免疫性壞死性肌病肌肉組織抗SRP19抗體表達(dá)的研究

汪茜 蒲傳強(qiáng)

【摘要】目的：探索抗SRP19抗體在免疫性壞死性肌病患者肌肉組織表達(dá)的作用。方法：采用免疫組織化學(xué)染色方法，觀察抗SRP19抗體在免疫性壞死性肌病患者肌肉組織中的表達(dá)并與相關(guān)臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：71.43%（20/28）的免疫性壞死性肌病患者肌肉組織中抗SRP19抗體表達(dá)陽(yáng)性，主要表達(dá)在壞變肌纖維胞漿、小血管周圍及細(xì)胞間質(zhì)中。與不表達(dá)者比較，在年齡、病程、肌力以及肌酸激酶等方面無(wú)顯著性差異（P=0.202，0.939，0.711，0.109，P>0.05）其血清抗核抗體、抗Ro-52、抗SSA、抗Sm、抗Jo-1表達(dá)也無(wú)顯著性差異（P=0.281，1.000，0.497，1.000，1.000，P>0.05）。結(jié)論：抗SRP19抗體在免疫性壞死性肌病患者肌肉組織的表達(dá)率較高，可能參與疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】免疫性壞死性肌??；免疫組織化學(xué)；抗信號(hào)識(shí)別顆?？贵w

【中圖分類號(hào)】R741.02【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1005-0019（2015）01-0518-01

基金項(xiàng)目：

1.首都臨床特色應(yīng)用研究，題目：肌肉酶組織化學(xué)和免疫分子病理技術(shù)在肌病診斷中的規(guī)范應(yīng)用研究，編號(hào)：Z111107058811108

2.北京市自然科學(xué)基金，題目：基于全外顯組測(cè)序技術(shù)的中國(guó)遺傳性包涵體肌病家系致病基因定位及遺傳性分析，編號(hào)：7132216

3.國(guó)家自然科學(xué)基金，題目：遺傳性包涵體肌病候選基因篩查及新致病基因定位研究，編號(hào)：81271399

壞死性肌?。╪ecrotizingmyopathy，NM）是以肌纖維變性和壞死，不伴或極少伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理特征的特發(fā)性炎性肌病[1]，是不同于多肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎及非特異性肌炎的新亞型。常與腫瘤、病毒感染、肌毒性藥物及結(jié)締組織病相關(guān)，也有一類在確診前后均未找到相關(guān)繼發(fā)原因的病例，稱之為免疫性壞死性肌病。自2002年Miller[2]發(fā)現(xiàn)7例NM患者血清中存在抗信號(hào)識(shí)別顆粒（signalrecognitionparticle，SRP）抗體以來(lái)，SRP表達(dá)與壞死性肌病致病機(jī)制的關(guān)系就成了這個(gè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，甚至有學(xué)者提出SRP可以作為NM的標(biāo)志[3]，NM因起病急、進(jìn)展快、致殘率高、早期有可治性而備受關(guān)注，但以往的研究只關(guān)注患者血清中的抗SRP19抗體表達(dá)，而極少研究免疫性壞死性肌病的肌肉組織中是否有表達(dá)，與發(fā)病有何關(guān)系。因此，為了進(jìn)一步探索抗SRP抗體在免疫性壞死性肌病發(fā)病機(jī)制中的作用，我們擬觀察免疫性壞死性肌病患者肌肉組織是否存在抗SRP19抗體的表達(dá)。

