葡萄枝條提取物的抑菌活性及其在紅地球葡萄防腐保鮮上的應(yīng)用研究

孫玉霞，蔣錫龍，史紅梅，管雪強(qiáng)，王恒振（.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南5000；.山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南5000）

葡萄枝條提取物的抑菌活性及其在紅地球葡萄防腐保鮮上的應(yīng)用研究

孫玉霞1，蔣錫龍2，史紅梅2，管雪強(qiáng)1，王恒振1
（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南250100；2.山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南250100）

采用微量肉湯稀釋法研究了葡萄枝條提取物對(duì)供試3種真菌和5種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC），結(jié)果表明葡萄枝條提取物對(duì)真菌和細(xì)菌均有一定的抑菌活性；為進(jìn)一步明確葡萄枝條提取物在葡萄防腐保鮮中的應(yīng)用，以紅地球葡萄為試材，分別以葡萄枝條提取物、殼聚糖及葡萄枝條提取物與殼聚糖復(fù)合溶液作為保鮮劑，研究了其對(duì)葡萄防腐保鮮的作用效果，結(jié)果表明葡萄枝條提取物與殼聚糖復(fù)合涂膜處理能夠降低葡萄的失水率、保持可溶性固形物含量和含酸量等品質(zhì)指標(biāo)，同時(shí)對(duì)降低果皮上真菌和細(xì)菌菌落總數(shù)作用顯著（p＜0.05）。

葡萄枝條，提取物，抑菌活性，保鮮

葡萄是世界上產(chǎn)量最大的水果之一，因其酸甜可口、營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值豐富而深受人們的喜愛。但是葡萄皮薄多汁，自然條件下保鮮期較短，為此國(guó)內(nèi)外研究人員做了大量的工作以解決這一問題，如二氧化硫、二氧化氯、仲丁胺等保鮮劑的使用；以及臭氧處理、低溫貯存和氣調(diào)貯存等。由于常用的防腐保鮮劑的化學(xué)殘留對(duì)人體健康和環(huán)境污染存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此，來(lái)自植物自身的天然抑菌成分日益受到重視，如蘆薈提取物［1］、丹皮酚及其白芷多糖包合物［2］、蒲公英綠原酸及其包合物［3］等，此外殼聚糖（chitosan，簡(jiǎn)稱CTS）作為一種天然的聚合物糖類，由于能夠有效地提高植物的抗病性或延長(zhǎng)水果的保鮮期［4］也被廣泛地應(yīng)用于葡萄的保鮮研究中［5-6］。

葡萄枝條作為栽培過程中修剪下的廢棄物，其中含有豐富的多酚類物質(zhì)，作者已對(duì)葡萄枝條提取物的多酚含量、種類及抗氧化活性做過系統(tǒng)研究［7］，本研究繼續(xù)對(duì)其抑菌活性及其在葡萄防腐保鮮上的應(yīng)用進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以紅地球葡萄為試材，進(jìn)行采后葡萄枝條提取物及其與殼聚糖的復(fù)合處理，通過對(duì)葡萄品質(zhì)指標(biāo)和果皮上真菌、細(xì)菌菌落總數(shù)的分析，研究其對(duì)葡萄保鮮防腐的作用效果，以期找到一種適用于葡萄防腐保鮮的新技術(shù)，延長(zhǎng)葡萄的貨架期。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄品種紅地球，2012年8月采自平度市大澤山鎮(zhèn)；殼聚糖購(gòu)自濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp.subtilis）、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）、灰綠青霉（Penicillium glaucum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）均由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；乳酸菌（Oenococcus oeni）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 法國(guó)Lallemand公司，將所有供試的菌種接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，每種菌接三支重復(fù)，細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，霉菌、酵母培養(yǎng)28℃恒溫培養(yǎng)44～48h；細(xì)菌平板培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，成分為蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂15g/L，pH7.2～7.6，121℃高壓滅菌20min；真菌平板培養(yǎng)基孟加拉紅培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯霉素0.1g/L，瓊脂18.4g/L，孟加拉紅0.033g/L，121℃高壓滅菌20min。

