吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸對人鼻咽癌C N E-2Z細(xì)胞增殖及其細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

向銀洲　彭　平　許　軍　章松勤　寧　娜

三峽大學(xué)人民醫(yī)院宜昌市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000

吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸對人鼻咽癌C N E-2Z細(xì)胞增殖及其細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

向銀洲彭平許軍章松勤寧娜

三峽大學(xué)人民醫(yī)院宜昌市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000

目的研究核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸（PDTC）對人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞生長增殖及其細(xì)胞核抗原（PCNA）的影響。方法不同濃度的PDTC（25、50、100 μmol/L）作用CNE-2Z細(xì)胞不同時間后（24、48、72 h），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測PDTC對CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)；不同濃度的PDTC（25、50、100 μmol/L）作用于CNE-2Z細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析細(xì)胞周期，免疫組化（SP）法檢測不同強(qiáng)度PDTC作用下CNE-2Z細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)情況。結(jié)果25、50、100 μmol/L PDTC處理的CNE-2Z細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制（P＜0.05），并呈時間和劑量依賴；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明S期細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞受阻于G0/G1期。與對照（無PDTC處理）比較，PDTC作用后CNE-2Z細(xì)胞PCNA表達(dá)降低（P＜0.05），并呈明顯的劑量依賴。結(jié)論PDTC具有顯著抑制人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞生長的作用，是一種有潛力的抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的藥物。

人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞；吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；增殖細(xì)胞核抗原

鼻咽癌是我國南方地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤，治療以放射治療為主，目前早期鼻咽癌患者3年生存率約為90%，5年生存率為78%左右；但晚期患者生存率仍不樂觀，絕大多數(shù)患者死于腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率一直徘徊在40%左右［1］。因此在提高放療水平的同時，積極探討化學(xué)藥物治療尤為重要。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在許多生理、病理過程中發(fā)揮著基因調(diào)控作用，如炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖與凋亡等，腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程也與NF-κB密切相關(guān)，NF-κB是一類極其重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子［2］。NF-κB特異性抑制劑近年在腫瘤防治中的作用受到廣泛關(guān)注，其作用機(jī)制可能是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，從而間接抑制下游相關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。本實驗中選用NF-κB的特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）作為干預(yù)因素，作用于人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞，觀察PDTC對CNE-2Z細(xì)胞生長增殖及PCNA表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所中心實驗室提供。胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限責(zé)任公司；DAB顯色試劑盒與SP-9000免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢百奧斯生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）顯色劑購于上海生物工程有限責(zé)任公司；RNA酶（RNase）、PDTC分析純、碘化丙啶（PI）、二甲基亞砜（DMSO）、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶等分別購于Hyclone、Sigma、Amresco公司。

1.2CNE-2Z細(xì)胞的培養(yǎng)

復(fù)蘇人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z，將復(fù)蘇后的細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，加入含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，放置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)更換培養(yǎng)液，進(jìn)行正常傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3CNE-2Z細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

隨機(jī)在倒置顯微鏡下選取3個視野，觀察不同濃度PDTC（濃度分別為25、50、100 μmol/L）作用于CNE-2Z細(xì)胞不同時間點（24、48、72 h）的形態(tài)學(xué)變化。CNE-2Z細(xì)胞以5×104/mL濃度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，然后每孔中滴加1 mL細(xì)胞懸液，再加入適量含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長后分為4組，分別滴加含PDTC（25、50、100 μmol/L）的培養(yǎng)液；設(shè)未加PDTC為對照，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，去除培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，加入95%的乙醇室溫下固定30 min，取出蓋玻片，常規(guī)HE染色，透明樹脂封片，自然晾干，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4四甲基偶氮唑藍(lán)比色法檢測PDTC對CNE-2Z細(xì)胞生長增殖的抑制作用

采用對數(shù)生長期的CNE-2Z細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/mL，每孔200 μL接種于96孔板上，同時設(shè)空白對照組、正常對照組（不含藥物）和PDTC不同濃度藥物處理組（分別為25、50、100 μmol/L），每組重復(fù)4孔，于37℃、5% CO2、飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，吸去每孔培養(yǎng)液，實驗組分別滴加含不同濃度PDTC培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，再每孔滴加20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去上清液，每孔滴加150 μl DMSO液，遮光振蕩10～20 min，使其溶解，用Quant酶標(biāo)儀570 nm波長檢測各孔吸光度（A570），只加RPMI-1640、未接種細(xì)胞的空白對照調(diào)零。每組實驗重復(fù)3次，取平均值。計算不同濃度PDTC對CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞抑制率=（1-藥物處理組吸光度/陰性對照組吸光度）×100%［3］。

