雙菌發(fā)酵黃漿水制備豆腐凝固劑培養(yǎng)條件優(yōu)化

呂　博，黎晨晨，劉　寧，李　?。ü枮I商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗室，黑龍江哈爾濱150076）

雙菌發(fā)酵黃漿水制備豆腐凝固劑培養(yǎng)條件優(yōu)化

呂博，黎晨晨，劉寧，李健*
（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗室，黑龍江哈爾濱150076）

以豆腐黃漿水為原料，經(jīng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵制備豆腐凝固劑。研究了黃漿水初始pH、乳糖添加量、發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、接種量等因素對乳酸菌產(chǎn)酸量的影響，在此基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗優(yōu)化培養(yǎng)基碳源及發(fā)酵條件。實(shí)驗結(jié)果表明最佳的凝固劑培養(yǎng)條件為：黃漿水中乳糖添加量1.5%、黃漿水初始pH=6.5、接種量6%、培養(yǎng)溫度37℃、發(fā)酵時間84h的條件下乳酸量為5.1g/L。在此工藝條件下豆腐出品率為196.43%，硬度為419.15g，黏聚性為261.42gs，蛋白質(zhì)含量9.62%。與其他方法相比，方法具有提高凝固劑中乳酸含量，改善豆腐凝固劑功能性，同時提高了豆腐中蛋白質(zhì)含量。

豆腐黃漿水，保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，有機(jī)酸凝固劑，發(fā)酵

豆腐黃漿水是豆腐生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物之一［1-2］，其中含有蛋白質(zhì)、糖，大豆異黃酮，鉀、鈉，維生素等多種營養(yǎng)成分［3-4］，隨著豆腐行業(yè)的發(fā)展，黃漿水作為其副產(chǎn)物，其處理問題日益受到關(guān)注［5-6］。

豆腐凝固劑是豆腐制作過程中的重要添加劑之一［7］。有機(jī)酸類豆腐凝固劑是以降低豆?jié){溶液的pH使其接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的方法，達(dá)到沉降蛋白質(zhì)的目的。酸漿作為豆腐凝固劑有著悠久的歷史，由于酸漿需自然發(fā)酵后才可作為凝固劑點(diǎn)豆腐，并且漿循環(huán)使用，存在潛在的安全衛(wèi)生問題。宋蓮軍等［8］將乳酸、乙酸等有機(jī)酸按照一定比例混合制成復(fù)合豆腐凝固劑，彌補(bǔ)了單一凝固劑制得豆腐在彈性、硬度方面的不足，但是口味稍酸，風(fēng)味欠佳。喬明武等［9］用響應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵條件制備凝固劑，發(fā)酵時間短，但接種量和乳糖添加量較大。王璐等［10］利用山楂、五味子、燈籠果等藥食兩用食品，通過超聲輔助水浴法提取總酸，制得天然新型豆腐凝固劑，消除了化學(xué)合成酸性凝固劑對人體的不利影響，但制成的豆腐不硬挺。

常用的豆腐凝固劑為石膏、鹽鹵、葡萄糖-δ-內(nèi)脂。利用微生物發(fā)酵制備豆腐凝固劑的研究還不是非常全面。保加利亞乳桿菌（Str.Thermophilic）和嗜熱鏈球菌（Lb.Bulgaricus）存在共生關(guān)系，兩者混合發(fā)酵能提高產(chǎn)酸速度，減弱后酸化程度，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，并能調(diào)節(jié)人體腸道菌群［11-13］。因此本實(shí)驗以豆腐黃漿水為原料，采用正交實(shí)驗優(yōu)化方法探討保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵制備新型的有機(jī)酸豆腐凝固劑，以期提高黃漿水中乳酸含量并賦予其特有的乳香味，減少處理副產(chǎn)物的工序和成本，提高資源利用率，為新型豆腐凝固劑的研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