YXQG02手提式電熱壓力蒸汽消毒器山東新華安得醫(yī)療用品有限公司；SW-CJ-ZD超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；WYT-32型手持糖量計(jì)泉州光學(xué)儀器廠；GSP-9160MBE型隔水式恒溫靜置培養(yǎng)箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HZQ-Q全溫振蕩器哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1葡萄枝條提取物制備修剪下的葡萄枝條經(jīng)干燥粉碎后過40目篩，用50%乙醇水溶液60℃振蕩提取1h，提取3次，合并濾液，5000r/min離心后50℃減壓濃縮，再經(jīng)大孔樹脂純化并真空干燥后得葡萄枝條提取物。

1.2.2防腐保鮮劑制備葡萄枝條提取物溶液：將葡萄枝條提取物用少量50%乙醇溶解后用蒸餾水稀釋，配制成64mg/L（以沒食子酸含量計(jì)，福林-肖卡法）溶液，記為G。

殼聚糖溶液：將殼聚糖用1%（V/V）的乙酸溶液溶解，再用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，配制成0.5%（W/V）的殼聚糖溶液，并攪拌均勻，記為C。

復(fù)合防腐保鮮劑：將葡萄枝條提取液用上述0.5%（W/V）的殼聚糖溶液稀釋，配制成64mg/L溶液，記為GC。

1.2.3葡萄處理方法選擇無(wú)腐爛霉變、成熟度和穗型較一致的新鮮葡萄，隨機(jī)分成4組，每組5穗，在不同濃度的保鮮劑中浸泡2min，取出自然晾干，以不浸果為對(duì)照，室溫下放置于塑料筐中。每個(gè)濃度的保鮮劑平行處理3組，每隔2d取樣測(cè)定其可溶性固形物、含酸量、失水率等品質(zhì)指標(biāo)及真菌和細(xì)菌菌落數(shù)。

1.2.4測(cè)定方法MIC測(cè)定方法：采用微量肉湯稀釋法［8］。培養(yǎng)基制備同常量肉湯稀釋法，將倍比稀釋后不同濃度的提取液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第7孔加液，每孔10μL，第8孔不加提取液作為生長(zhǎng)對(duì)照。將菌懸液經(jīng)MH肉湯1∶1000稀釋后，向每孔中加100μL，密封后置35℃培養(yǎng)箱中，孵育24h判斷結(jié)果。當(dāng)對(duì)照孔內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)，以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低提取液物濃度為MIC。

可溶性固形物：以手持式糖量計(jì)測(cè)定折光糖度計(jì)。

含酸量：酸堿滴定法測(cè)定［9］。

失水率（%）：（初始果重-貯存后果重）/初始果重×100。

菌落數(shù)：從每組3個(gè)平行果穗上各剪下2個(gè)果粒，稱重后，置于100mL無(wú)菌0.9%NaCl中，浸泡10min，每2min搖動(dòng)1次，將果粒表皮菌落充分洗下。取1mL含菌水加入裝有9mL無(wú)菌0.9%NaCl的試管中（此時(shí)稀釋倍數(shù)為10-3），相同操作稀釋至10-4倍。從10-3倍稀釋液中取0.1mL加入細(xì)菌平板，從10-4倍釋液中取0.1mL加入真菌平板（各做2個(gè)平行），涂布均勻。細(xì)菌37℃靜置培養(yǎng)24h，真菌28℃靜置培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0軟件，多組間比較用One-Way ANOVA法。

2　結(jié)果與討論

2.1葡萄枝條提取液的MIC

葡萄枝條提取液對(duì)供試的5種細(xì)菌（枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳酸菌）和3種真菌（灰綠青霉、黑曲霉、釀酒酵母）均有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度見表1。該提取液對(duì)真菌的抑菌效果略好于對(duì)細(xì)菌的抑菌效果，對(duì)黑曲霉和釀酒酵母的MIC最低為16mg/L；其次為灰綠青霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和乳酸菌，均為32mg/L；對(duì)綠膿桿菌和大腸桿菌的MIC為64mg/L。但在李春麗等［10］對(duì)芒果核多酚抑菌活性的研究中，提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌效果較好，而對(duì)真菌無(wú)明顯抑制效果；郝少麗等［11］亦報(bào)道蘋果渣多酚純化物對(duì)細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)，而對(duì)供試霉菌、酵母菌抑制作用不明顯，這可能是與提取物成分的差異有關(guān)。葡萄枝條提取物對(duì)真菌的抑制作用為其在果蔬防腐保鮮上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，也據(jù)此選取64mg/L為保鮮實(shí)驗(yàn)的提取物含量。