1.5CNE-2Z細(xì)胞周期分析

采用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞周期.選取對數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞，輕輕吹打，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，將細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，加入適量含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5%二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時，更換為含PDTC為25、50、100 μmol/L的培養(yǎng)液，設(shè)對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，PBS沖洗3次，用預(yù)冷的70%冰乙醇固定，置4℃冰箱過夜，吸去乙醇，PBS沖洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入RNase酶（20 μg/mL）200 μL消化30 min，加入碘化丙啶（20 μg/mL）1 mL，于室溫遮光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測，每組重復(fù)3次，Cell Quest及Modifit軟件分析細(xì)胞周期分布。

1.6免疫組化法檢測PDTC作用下CNE-2Z細(xì)胞PCNA的表達(dá)

選取對數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞，制成5.0×104/mL濃度細(xì)胞懸液，每孔2 mL接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，放入37℃、飽和濕度、5%二氧化碳的恒溫箱中培養(yǎng)24 h，更換無血清RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液，實驗組中分別滴加濃度為25、50、100 μmol/L含PDTC的培養(yǎng)液，對照組滴加含10%滅活胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，每孔2 mL。培養(yǎng)48 h后吸去各孔培養(yǎng)液，0.01 mmol/L PBS液洗滌3次，再以乙酸-甲醛溶液（濃甲醛10 mL，冰乙酸3 mL，0.9%的氯化鈉溶液加至100 mL）固定10 min。采用SP染色檢測CNE-2Z細(xì)胞中PCNA的表達(dá)，操作按說明書步驟進(jìn)行，然后用DAB染色盒染色，晾干，透明樹膠封片，光鏡下觀察CNE-2Z細(xì)胞PCNA表達(dá)。CNE-2Z細(xì)胞中PCNA陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核中可見棕黃色顆粒。HSCORE評分：排除爬片邊沿細(xì)胞，在低倍鏡下隨機(jī)選取細(xì)胞分布均勻的視野10個，然后在高倍鏡下每個視野隨機(jī)選擇50個細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞核著色深淺進(jìn)行PCNA蛋白表達(dá)評分：①陰性：0分，胞核不著色；②弱陽性：1分，胞核呈淡黃色；③陽性：2分，胞核呈黃色；④強(qiáng)陽性：3分，胞核呈深棕色。根據(jù)公式HSCORE=ΣPi（i+1）（i=0，1，2，3；Pi表示評分為i的比例）計算細(xì)胞HSCORE得分［4］。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CNE-2Z細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁生長24 h后，可見CNE-2Z細(xì)胞形態(tài)呈多角形，胞體透亮，細(xì)胞輪廓清晰，折光性強(qiáng)，胞核大而深染，核仁明顯，可見巨核和多核細(xì)胞（圖1，封四）。加入PDTC作用后，CNE-2Z細(xì)胞的貼壁性下降，細(xì)胞皺褶增多，形態(tài)逐漸由多角形變?yōu)閳A形，細(xì)胞間隙增寬；細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得模糊不清，部分細(xì)胞明顯水腫，胞漿濃縮，胞核聚集，甚至細(xì)胞破碎，可見細(xì)胞碎片。隨著PDTC濃度的增加和作用時段的延長，較多細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)瓶中（圖2，封四）。HE染色光鏡觀察，PDTC作用后，CNE-2Z細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則形，細(xì)胞核空染，隨PDTC濃度增高，CNE-2Z細(xì)胞死亡增加。

2.2不同濃度PDTC處理后CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制率

不同濃度PDTC處理的CNE-2Z細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制（P＜0.05），并呈時間和劑量依賴。見表1。

表1　不同濃度PDTC處理后CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制率（n=4，%，±s）

表1　不同濃度PDTC處理后CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制率（n=4，%，±s）

注：與對照同時間比較，aP＜0.05；與25 μmol/L比較，bP＜0.05；與50 μmol/L比較，cP＜0.05；與同組24 h比較，dP＜0.05；與同組48 h比較，eP＜0.05；PDTC：吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸

PDTC濃度（μmol/L）24 h48 h72 hP值0（對照）25 50 100 P值0 0 0-19.54±3.47a26.64±2.78ab37.59±3.19ac＜0.05 30.23±4.12ad37.24±4.53abd47.50±4.05acd＜0.05 34.20±3.21ae44.15±3.08abe59.47±2.89ace＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 -