乳酸菌哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品實(shí)驗室提供；黃漿水李氏豆腐坊；NaOH（分析純） 天津市大陸化學(xué)試劑廠；酚酞天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；乳糖（食品級） 武漢萬榮科技發(fā)展有限公司；葡萄糖（分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；DNS（3，5-二硝基水楊酸）（分析純） 北京篤信精細(xì)制劑廠；鹽酸（分析純） 丹東市龍海試劑廠；檸檬酸（食品級） 濟(jì)南歷下雅軒化工產(chǎn)品經(jīng)營部；硫酸銅（分析純）天津市勱特吉爾環(huán)保技術(shù)研究所；硫酸鉀（分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉（食品級） 天津市鑫大宇化工有限公司。

DHP-9032型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；721E型可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；pHS-25數(shù)顯pH計上海精密科學(xué)儀器有限公司；ALC-110.4型電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1黃漿水中還原糖含量采用DNS比色法測定黃漿水中還原糖含量［14］。

1.2.2黃漿水和豆腐中粗蛋白含量采用GB/T 5511-2008《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白含量計算凱氏法》［15］進(jìn)行測定。

1.2.3菌種的活化牛乳在121℃條件下滅菌20min，取菌種后，接種于15mL牛奶中，在37℃下活化24h，取1mL再接種到15mL牛奶中，在37℃下活化24h，如此反復(fù)活化3～4次后，作為種子菌種備用［16-17］。

1.2.4乳酸菌的擴(kuò)大培養(yǎng)取5mL待發(fā)酵的黃漿水與10mL試管中，121℃，滅菌20min。冷卻后接入3環(huán)菌種，于37℃條件下培養(yǎng)24h，為一級擴(kuò)大培養(yǎng)液。取一級擴(kuò)大培養(yǎng)液3環(huán)，轉(zhuǎn)入盛有100mL已滅菌的黃漿水的250mL三角瓶中，放入37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h后備用［18］。

1.2.5產(chǎn)乳酸量的測定用0.1000mol/L NaOH溶液滴定發(fā)酵前后黃漿水，計算乳酸菌產(chǎn)乳酸量計算公式如式（1）所示

式中：C2—乳酸菌產(chǎn)乳酸量，g/L；C1—NaOH溶液濃度，mol/L；M—乳酸摩爾質(zhì)量，g/mol；V1—NaOH滴定發(fā)酵液消耗的體積，mL；V2—NaOH滴定原始黃漿水消耗的體積，mL；V3—待測發(fā)酵液體積，mL。

1.2.6單因素實(shí)驗考察乳糖添加量、黃漿水初始pH、乳酸菌接種量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間5種因素對乳酸菌產(chǎn)酸量的影響。

1.2.6.1乳糖添加量對產(chǎn)酸量的影響在黃漿水中分別添加0%、1%、2%、3%、4%的乳糖，通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定相應(yīng)的還原糖含量，黃漿水初始pH=6.0，將乳酸菌以4%的接種量接種于黃漿水中，37℃條件下培養(yǎng)60h后，按1.2.5測定產(chǎn)乳酸量，進(jìn)而確定乳糖添加量。

1.2.6.2黃漿水初始pH對產(chǎn)酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，用NaOH和檸檬酸調(diào)pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5進(jìn)行實(shí)驗，將活化后的乳酸菌以4%接種量接種于不同pH的黃漿水中，在37℃條件下培養(yǎng)48h。按1.2.5測定產(chǎn)乳酸量，進(jìn)而確定黃漿水初始pH。

1.2.6.3乳酸菌接種量對產(chǎn)酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，調(diào)節(jié)pH=6.0，乳酸菌接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%接種于黃漿水中，在37℃條件下培養(yǎng)48h。按1.2.5測定產(chǎn)乳酸量，進(jìn)而確定最適接種量。

1.2.6.4培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，調(diào)節(jié)pH=6.0，乳酸菌以6%的接種量接種于黃漿水中，分別在29、33、37、41、45℃條件下培養(yǎng)48h。按1.2.5測定產(chǎn)乳酸量，進(jìn)而確定最適培養(yǎng)溫度。

1.2.6.5發(fā)酵時間對產(chǎn)酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，調(diào)節(jié)pH=6.0，乳酸菌以6%的接種量接種于黃漿水中，在37℃條件下分別培養(yǎng)48、60、72、84、96h。按1.2.5測定產(chǎn)乳酸量，進(jìn)而確定培養(yǎng)時間。