1.材料與方法

1.1入選病例：選取2008年1月至2011年10月期間，因肌無(wú)力、肌痛在我院就診，伴有血清肌酶升高和肌電圖為肌源性受損，肌肉病理表現(xiàn)為典型的廣泛或片狀肌纖維壞死而沒(méi)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，激素和免疫抑制治療有效的28例病例。所選病例均排除腫瘤、藥物等其他繼發(fā)性因素，均經(jīng)酶組織化學(xué)和免疫組化染色排除常見(jiàn)類型肌營(yíng)養(yǎng)不良、先天性肌病。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合2004年歐洲神經(jīng)肌肉疾病中心和美國(guó)肌肉研究協(xié)作組（ENMC）提出的IIM分類診斷中免疫性壞死性肌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，①常>18歲發(fā)病，亞急性或隱匿性起病，對(duì)稱性肌無(wú)力，近端重于遠(yuǎn)端，累及頸部肌群時(shí)，屈肌受累重于伸?。虎诩∷峒っ窩K異常升高；③肌電圖呈肌源性損害，或肌肉組織核磁共振MRI成像STIR顯示彌漫或片狀信號(hào)增強(qiáng)，或血清學(xué)化驗(yàn)肌炎特異性抗體陽(yáng)性，三者存在其一；④病理學(xué)檢查突出表現(xiàn)為可見(jiàn)大量肌纖維壞死，而炎性細(xì)胞不明顯或只有少數(shù)散布在小血管周圍，肌束膜浸潤(rùn)不明顯。

1.3抗體：兔抗人抗SRP19多克隆抗體（ab50932）100ug，abcam公司；通用型兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV-9000），北京中杉金橋生物制品公司：二抗試劑A為聚合物增強(qiáng)劑（即用型），二抗試劑B為酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（即用型）；DAB顯色劑，北京中杉金橋生物制品公司。

1.3方法：

1.3.1臨床資料收集：28例免疫性壞死性肌病病例均仔細(xì)采集相關(guān)資料，包括患者年齡、性別、病程、起病形式、臨床癥狀、家族史及個(gè)人史、臨床體征、血清肌酶、免疫學(xué)指標(biāo)、肌電圖、肌肉病理活檢、激素和免疫抑制劑治療效果等。

1.3.2肌肉病理檢查：經(jīng)患者同意并簽署知情同意書(shū)后進(jìn)行肌肉活檢，主要部位為肱二頭肌和股四頭肌。肌肉獲取后放入液氮速凍，次日進(jìn)行冰凍切片，分別進(jìn)行HE、MGT、ORO、NADH、SDH、ACP、PAS、NSE、ATP酶、dystroglycan、sarcoglycan、dystrophin、dysferlin以及MHC-1等染色，由肌肉病理專家觀察肌肉組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行記錄和照相。

1.3.3肌肉組織抗SRP19抗體免疫組織化學(xué)染色：28例患者的肌肉組織標(biāo)本分別進(jìn)行抗SRP19抗體染色，染色方法如下：（1）將干燥切片用3%H2O2，37℃孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶，PBS洗，5min×3遍；（2）滴加稀釋好的一抗，一抗為抗SRP19抗體（1：125；Abcam），37℃孵育60min，PBS洗，5min×3遍；（3）滴加山羊血清，37℃孵育20min，以封閉非特異性位點(diǎn)；（4）滴加二抗試劑A（聚合物增強(qiáng)劑），37℃孵育20min，PBS洗，5min×3遍；（5）滴加二抗試劑B（辣根酶標(biāo)試劑：山羊抗兔/鼠聚合物），37℃孵育30min，PBS洗，5min×3遍；（6）新鮮配制的DAB顯色液，在室溫下顯色2-3min，據(jù)顯色程度控制反應(yīng)時(shí)間，充分水洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。判斷標(biāo)準(zhǔn)：光鏡觀察：抗SRP19抗體陽(yáng)性反應(yīng)為壞死肌纖維胞漿呈棕黃色，根據(jù)染色與否分為陽(yáng)性和陰性：陰性：胞漿不著色；陽(yáng)性：胞漿呈淡黃色、黃色或棕色。

1.4統(tǒng)計(jì)：統(tǒng)計(jì)分析由SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和中位數(shù)表示，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比表示，計(jì)量資料對(duì)比用T檢驗(yàn)，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2.結(jié)果