2.3不同濃度PDTC對CNE-2Z細(xì)胞周期的影響

不同濃度PDTC作用24 h后，隨著藥物濃度增加，S期細(xì)胞所占比例逐漸下降（P＜0.05），G0/G1期細(xì)胞所占比例逐漸增高（P＜0.05），細(xì)胞主要呈現(xiàn)G0/G1期阻滯。見表2。

表2　不同濃度PDTC對CNE-2Z細(xì)胞周期的影響（n=4，%，±s）

表2　不同濃度PDTC對CNE-2Z細(xì)胞周期的影響（n=4，%，±s）

注：與對照比較，**P＜0.05

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2.4不同濃度PDTC作用于CNE-2Z細(xì)胞后PCNA蛋白的表達(dá)

對數(shù)期生長的CNE-2Z細(xì)胞，可見細(xì)胞核有明顯棕色或棕黃色顆粒著色，PCNA蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性（圖3，封四）。PDTC作用后，CNE-2Z細(xì)胞胞核棕黃色顆粒減少，隨著PDTC濃度增高，細(xì)胞核棕黃色顆粒顏色變淺（圖4，封四），表明PCNA表達(dá)減弱。不同濃度的PDTC（0、25、50、100 μmol/L）作用48 h后，PCNA蛋白的表達(dá)評分為（2.92±0.10）、（2.22±0.18）、（1.45± 0.22）、（1.02±0.15）分，隨著PDTC濃度增高，PCNA蛋白的表達(dá)評分逐步降低（P＜0.05），呈現(xiàn)一定的劑量依賴。

3　討論

NF-κB是一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，是由P65和P50構(gòu)成的雜二聚體，在人體的應(yīng)激、免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)等方面以及腫瘤的形成、侵襲、擴(kuò)散等方面發(fā)揮著重要的基因調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖，抑制細(xì)胞凋亡，其抗凋亡機(jī)制極可能是通過調(diào)控其靶基因相關(guān)因子，如腫瘤壞死因子、集落刺激因子、白介素-1、白介素-2等，使NF-κB過度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限制生長，出現(xiàn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡減少，促使腫瘤發(fā)生、侵襲和擴(kuò)散［5］. NF-κB還可以通過直接干擾與細(xì)胞周期相關(guān)的因子如IL-2等，使細(xì)胞的DNA合成異常加速，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖而形成腫瘤［6］。有研究發(fā)現(xiàn)PDTC和順鉑在體外聯(lián)合應(yīng)用后，對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z抑制效應(yīng)增加，中效濃度比單用藥要小，這說明PDTC可能具備化療增敏作用［7］。

PCNA是一種分子量為36 kD的蛋白質(zhì)，是DNA復(fù)制時聚合酶δ的輔助蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)合成，并存在于細(xì)胞核內(nèi)。PCNA影響著細(xì)胞的增殖周期，在細(xì)胞DNA合成、細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮著重要作用。PCNA存在可溶性和不溶性兩種，不溶性PCNA可以在DNA復(fù)制中起作用，同時調(diào)控細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期，研究發(fā)現(xiàn)其在G0/G1期細(xì)胞中表達(dá)不明顯，在G1晚期，其表達(dá)顯著增加，S期表達(dá)達(dá)最高峰，G2/M期則明顯下降［8］。PCNA表達(dá)的量的變化與DNA合成一致，其在細(xì)胞核內(nèi)陽性表達(dá)的強(qiáng)弱與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)，其活性越高，細(xì)胞與細(xì)胞間張力越大，黏附性越小，容易促使腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、侵襲和擴(kuò)散。因此PCNA的表達(dá)強(qiáng)度可以比較客觀地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，是一種能夠準(zhǔn)確、簡便評估腫瘤細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)［9］。

NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲鹽酸（PDTC）是一種強(qiáng)抗氧化劑，能夠特異性抑制多種腫瘤細(xì)胞NF-κB的活化，其作用機(jī)制主要為：①NF-κB活性亞單位P65的表達(dá)能夠被特異性抑制；②可能通過抑制NF-κB抑制蛋白（IκB）的降解，從而減少了NF-κB的核移位［10］。江從軍等［11］研究發(fā)現(xiàn)，特異性阻斷NF-κB的活化可顯著抑制體外實體瘤細(xì)胞的生長，腫瘤的發(fā)生率大大降低。Gao等［12］研究發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑PDTC通過可下調(diào)血管內(nèi)皮因子（VEGF）的表達(dá)，減少路易斯肺癌小鼠腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的形成；Li等［13］發(fā)現(xiàn)NF-κB信號途徑與視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為也有關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)PDTC對腎癌、肝癌、喉癌細(xì)胞有顯著的抑制作用［14-16］；對胃癌、白血病、宮頸癌細(xì)胞有明顯抑制生長作用［17-19］，對人鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與預(yù)后也有較大影響［20］。