1.2.7正交實(shí)驗設(shè)計根據(jù)上述單因素實(shí)驗，設(shè)計五因素四水平正交實(shí)驗［19-21］，確定保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵產(chǎn)酸的最優(yōu)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件。實(shí)驗選取的因素及水平見表1。為驗證正交實(shí)驗最佳培養(yǎng)條件下的菌株產(chǎn)酸量，做三組平行實(shí)驗進(jìn)行復(fù)證。

1.2.8采用最優(yōu)組合制作的豆腐理化指標(biāo)測定利用質(zhì)構(gòu)儀對豆腐黏聚性及硬度進(jìn)行測定。采用TPA模式。測定參數(shù)為：探頭型號是P50，測試前速度為2mm/s，測試速度為1mm/s，測試后速度為1mm/s，壓縮形變量是30%，觸發(fā)力為5g，同一樣品選擇5個不同的部位測定，取平均值［22］。豆腐出品率是每100g干豆所得成品豆腐的重量。將制得的豆腐樣品稱量出質(zhì)量，根據(jù)式（2）計算出豆腐出品率［10］。

表1　L16（45）正交實(shí)驗因素水平表Table 1　FactorsandlevelsoforthogonalexperimentdesignL16（45）

式中：F—豆腐出品率，%；m豆腐—成品豆腐質(zhì)量；

m干豆—干豆的質(zhì)量。

1.2.9數(shù)據(jù)處理通過Excel做出不同影響因素對乳酸量影響的曲線，并通過SPSS軟件對正交實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行方差分析（顯著水平為0.05），確定各影響因素的主次順序及最佳優(yōu)化條件。

2　結(jié)果與討論

2.1黃漿水中還原糖、粗蛋白含量的測定

實(shí)驗所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.2969x-0.0091，R2= 0.9969。黃漿水中還原糖通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)含量為0.580g/100mL。

按GB/T 5511-2008對豆腐黃漿水中粗蛋白含量進(jìn)行測定，結(jié)果為0.34%。

2.2單因素實(shí)驗

2.2.1乳糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在不同乳糖添加量的黃漿水中發(fā)酵產(chǎn)乳酸，通過測定發(fā)酵前后NaOH消耗的體積，確定黃漿水中不同乳糖添加量對乳酸菌產(chǎn)酸量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同乳糖添加量對乳酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.1　Lactose added effect on acid production

乳糖為乳酸菌代謝的提供碳源，能延長穩(wěn)定期，隨著乳糖含量的增加，使乳酸菌進(jìn)入穩(wěn)定期后代謝產(chǎn)物積累和生化反應(yīng)仍繼續(xù)進(jìn)行，降低菌體死亡率。分析圖1曲線趨勢，乳糖添加量在0%～2%時，乳酸菌產(chǎn)乳酸量呈上升趨勢，在0%～1%時產(chǎn)乳酸量變化顯著（p≤0.05），在1%～2%時變化不顯著。在2%～4%范圍內(nèi)乳酸量變化不顯著。當(dāng)添加量為2%時乳酸含量達(dá)到最大，隨著乳糖含量的增加乳酸量逐漸減少。從吸光值A(chǔ)可知，隨著乳糖濃度的增大A值先升高后降低，A值最大為0.77時乳酸量最大，即乳酸添加量為2%時達(dá)到最大，出現(xiàn)此情況是因為培養(yǎng)基中碳氮比改變，改變微生物細(xì)胞滲透壓，不適合菌株的生長及代謝產(chǎn)物的積累。并且由于乳糖添加量越高發(fā)酵液越渾濁，作為豆腐凝固劑點(diǎn)豆腐會影響豆腐的外觀顏色。所以，選擇乳糖添加量在2%左右進(jìn)行正交實(shí)驗。

2.2.2黃漿水初始pH對菌株產(chǎn)酸量的影響保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在不同初始pH黃漿水中發(fā)酵產(chǎn)乳酸，通過測定發(fā)酵前后NaOH消耗的體積，確定不同初始pH環(huán)境下的產(chǎn)酸量，結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同初始pH對乳酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.2　Initial pH effect on acid production

