一種測(cè)定亳菊提取液中總黃酮含量的方法

郭敏 陳佩 張秋香 張灝

摘要[目的]研究一株具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酸豆乳的工藝條件。 [方法]以產(chǎn)品的酸度、感官評(píng)定值為主要指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)降糖鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酸豆乳進(jìn)行條件優(yōu)化。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，降糖鼠李糖乳桿菌酸豆乳的最佳工藝條件為：豆水比1∶7 g/ml、蔗糖7% 、接種量5%、37 ℃發(fā)酵8 h。[結(jié)論]試驗(yàn)得出的工藝條件合理可行，為具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌在酸豆乳中的應(yīng)用提供了一定的技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 鼠李糖乳桿菌；豆乳；工藝研究

中圖分類號(hào)S509.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）34-092-03

酸豆乳是一種以大豆為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成的豆制品。大豆含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、脂肪、人體所必需的氨基酸及大豆異黃酮等成分[1]，通過乳酸菌的發(fā)酵作用后不僅保留了大豆的營養(yǎng)價(jià)值，而且在改變產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)后還能提高風(fēng)味和保藏特性，也可以將大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為活性成分，同時(shí)產(chǎn)生多種功能性的多肽[2]（7-12）。因而將豆乳作為有益乳酸菌的食物載體可賦予產(chǎn)品特定的健康屬性。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）是人體正常菌群之一，腸道粘著率高，定殖能力強(qiáng)，并具有高效降膽固醇，促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，可起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、預(yù)防齲齒、提高機(jī)體免疫力及抗癌等重要的生理保健功能[3-4]。筆者以江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離出的一株具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌為發(fā)酵劑[5]，發(fā)酵生產(chǎn)豆乳，以產(chǎn)品的酸度、感官評(píng)定值為主要指標(biāo)，在單因素和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得出最佳工藝參數(shù)，以期為具有潛在降糖作用的鼠李糖乳桿菌在酸豆乳中的應(yīng)用提供一定的技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試原料。

脫脂奶粉，光明乳業(yè)股份有限公司；全脂奶粉，雙城雀巢有限公司；大豆，超市購買。

1.1.2菌株。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus），由江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離獲得。

1.1.3主要儀器與設(shè)備。

DM2000顯微鏡，德國Leica公司；5415R離心機(jī)，德國Eppendorf公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；320S pH計(jì)、EL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；MLS3750滅菌鍋，日本Sanyo公司；SWCJ1CV超凈臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV2100紫外可見分光光度計(jì)，尤尼科上海有限公司；NDJ/79型粘度儀，同濟(jì)大學(xué)機(jī)電廠；手動(dòng)移液槍，美國Rainin公司。

1.2工藝流程

酸豆乳的制作工藝流程如下所示[2]（7-12）：

大豆→去雜→熱燙滅酶（4 min）→浸泡（0.5% NaHCO3溶液，12 h）→清洗→去皮（豆水比1∶7）→熱水磨漿（80 ℃）→過濾→調(diào)漿（7%蔗糖）→均質(zhì)→殺菌（121 ℃，15 min）→接種→發(fā)酵→低溫后熟→酸豆乳。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵用菌種的處理。

將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，活化3代后，6 000 r/min離心15 min，菌體用滅菌生理鹽水洗滌3次后制成菌懸液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2接種量對(duì)酸豆乳的影響。

取20 ml豆乳（豆水比1∶7 g/ml），將菌液按照1%、3%、5%和7%（V/V）的接種量分別接種到豆乳中，37 ℃厭氧培養(yǎng)8 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其酸度和活菌數(shù)。

1.3.3發(fā)酵溫度對(duì)酸豆乳的影響。

取20 ml豆乳（豆水比1∶7 g/ml），按照5%（V/V）的接種量接種入豆乳中，分別于33、37、42、45 ℃條件下厭氧培養(yǎng)8 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其酸度和活菌數(shù)。