本研究中采用NF-κB特異性抑制劑PDTC以不同濃度作用于人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)PDTC能顯著抑制CNE-2Z細(xì)胞生長增殖，表現(xiàn)為細(xì)胞黏附性下降，細(xì)胞間隙增寬，部分細(xì)胞胞核聚集，胞質(zhì)濃縮，甚至出現(xiàn)細(xì)胞碎裂。在增加PDTC濃度和延長作用時間后，大量細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)瓶中。HE染色結(jié)果顯示，PDTC干預(yù)后，CNE-2Z細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)變?yōu)閳A形或橢圓形，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大顆粒物質(zhì)及空泡；隨著PDTC濃度遞增，死亡細(xì)胞明顯增多。MTT試驗表明，CNE-2Z細(xì)胞的增殖代謝能夠顯著地被PDTC抑制，同時也具有一定的劑量和時間依賴。經(jīng)PDTC作用24 h后，分析CNE-2Z細(xì)胞的周期，發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，PDTC作用的細(xì)胞G2/M期和S期細(xì)胞明顯減少（P＜0.05），而G0/G1期細(xì)胞顯著增多（P＜0.05），CNE-2Z細(xì)胞生長過程明顯受阻于G0/G1期。免疫組化結(jié)果顯示，PDTC作用于CNE-2Z細(xì)胞后，PCNA蛋白表達(dá)下降，濃度越高，細(xì)胞核著色越淺。

綜上所述，PDTC能顯著抑制人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞生長增殖，其機(jī)制可能是PDTC阻斷NF-κB活化，下調(diào)PCNA表達(dá)，抑制細(xì)胞DNA合成和有絲分裂，減少細(xì)胞的生長增殖；改變細(xì)胞周期分布，使CNE-2Z細(xì)胞受阻于G0/G1期等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制了CNE-2Z細(xì)胞生長增殖。PDTC在腫瘤生長增殖方面的作用，使其可能成為腫瘤治療的新靶點。

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Effects of pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation and nuclear antigen expression of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z

XIANG YinzhouPENG PingXU JunZHANG SongqinNING Na
Department of Otolaryngology，the People's Hospital of China Three Gorges University the First People's Hospital of Yichang City，Hubei Province，Yichang443000，China

Objective To explore the effects of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC），a specific inhibitor of NF-κB on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z and its effect on proliferation cell nuclear antigen（PCNA）expression.Methods CNE-2Z cells were respectively treated with different concentration（25，50，100 μmol/L）PDTC and different time（24，48，72 h）.The inhibition effects of cell proliferation were assayed by four methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric（MTT）method.Cell cycle was analyzed by flow cytometry and the expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was detected by immunocytochemical method after treating CNE-2Z cells with different concentration PDTC（25，50，100 μmol/L）after 48 h.Results The proliferation activity of CNE-2Z cells dealed with 25，50，100 μmol/L PDTC was inhibited obviously（P＜0.05），and it showed a time-dependent and dose-dependent manner.FCM result showed that the cell population reduced in S phase and the cell cycle was arrested in G0/G1phase.Compared with the control（no PDTC），the expression of PCNA of CNE-2Z cells was down regulated after PDTC dealed with（P＜0.05），and it showed a dose-dependent manner.Conclusion The growth of CNE-2Z can be inhibited and the expression of PCNA in CNE-2Z can could be down-regulated by PDTC.PDTC may be a potential chemotherapeutics for the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line.

Human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z；Pyrrolidine dithiocarbamate；NF-κB；Proliferation cell nuclear antigen

R286.91

A

1673-7210（2015）09（a）-0011-05

2015-05-18本文編輯：蘇暢）

湖北省宜昌市醫(yī)療衛(wèi)生科研項目（AL4301-16）。

向銀洲（1971.3-），男，碩士，副主任醫(yī)師；研究方向：頭頸腫瘤基礎(chǔ)與臨床。