表1　葡萄枝條提取液的MIC測(cè)定結(jié)果Table 1　MIC results of the extract from grape cane

2.2不同處理對(duì)葡萄貯存期間失水率的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，保鮮劑處理均可降低葡萄果實(shí)失水率。雖然在開始的第3d，各處理的失水率相差不大，可是隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄枝條提取物與殼聚糖復(fù)合保鮮劑的效果越明顯。在貯存時(shí)間到達(dá)15d后，用葡萄枝條提取物與殼聚糖復(fù)合處理的葡萄失水率為13.10%，而對(duì)照組的葡萄失水率已達(dá)14.23%。這是因?yàn)槠咸呀?jīng)處理后可在表面形成一層無(wú)色透明的薄膜，阻止了水分蒸發(fā)，從而降低呼吸作用和水分的消耗。

圖1　不同處理對(duì)葡萄貯存期間失水率的影響Fig.1　Changes of the evaporate ratio in grape fruit during storage

2.3不同處理對(duì)葡萄可溶性固形物和含酸量的影響

葡萄中的可溶性固形物主要包括葡萄糖、果糖等，其含量是決定葡萄營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和口感的一個(gè)重要指標(biāo)。葡萄的含酸量也是決定葡萄品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，主要的有機(jī)酸包括酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等。另一方面，葡萄中的有機(jī)酸為其代謝活動(dòng)中的基本物質(zhì)，因此貯存期間葡萄含酸量的變化是反映營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗程度的重要指標(biāo)。

由圖2和圖3可見：在常溫貯存期間，經(jīng)過處理的葡萄和對(duì)照組葡萄的可溶性固形物含量和含酸量隨時(shí)間的延長(zhǎng)均逐漸升高。但經(jīng)過保鮮劑處理的葡萄升高的速度明顯降低，各處理的可溶性固形物含量和含酸量均明顯低于對(duì)照，其中以葡萄枝條提取物和殼聚糖復(fù)合處理的葡萄的可溶性固形物含量和含酸量變化幅度最少，分別上升3.4%和0.67g/L；而未經(jīng)保鮮劑處理的葡萄可溶性固形物上升4.8%、含酸量升高0.97g/L。這是因?yàn)榻?jīng)涂膜處理后的葡萄失水率降低，而且由于保鮮劑的作用降低了果實(shí)的呼吸消耗，使得葡萄因失水造成可溶性固形物含量和含酸量增加。

圖2　不同處理葡萄儲(chǔ)存期間可溶性固形物含量的變化Fig.2　Changes of the soluble solid contents in grape fruit during storage

圖3　不同處理葡萄儲(chǔ)存期間含酸量的變化Fig.3　Changes of the titratable acids in grape fruit during storage

2.4不同處理對(duì)葡萄貯存期間果皮表面真菌和細(xì)菌菌落數(shù)的影響

不同處理的葡萄儲(chǔ)存3～15d表皮細(xì)菌和真菌菌落總數(shù)見圖4和圖5所示，經(jīng)過保鮮劑處理的葡萄在儲(chǔ)存期間的菌落總數(shù)均低于對(duì)照，但不同處理之間差異較大。貯存15d后，相比對(duì)照的細(xì)菌菌落總數(shù)11.89×104cfu/g，僅用葡萄枝條提取液處理的葡萄細(xì)菌菌落總數(shù)為9.76×104cfu/g；而經(jīng)殼聚糖涂膜和葡萄枝條提取物與殼聚糖復(fù)合涂膜處理的細(xì)菌菌落總數(shù)分別為2.38×104cfu/g和1.51×104cfu/g，僅為對(duì)照的20.02%和12.70%。