1.3.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸豆乳的影響。

取20 ml豆乳（豆水比1∶7 g/ml），按照5%（V/V）的接種量接種入豆乳中，于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)6、8、10、12 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其酸度和活菌數(shù)。

1.3.5正交試驗(yàn)酸豆乳發(fā)酵條件優(yōu)化。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為因素取不同的水平（表1），以感官評(píng)分作為評(píng)定指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定酸豆乳的最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.6酸豆乳儲(chǔ)藏穩(wěn)定性分析。

將發(fā)酵結(jié)束的酸豆乳在4 ℃下靜置儲(chǔ)藏21 d。每隔7 d取樣品測(cè)定其pH、酸度、活菌數(shù)及脫水收縮率[6]。

1.4指標(biāo)測(cè)定

pH的測(cè)定[7]：用pH計(jì)測(cè)定（發(fā)酵樣品溫度20 ℃）。

滴定酸度的測(cè)定[7]：稱取10.0 g樣品放于100 ml的三角瓶中，加入20 ml去離子水和0.5 ml 0.5%的酚酞指示劑，充分搖勻后，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定樣品直至出現(xiàn)微紅色，并且紅色在1 min內(nèi)不消失為止。記錄消耗的NaOH溶液的體積（ml）并乘以10，即得滴定酸度（°T），重復(fù)試驗(yàn)3次取算術(shù)平均值。

活菌數(shù)測(cè)定[8-9]：將0.5 g樣品用滅菌的生理鹽水梯度稀釋至一定倍數(shù)后，利用MRS培養(yǎng)基測(cè)定發(fā)酵乳樣品中的活菌數(shù)，并計(jì)數(shù)。

黏度的測(cè)定[10]：在25 ℃下，利用黏度計(jì)（10×轉(zhuǎn)子）測(cè)定發(fā)酵乳樣品的黏度，重復(fù)試驗(yàn)3次取算術(shù)平均值。

脫水收縮率的測(cè)定[9]：稱取15.0 g酸豆乳樣品，置于帶有濾紙的漏斗中，21 ℃放置90 min，收集濾液并稱重。

脫水收縮率（%）=[濾液重（g）/樣品重量（g）]×100%

酸豆乳感官評(píng)價(jià)[11]：感官評(píng)定小組由10名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的研究生志愿者組成，按照表2各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1接種量對(duì)酸豆乳的影響

由圖1可知，隨著接種量的增加，產(chǎn)品的酸度和活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，接種量為5%時(shí)，酸度和活菌數(shù)達(dá)到最大值，隨著接種量的增加，酸度和活菌數(shù)逐漸下降。合適的接種量可以縮短延滯期，使菌種達(dá)到最好的生長狀態(tài)。接種量較少，產(chǎn)酸受到抑制，不能很快形成有利于菌種生長的環(huán)境；而接種量過大時(shí)，菌絲生長過快，發(fā)酵液黏度增加，造成溶氧量不足從而影響發(fā)酵產(chǎn)酸[12]（67-74）。從試驗(yàn)結(jié)果看，當(dāng)接種量為3%和5%時(shí)，酸度和活菌數(shù)都達(dá)到最大值，故確定3%和5%為較優(yōu)接種量。

2.2發(fā)酵溫度對(duì)酸豆乳的影響

發(fā)酵溫度對(duì)菌種的生長及最終發(fā)酵產(chǎn)物的生成有很大的影響，合適的發(fā)酵溫度可以使菌種達(dá)到最快的生長速度和獲得最高的發(fā)酵產(chǎn)率。因?yàn)榫N生長和發(fā)酵產(chǎn)物的形成都是一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果，發(fā)酵溫度過低，菌種生長慢，產(chǎn)酸低；發(fā)酵溫度過高時(shí)，酶本身很易失活，溫度越高，酶失活越快，從而影響發(fā)酵產(chǎn)量[12]（67-74）。從圖2可以看出，隨著發(fā)酵溫度的上升，產(chǎn)品的酸度和活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度在33時(shí)，酸度和活菌數(shù)都相對(duì)較低。故確定42 ℃左右為較適發(fā)酵溫度。