2.1臨床資料：28例患者中，男14例，女14例，男：女=1：1，發(fā)病年齡15-67歲，平均年齡（42.39±15.26），細(xì)化年齡分組，可觀察到51-60的年齡發(fā)病高峰以及可疑潛在的31-40歲年齡發(fā)病高峰，分別占32.14%和21.43%。51-60歲組中發(fā)病者9人，男：女=8：1，有明顯的男性患病優(yōu)勢(shì)，但整體觀察無(wú)性別優(yōu)勢(shì)（P=0.556>0.05）。肌電圖均呈肌源性損害。血清肌酶明顯升高，CK均值6329.86±5351.78（108.4-27036mmol/L）；LDH均值932.33±549.34（174-2374mmol/L）?；颊呔?jīng)激素及免疫抑制治療，對(duì)比治療前后患者血清肌酶值及肌力變化（表1），肌酸激酶CK下降有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P﹤0.001），肌力改善不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.823>0.05）。

表1壞死性肌病患者治療前后肌酶及肌力變化

指標(biāo) 例數(shù) 治療前 治療后 PCK 28 6329.86±5351.78 1287.15±1042.12 0.000**肌力 28 3.14±1.06 3.16±1.14 0.823治療前后選擇配對(duì)T檢驗(yàn)，**為P≤0.001，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2肌肉組織抗SRP19抗體免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：抗SRP19抗體主要表達(dá)在壞變肌纖維胞漿（圖1）、小血管周圍及細(xì)胞間質(zhì)中（圖2），非壞死性肌纖維中亦有部分表達(dá)。28例患者肌肉病理標(biāo)本抗SRP19抗體染色，20例陽(yáng)性（20/28，71.43%），8例陰性（8/28，28.57%）。

圖1肌肉組織免疫組化染色顯示壞死肌纖維出現(xiàn)抗SRP19抗體明顯表達(dá)。X200

圖2肌肉組織免疫組化染色顯示肌纖維間隙滲出的炎性細(xì)胞抗SRP19抗體明顯表達(dá)。X200

2.3抗SRP19抗體染色陽(yáng)性/陰性患者臨床特點(diǎn)分析：依抗SRP19抗體染色結(jié)果，將表達(dá)與不表達(dá)的患者分為兩組并進(jìn)行相關(guān)臨床資料的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抗SRP19抗體的是否表達(dá)與患者的性別、年齡、病程、肌力和肌酸激酶均沒(méi)有顯著的差別（表2）。28名患者中，6名（6/28，21.4%）患者檢查出ENA抗體譜陽(yáng)性，檢測(cè)出的抗體為抗核抗體（n=5）、抗Ro-52（n=2）、抗SSA（n=1）、抗SSm（n=1）、抗Jo-1（n=1），5名（5/28，17.9%）患者呈現(xiàn)多抗體陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)分析提示抗SRP19抗體的表達(dá)與血清抗核抗體、抗Ro-52抗體、抗SSA抗體、抗SSm抗體、抗Jo-1抗體沒(méi)有顯著關(guān)系（表3）。

3.討論

壞死性肌病是一種以肌纖維呈明顯變性壞死，且不伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理特征的肌病，依病因可分為繼發(fā)性和免疫性，前者由惡性腫瘤、中毒、藥物等多種原因引起；后者多不能找到原因，因?qū)δI上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制治療有效，被認(rèn)為是免疫介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制致病，因此，后者也稱為免疫性壞死性肌病。關(guān)于免疫性壞死性肌病的相關(guān)研究并不多，我們以前曾報(bào)道過(guò)[3]，免疫性壞死性肌病患者肌肉組織的壞死肌纖維和小血管出現(xiàn)明顯的C5b-9沉積，但這只是一種非特異性免疫物質(zhì)在壞變肌纖維的表達(dá)，其根本原因仍然不清。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)壞死性肌病肌病患者血清中存在著抗SRP抗體，為研究免疫性壞死性肌病發(fā)病機(jī)制和潛在的治療方案提出新的思路。

SRP作為肌炎特異性自身抗體（MSAS）之一，可通過(guò)抗SRP54、72、19亞單位抗體和抗7SLRNA抗體進(jìn)行檢測(cè)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究關(guān)注的都是血清中SRP的表達(dá)[4]，發(fā)現(xiàn)血清中抗SRP抗體與免疫性壞死性肌病密切相關(guān)，對(duì)于肌肉組織中是否存在抗SRP抗體，又如何參與免疫發(fā)病機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。免疫性壞死性肌病的靶器官損害在骨骼肌，通過(guò)研究肌肉組織中抗SRP19抗體表達(dá)，將有助于人們加深對(duì)SRP相關(guān)免疫性壞死性肌病的認(rèn)識(shí)。研究報(bào)道SRP相關(guān)免疫性壞死性肌病的平均發(fā)病年齡在50歲，與我們觀察到患者發(fā)病存在51-60歲的發(fā)病高峰一致。

