響見圖6，碳源對Sclerotinia sclerotiorum產孢量的影響較大，對Clonostachys sp.的影響較小。Sclerotinia sclerotiorum在以乳糖為碳源時產孢量最多，達到7.2×106spores/mL，顯著大于其他碳源（p≤0.05），而在以麥芽糖為碳源時產孢量僅為2.85×106spores/mL，顯著低于其他碳源（p≤0.05）；Clonostachys sp.在以麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖為碳源時產孢量均較多，彼此之間差異不顯著（p≥0.05）。

2.3.2不同氮源對病原菌菌落生長及產孢量的影響不同氮源對病原菌菌落生長的影響見圖7，氮源對Sclerotinia sclerotiorum菌落生長的影響較大，各氮源之間差異均達到顯著（p≤0.05），其中以牛肉膏為氮源時的菌落直徑最大，達到56.14 mm，氯化銨最小，為25.85 mm，由此說明牛肉膏最適合作為培養(yǎng)Sclerotinia sclerotiorum的培養(yǎng)基氮源；在以硝酸鉀為氮源時Clonostachys sp.菌落直徑為30.39 mm，顯著大于其他氮源（p≤0.05），而在以氯化銨為氮源時菌落直徑最小，僅為17.02 mm，比硝酸鉀的少了43.99%，由此說明硝酸鉀是培養(yǎng)Clonostachys sp.的最佳氮源。

圖7　不同氮源對病原菌菌絲生長的影響Fig.7　Effect of different nitrogen source on the growth of pathogens

不同氮源對病原菌孢子產量的影響見圖8，氮源對Sclerotinia sclerotiorum產孢量的影響較大，其中以牛肉膏為氮源時產孢量最多，為5.20×106spores/mL，顯著大于其他氮源（p≤0.05），而以氯化銨和硫酸銨為氮源時，Sclerotinia sclerotiorum產孢量均較少；由圖8可知氮源對Clonostachys sp.產孢量的影響較小，在以牛肉膏、硝酸銨、硝酸鉀為氮源時均能產生較多孢子，分別為4.50×106、4.05×106和4.65×106spores/mL。

圖8　不同氮源對病原菌產孢量的影響Fig.8　Effect of different nitrogen source on the influence of spore yields

2.3.3不同培養(yǎng)溫度對病原菌菌落生長及產孢量的影響不同培養(yǎng)溫度對Sclerotinia sclerotiorum菌落生長及產孢量的影響見圖9，培養(yǎng)溫度在5～20℃時，Sclerotinia sclerotiorum菌落直徑呈上升趨勢，并在20℃時達到最大值79.30 mm，顯著大于其他溫度（p≤0.05），而當溫度高于20℃菌落生長受到抑制，35℃時菌落直徑為6.00 mm，菌落幾乎不生長。5℃時該菌株產孢子，為1.50×106spores/mL，產孢量在5～30℃時呈上升趨勢，最高達到10.05×106spores/mL，顯著大于其他溫度（p≤0.05），而當溫度大于30℃時產孢量呈下降趨勢。由此可知適合Sclerotinia sclerotiorum生長的最佳溫度為20℃，最適合的產孢溫度為30℃。

圖9　不同溫度對核盤菌生長和產孢量的影響Fig.9　Effect of different temperature on the growth of Sclerotinia sclerotiorum and spore yields

不同培養(yǎng)溫度對Clonostachys sp.菌落生長及產孢量的影響見圖10，由圖可知培養(yǎng)溫度在5～10℃時Clonostachys sp.菌落幾乎不生長，說明Clonostachys sp.耐低溫能力不強，在10～30℃內時菌落直徑呈上升趨勢，在30℃時達到最大值38.98 mm，之后迅速下降，到35℃時菌落也幾乎不生長，由此可知適宜Clonostachys sp.生長的溫度范圍比較狹窄；低溫下該菌產孢子，在5～20℃時孢子產量呈上升趨勢，在20℃時達到最大值2.8×107spores/mL后發(fā)生下降，由此說明最適合Clonostachys sp.的產孢溫度為20℃。

圖10　不同溫度對螺旋聚孢霉生長和產孢量的影響Fig.10　Effect of different temperature on the growth of Clonostachys sp.and spore yields

2.3.4不同pH對病原菌菌落生長及產孢量的影響不同pH對Sclerotinia sclerotiorum菌落生長及產孢量的影響見圖11，由圖可知Sclerotinia sclerotiorum在pH為4.0～8.0時生長均較好，在培養(yǎng)2 d后的菌落直徑均在43.00～49.00 mm內，當pH為5.0時，菌落直徑達到最大值48.42 mm，之后菌落直徑呈下降趨勢，由此說明該菌在偏酸性的環(huán)境中生長較好；Sclerotinia sclerotiorum在pH為4.0～9.0時均能產孢，當pH為7.0時產孢量最大，為8×106spores/mL，之后產孢量迅速下降，到pH為9.0時，孢子產量僅為1.7× 106spores/mL，說明最適合Sclerotinia sclerotiorum產孢的pH為7.0。

圖11　不同pH對核盤菌生長和產孢量的影響Fig.11　Effect of different pH value of medium on the growth of Sclerotinia sclerotiorum and spore yields