圖4　不同處理葡萄儲(chǔ)存期間細(xì)菌菌落總數(shù)的變化Fig.4　Changes of the total number of bacterial colonies in grape fruit during storage

儲(chǔ)存15d后未經(jīng)處理的葡萄真菌菌落總數(shù)為15.22×105cfu/g，僅用葡萄枝條提取液處理的葡萄真菌菌落總數(shù)為7.78×105cfu/g；而經(jīng)殼聚糖涂膜和葡萄枝條提取物與殼聚糖復(fù)合涂膜處理的真菌菌落總數(shù)分別為1.63×105cfu/g和0.92×105cfu/g，僅為對(duì)照10.71%和6.04%。由此可見，僅用葡萄枝條提取液作為保鮮劑，與對(duì)照相比雖然有一定的抑菌效果，但不如其與殼聚糖符合涂膜處理的抑菌效果顯著（p＜0.05）。這是因?yàn)闅ぞ厶且嗄苡行У匾种萍?xì)菌和真菌的生長(zhǎng)和繁殖［12］，與同樣具有抑菌作用的葡萄枝條提取液復(fù)合使用，可以達(dá)到更好的保鮮防腐效果。從圖4和圖5可以看出，貯存期間葡萄枝條提取液與殼聚糖復(fù)合涂膜處理比單一保鮮劑處理的抑菌效果顯著提高（p＜0.05）。

圖5　不同處理葡萄儲(chǔ)存期間真菌菌落總數(shù)的變化Fig.5　Changes of the total number of fungal colonies in grape fruit during storage

3　結(jié)論

從MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知葡萄枝條提取物對(duì)真菌和細(xì)菌均有一定的抑制作用，但其葡萄防腐保鮮應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該提取物對(duì)真菌的抑菌活性要好于其對(duì)細(xì)菌的抑菌活性。采用葡萄枝條提取物、殼聚糖、該提取物與殼聚糖復(fù)合涂膜均對(duì)葡萄常溫儲(chǔ)存具有一定的防腐保鮮作用，其中以葡萄枝條提取液與殼聚糖復(fù)合涂膜處理對(duì)葡萄儲(chǔ)存期間的保鮮防腐效果最為顯著（p＜0.05），優(yōu)于單獨(dú)使用葡萄枝條提取物、殼聚糖處理。使用該復(fù)合保鮮劑能較好地保持葡萄常溫儲(chǔ)存期間的果實(shí)品質(zhì)，且作為天然的植物來(lái)源制劑，無(wú)毒無(wú)副作用，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并為農(nóng)業(yè)廢棄資源的綜合利用提供了廣闊的應(yīng)用前景。

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Anti-microbial activity of grape cane extracts and its application on storage of Red Globe grape

SUN Yu-xia1，JIANG Xi-long2，SHI Hong-mei2，GUAN Xue-qiang1，WANG Heng-zhen1
（1.Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji’nan 250100，China；2.Shandong Grapevine Institute，Ji’nan 250100，China）

Micro broth dilution method was employed to investigate the minimal inhibitory concentration（MIC）of the grape cane extracts to 3 kinds of fungi and 5 kinds of bacteria.The results showed that the grape cane extracts had significant effect on inhibiting the activities of selected microorganisms.In order to acquire more information about the application of grape cane extracts on table grape storage，compared the preservative effect of three substrates，i.e.grape cane extracts，chitosan，and the mixture of above two substrates on table grape（Vitis vinifera L.cv.Red Globe）.It was found that preservative films smearing with grape cane extracts and chitosan efficiently prevented the clusters from serious dehydration，helped sustain the soluble solid content and titratable acidity of berries，and significantly reduced（p＜0.05）the total plate count of fungi and bacteria on the berry surface.

grape cane；extract；anti-microbial activity；preservation

TS255.3

A

1002-0306（2015）02-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.020

2014－05－07

孫玉霞（1973-），女，碩士研究生，副研究員，研究方向：釀酒技術(shù)及風(fēng)味物質(zhì)研究。

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用創(chuàng)新課題。