2.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸豆乳的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，產(chǎn)品的酸度和活菌數(shù)基本呈遞增趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在8和12 h時(shí)，酸度達(dá)到較高值，活菌數(shù)在12 h時(shí)達(dá)到最大。因?yàn)樵谇捌谠囼?yàn)中，該菌在12 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，故活菌數(shù)達(dá)到最大值。但是發(fā)酵時(shí)間過長會(huì)有較多乳清析出[13]，故綜合考慮確定8 h為較適發(fā)酵時(shí)間。

2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用L9（ 33 ）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3的分析可知，各因素的影響順序?yàn)椋篈>B>C，即接種量的影響最大，其次為發(fā)酵溫度，影響最小的是發(fā)酵時(shí)間。 最佳組合為A2B1C2，即接種量為 5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為8 h。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)的配比參數(shù)組合制作酸豆乳，另選正交試驗(yàn)中感官綜合評(píng)分最高的3組配方制作酸豆乳與其進(jìn)行比較，分別測(cè)定其酸度、活菌數(shù)、黏度及感官值，其結(jié)果見表4。

由表4可知，最優(yōu)水平組合A2B1C2在酸度、活菌數(shù)、黏度及感官評(píng)定各項(xiàng)指標(biāo)均最佳，說明最佳參數(shù)工藝可靠。

2.6酸豆乳儲(chǔ)藏穩(wěn)定性分析

酸豆乳在4 ℃下儲(chǔ)藏28 d，儲(chǔ)藏期間酸豆乳的pH、酸度、活菌數(shù)的變化和脫水收縮率結(jié)果如圖4～7所示。從圖4～7中可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，活菌數(shù)和pH逐漸將降低，酸度上升，這是因?yàn)樵趦?chǔ)藏前期，酸豆乳中的活菌的生長代謝使產(chǎn)品pH逐漸降低，酸度升高，而隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，體系可利用碳源減少，菌體生長進(jìn)入衰亡期，從而活菌數(shù)逐漸降低[14]。脫水收縮率隨著冷藏時(shí)間增加總體呈下降趨勢(shì)，但變化不明顯。綜合以上指標(biāo)，在儲(chǔ)藏過程中，存在后酸化現(xiàn)象，其余指標(biāo)變化不大，可通過進(jìn)一步的技術(shù)研究使該菌更適合酸豆乳發(fā)酵。

3結(jié)論與討論

該研究得出的一株降糖鼠李糖乳桿菌發(fā)酵豆乳的最佳工藝參數(shù)為：豆∶水= 1∶7 g/ml，蔗糖的添加量7%，鼠李糖乳桿菌接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 h。

儲(chǔ)藏過程中，產(chǎn)品存在后酸化現(xiàn)象，隨著冷藏時(shí)間延長pH降低，酸度提高，活菌數(shù)逐漸降低，脫水收縮性逐漸降低?？赏ㄟ^進(jìn)一步的技術(shù)研究使該菌更適合酸豆乳發(fā)酵。

3結(jié)論與討論

該研究得出的一株降糖鼠李糖乳桿菌發(fā)酵豆乳的最佳工藝參數(shù)為：豆∶水= 1∶7 g/ml，蔗糖的添加量7%，鼠李糖乳桿菌接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 h。

儲(chǔ)藏過程中，產(chǎn)品存在后酸化現(xiàn)象，隨著冷藏時(shí)間延長pH降低，酸度提高，活菌數(shù)逐漸降低，脫水收縮性逐漸降低。可通過進(jìn)一步的技術(shù)研究使該菌更適合酸豆乳發(fā)酵。