由圖2曲線趨勢知，初始pH在4.5～5.5時，乳酸量呈顯著增加趨勢（p≤0.05），pH在5.5～6.5范圍內(nèi)乳酸量顯著降低（p≤0.05）。由于有機(jī)酸的積累，乳酸菌代謝多在低pH的酸性環(huán)境中進(jìn)行，當(dāng)環(huán)境pH降低到一定程度，乳酸菌將停止生長，影響了代謝產(chǎn)物的積累，所以出現(xiàn)了在pH=4、5條件下乳酸量降低的情況。在乳糖添加量相同時pH越大，發(fā)酵液顏色越深，作為豆腐凝固劑會影響到豆腐的外觀顏色，但又由于凝固劑應(yīng)用在豆腐制作過程中要盡量避免酸澀感，所以，選擇pH=5.5左右進(jìn)行正交實(shí)驗。

2.2.3乳酸菌接種量對菌株產(chǎn)酸量的影響不同接種量對產(chǎn)酸的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同接種量對乳酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.3　Inoculum concentration effect on acid production

接種量影響乳酸的積累，隨著接種量的增加，培養(yǎng)環(huán)境中乳糖含量降低、pH降低，二者共同制約著乳酸菌的生長。分析圖3曲線可知，接種量在2%～6%時，乳酸量呈顯著增加趨勢（p≤0.05），6%～8%變化不顯著，8%～10%乳酸量顯著降低（p≤0.05），接種量在6%左右產(chǎn)酸量達(dá)到最大，因此選擇6%左右接種量進(jìn)行正交實(shí)驗。

2.2.4培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響在不同培養(yǎng)溫度下菌株產(chǎn)酸情況如圖4所示。

溫度是乳酸菌生長代謝的重要條件，溫度的不同既影響乳酸菌的生長又影響乳酸的積累。由圖4可知，培養(yǎng)溫度為37℃時，乳酸量為3.6g/L達(dá)到最大。在29～37℃范圍內(nèi)，乳酸量變化呈顯著增加趨勢（p≤0.05），在37～45℃乳酸量變化顯著下降（p≤0.05）。因此，選擇37℃左右的培養(yǎng)溫度進(jìn)行正交實(shí)驗。該結(jié)論與尚天翠和Betache［23-24］的乳酸菌是中溫微生物的結(jié)論是一致的。

圖4　培養(yǎng)溫度對乳酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.4　Incubation temperature effect on acid production

2.2.5發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酸量的影響不同發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酸量的情況如圖5所示。

圖5　不同發(fā)酵時間對乳酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.5　Fermentation time effect on acid production

隨著時間的延長，代謝產(chǎn)物逐步積累，隨著環(huán)境因子逐漸被消耗，乳酸量的積累在降低，圖5的這種趨勢符合這個解釋。發(fā)酵時間從48～60h乳酸量呈顯著增加趨勢（p≤0.05），從60～96h乳酸量增加緩慢，變化不顯著。在72h時產(chǎn)酸量為6.5g/L，84h時產(chǎn)酸量為6.6g/L，提高程度不高，浪費(fèi)時間和資源。因此，選擇發(fā)酵時間72h左右進(jìn)行正交實(shí)驗。

2.3正交實(shí)驗結(jié)果與分析

2.3.1正交實(shí)驗結(jié)果與方差分析根據(jù)以上單因素實(shí)驗結(jié)果，選擇乳糖添加量（A）、發(fā)酵初始pH（B）、接種量（C）、發(fā)酵時間（D）、培養(yǎng)溫度（E）5個因素進(jìn)行正交實(shí)驗優(yōu)化，確定各單因素對菌株產(chǎn)酸量的交互作用。正交實(shí)驗結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