不同pH對Clonostachys sp.菌落生長及產孢量的影響見圖12，該菌株在pH為4.0～9.0時均能生長，當pH為6.0時，菌落直徑達到最大值44.20 mm，之后隨pH的升高菌落直徑減??；當pH為4.0～6.0時，Clonostachys sp.產孢量呈上升趨勢，之后下降，最大值為10.25× 106spores/mL。由此可知最適合Clonostachys sp.生長和產孢的pH均為6.0。

圖12　不同pH對螺旋聚孢霉生長和產孢量的影響Fig.12　Effect of different pH value of medium on the growth of Clonostachys sp.and spore yields

2.3.5光照條件對菌落生長及產孢量的影響光照條件對病原菌菌落生長的影響如表1所示，Sclerotinia sclerotiorum在暗培養(yǎng)至第2 d時菌落直徑為50.62 mm，顯著大于光照培養(yǎng)（p≤0.05），但差異僅達到5.71 mm；Clonostachys sp.在光照培養(yǎng)至第6d時，菌落直徑為53.95 mm，顯著大于暗培養(yǎng)（p≤0.05），差異達到16.71 mm。

Sclerotinia sclerotiorum、Clonostachys sp.在光照、光暗交替、黑暗條件下培養(yǎng)至13 d時的孢子產量如表2所示，Sclerotinia sclerotiorum在黑暗條件下培養(yǎng)時孢子產量達到12.15×106spores/mL，顯著大于光照培養(yǎng)（p≤0.05）；Clonostachys sp.光照條件培養(yǎng)時孢子產量為15.00×106spores/mL，顯著大于暗培養(yǎng)（p≤0.05）。綜合菌落直徑和孢子產量這兩個指標可以得出Sclerotinia sclerotiorum適合黑暗培養(yǎng)，Clonostachys sp.適合光照培養(yǎng)。

表1　不同光照條件對病原菌生長情況的影響Table 1　Effect of different light conditions on the growth of pathogens

表2　不同光照條件對病原菌孢子產量的影響Table 2　Effect of different light conditions on the influence of spore yields

3　結論與討論

從甜櫻桃‘拉賓斯‘果實上分離出兩種病原菌，分別是子囊菌亞門錘舌菌綱柔膜菌目核盤菌科核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）和子囊菌亞門糞殼菌綱肉座菌亞綱肉座菌目生赤殼科螺旋聚孢霉（Clonostachys sp.）。目前關于這兩種菌株的報道多集中在其他果蔬上，核盤菌在油菜、大豆、黃瓜、向日癸上均有報道［15-17］，蘭玉菲等［18］報道Bionectria ochroleuca是雞腿菇的病原菌，曹晉忠等［19］在黃岑中也分離鑒定出該菌株。甜櫻桃果實采后由病原菌引起的腐爛嚴重，而目前國內外對導致腐爛的病原菌報道較少，在采后貯藏過程中如何控制病原菌的發(fā)展還需深入研究。

核盤菌菌絲在以乳糖、蔗糖、葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源的SDA培養(yǎng)基中生長較好，最適培養(yǎng)溫度為20℃，最佳pH是5.0，黑暗條件下生長較好；孢子產量較高的條件是以乳糖為碳源、牛肉膏為氮源的SDA培養(yǎng)基，30℃、pH7.0和黑暗環(huán)境。

螺旋聚孢霉菌絲在麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖為碳源、硝酸鉀為氮源的SDA培養(yǎng)基中生長較好，最適培養(yǎng)溫度為30℃，最佳pH是6.0，光照條件下生長較好；螺旋聚孢霉在以乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖為碳源，牛肉膏、硝酸銨、硝酸鉀為氮源的SDA培養(yǎng)基中孢子產量較高，孢子最適培養(yǎng)溫度為20℃，最佳pH是6.0，光照條件下產孢量較高。

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Isolation，identification and biological characteristics of pathogenic bacteria for sweet cherry

DU Xiao-qin，LI Jie，QIN Wen*，LI Yu，HE Jing-liu，WANG Wei-qiong，CHEN Qin-yuan，YE Xin-yi
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

For further research on the main pathogenic bacteria of post-harvest sweet cherry fruit（cv.Labinsi），the pathogenic bacteria was isolated，identified in low temperature storage and their biological characteristics were studied.According to the characters of morphology and sequences analysis of 18S rDNA，the pathogenic bacteriawasPezizomycotinaLeotiomycetesHelotialesSclerotiniaceaeSclerotiniasclerotiorumand Pezizomycotina Sordariomycetes Hypocreomycetidae Hypocreales Bionectriaceae Clonostachys sp..SDA medium with beef extract as nitrogen source，20℃，pH=5.0 and dark condition were the best for mycelia growth of Sclerotinia sclerotiorum.lactose as carbon source，beef extract as nitrogen source，30℃，pH=7.0 and dark condition were the best for spore production.SDA medium with KNO3as nitrogen source，30℃，pH=6.0 were the best for mycelia growth of Clonostachys sp.，20℃，pH=6.0 and light condition were the best for spore production.

sweet cherry；pathogenic bacteria；identification；biological characteristics

TS255.3

A

1002-0306（2015）18-0197-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.031

2014－12－19

杜小琴（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏工程，E-mail：duxiaoqin1814@sina.com。

秦文（1967-），女，博士，教授，研究方向：果蔬采后生理及貯藏技術，E-mail：qinwen1967@aliyun.com.cn。