抗SRP抗體在特發(fā)性炎性肌病患者血清中的陽(yáng)性率不完全一致，一般認(rèn)為在4%-6%，也有報(bào)道[5]其在PM中的陽(yáng)性率為11.9%。我們檢測(cè)免疫性壞死性肌病患者肌肉組織中的抗SRP19抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本組患者肌肉組織中抗SRP19抗體陽(yáng)性率高達(dá)71.43%，IIM患者患者血清抗SRP抗體陽(yáng)性率較低，可能是此種類型IIM發(fā)病率較低有關(guān)；但也可能是限于血清學(xué)樣本檢測(cè)之故；也許進(jìn)行IIM患者肌肉組織抗SRP抗體檢測(cè)，其陽(yáng)性率會(huì)更高。我們發(fā)現(xiàn)，抗SRP抗體主要表達(dá)在壞變肌纖維胞漿，小血管周圍和細(xì)胞間質(zhì)中，非壞死性肌纖維中也有部分表達(dá)，提示壞死肌纖維直接受到抗SRP19抗體攻擊而致病。受樣本條件所限，本研究未能同時(shí)檢測(cè)血清、肌肉組織SRP19抗體表達(dá)，但本研究的目的主要是觀察肌肉組織中SRP19的表達(dá)，以進(jìn)一步證實(shí)SRP19是否參與肌細(xì)胞壞死過(guò)程，進(jìn)而探討SRP相關(guān)免疫性壞死性肌病的發(fā)病機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)，免疫性壞死性肌病患者肌肉組織抗SRP19抗體的表達(dá)與患者的性別、年齡、病程、肌力、肌酶及其他肌炎相關(guān)抗體沒(méi)有明顯的關(guān)系，提示SRP在免疫性壞死性肌病發(fā)生中具有獨(dú)特性作用。2011年BenvenisteO[6]對(duì)8例抗SRP抗體陽(yáng)性患者在激素及免疫抑制治療前后進(jìn)行血清中抗SRP抗體進(jìn)行定量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)患者血清中CK和抗SRP定量隨治療前后癥狀的減輕而下降；近期有研究證實(shí)[7]，隨癥狀的好轉(zhuǎn)，在壞死性肌病的緩解期，抗SRP抗體可完全降至正常水平，證實(shí)SRP可能是免疫性壞死性肌病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在疾病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起重要作用的推斷。

相對(duì)于其他IIM患者，單純腎上腺皮質(zhì)激素治療NM效果較差，需聯(lián)用免疫抑制劑方可達(dá)到相對(duì)滿意的療效。我們發(fā)現(xiàn)免疫性壞死性肌病患者經(jīng)腎上腺皮質(zhì)激素及免疫抑制聯(lián)合治療后，血清肌酸激酶明顯下降，肌力改善卻不明顯。血清肌酸激酶在治療后快速下降，說(shuō)明免疫抑制治療可以遏制病情的進(jìn)展，挽救瀕死肌細(xì)胞，中止肌細(xì)胞進(jìn)入壞死途徑。肌力無(wú)明顯改善可能與壞死是細(xì)胞周期的終末階段及肌細(xì)胞再生能力較差有關(guān)。針對(duì)抗SRP抗體相關(guān)免疫性壞死性肌病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，可為探索更有效的治療手段提供新的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[3]叢璐，蒲傳強(qiáng)，毛燕玲，等.C5b-9在壞死性肌病肌肉血管組織的表達(dá)及意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2012，32（5）：714-717

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[5]HanischF，MüllerT，StoltenburgG，etal.UnusualmanifestationsintwocasesofnecrotizingmyopathyassociatedwithSRPantibodies.RheumatolInt.2013，33（5）：1371-1372.

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