根據(jù)正交實(shí)驗結(jié)果分析和方差分析可知，發(fā)酵時間具有顯著性，各因素對菌株產(chǎn)酸量的影響主次順序依次是：發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、接種量、黃漿水初始pH、乳糖添加量。由正交結(jié)果與極差分析表中k值知，黃漿水初始pH的k3=k4，由于pH=6.5更接近于黃漿水pH，為節(jié)約操作時間，提高效率，故選擇pH=6.5（即B4）。綜上各因素對產(chǎn)酸量交互影響最佳方案為：A1B4C3D4E2，即發(fā)酵時間為84h，培養(yǎng)溫度為37℃，接種量為6%，黃漿水初始pH=6.5，乳糖添加量為1.5%。在該最佳培養(yǎng)條件下保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量可達(dá)5.1g/L。

表2　L16（45）正交實(shí)驗結(jié)果表與極差分析Table 2　Experimental results of L16（45）orthogonal array design and range analysis

表3　正交設(shè)計方差分析表Table 3　Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4采用最優(yōu)組合制作的豆腐理化指標(biāo)測定

根據(jù)2.3所得最佳方案制備豆腐凝固劑并應(yīng)用于豆腐制作過程中。對豆腐的出品率、黏聚性、硬度、蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定結(jié)果為：出品率為196.43%，黏聚性為261.42gs，硬度為419.15g，蛋白質(zhì)含量9.62%。

2.5不同豆腐凝固劑制備方法比較

不同豆腐凝固劑制備方法比較結(jié)果見表4。

表4　不同凝固劑制備方法比較Table 4　Comparison of different preparation methods of coagulant

由表4可知，本方法制備的豆腐凝固劑具有一定的生理功能，并在應(yīng)用中賦予豆腐特有的乳香味，且接種量小、節(jié)約資源，制備凝固劑過程較其他方法操作簡便。

3　結(jié)論

以豆腐黃漿水為原料，通過保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵制備有機(jī)酸豆腐凝固劑。經(jīng)單因素實(shí)驗確定各因素正交實(shí)驗的水平范圍，最終通過正交實(shí)驗確定最佳培養(yǎng)基及發(fā)酵條件。最優(yōu)方案為：發(fā)酵時間為84h，培養(yǎng)溫度為37℃，接種量為6%，黃漿水初始pH=6.5，乳糖添加量為1.5%。在該最佳培養(yǎng)條件下保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量可達(dá)5.1g/L。通過驗證實(shí)驗驗證該培養(yǎng)基及發(fā)酵條件具有一定的可行性與可靠性。通過正交實(shí)驗驗證實(shí)驗驗證該最佳培養(yǎng)基及發(fā)酵條件具有一定的可行性與可靠性。在此工藝條件下豆腐出品率為196.43%，硬度為419.15g，黏聚性為261.42gs，蛋白質(zhì)含量9.62%。

本方法與其他方法相比，具有凝固劑中乳酸含量高，改善豆腐凝固劑功能性，同時提高了豆腐中蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)，但操作較費(fèi)時。本實(shí)驗所得數(shù)據(jù)為研制新型豆腐凝固劑的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Optimization of culture conditions for yellow serofluid fermented by double lactobacillus to prepare organic acid coagulant

LV Bo，LI Chen-chen，LIU Ning，LI Jian*
（Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Yellow serofluid of tofu was used as a raw material，organic acid coagulant was prepared by Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus fermentation.The influences of lactic acid content were investigated by initial pH，lactose content，fermentation time culture temperature and inoculate quantity. Orthogonal experiment was used to optimize carbon source and its fermentation condition.The optimize culture conditions of organic acid coagulant were showed as follows：lactose content 1.5%，initial pH=6.5，inoculate quantity 6%，culture temperature 37℃，fermentation time 84h.The lactic acid content under these conditions was 5.1g/L.Under the above process conditions，the rate of production，hardness，cohesiveness and protein content were 196.43%，419.15g，261.42gs and 9.62%respectively.Lactic acid content was increased and function of coagulant was improved by compare with other methods，protein content of tofu was also increased. Key words：yellow serofluid；Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilus；organic acid coagulant；fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2015）02-0212-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.037

2014－04－14

呂博（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全控制與分析檢測。

李?。?956-），男，本科，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與綜合利用。

黑龍江省教育廳重點(diǎn)項目（12521z009）。