低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其與海馬突觸可塑性的關(guān)系

金其貫，吳尚琳，王云峰，金愛娜，胡要娟

學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級神經(jīng)功能之一，學(xué)習(xí)主要是指人或動(dòng)物通過神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境信息而影響自身行為的過程，記憶是指獲得的信息或經(jīng)驗(yàn)在腦內(nèi)儲(chǔ)存和提?。ㄔ佻F(xiàn)）的神經(jīng)活動(dòng)過程，兩者密切相關(guān)［7］。而海馬是大腦中負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的最主要的部位，海馬的突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)。研究證實(shí)，神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（neuronal growth-associated protein，GAP-43）、突 觸 素（synaptophysin，SYP）和神經(jīng)細(xì)胞粘附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）與海馬突觸可塑性的形成有著密切的關(guān)系，是反映突觸可塑性的重要分子標(biāo)志［5］。有研究表明，長期的高原缺氧環(huán)境可以影響海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，抑制大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［14，28］，而長期適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增加海馬突觸的可塑性來提高學(xué)習(xí)記憶能力［29-30］。雖有研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧訓(xùn)練結(jié)合體育鍛煉可以擴(kuò)大運(yùn)動(dòng)改善老年人的認(rèn)知能力和生活質(zhì)量的積極效應(yīng)［26］，但高原訓(xùn)練對學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其與海馬突觸可塑性的關(guān)系目前尚未見到報(bào)道。本研究通過交互設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案，分別對大鼠進(jìn)行8周的低氧暴露或／和有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，在測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的同時(shí)，觀察了大鼠海馬的超微結(jié)構(gòu)，測定海馬組織中GAP-43、SYP、NCAM mRNA的表達(dá)量，來探討低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用和交互作用及其與海馬突觸可塑性之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究在高原訓(xùn)練中機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力的變化及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

6周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體重160～180g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)室溫20±2℃，自然光照，每天定時(shí)更換墊料。采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3天后隨機(jī)分成常氧對照組（Normoxic control group，NC）、低 氧 對 照 組 （hypoxia control group，HC）、常氧運(yùn)動(dòng)組（Normoxic exercise group，NE）和低氧＋運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（hypoxia exercise group，HE）4組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練采用無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，每天下午訓(xùn)練1次，每周訓(xùn)練6天。第1周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，在1周內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸增加到60min，共訓(xùn)練8周。游泳池為120cm×80 cm×70cm的長方體塑料水桶，內(nèi)壁光滑，水深50cm，水溫30～33℃。游泳時(shí)注意觀察大鼠狀態(tài)，預(yù)防溺水死亡，并及時(shí)撈出大鼠糞便，保持池水清潔。前2周內(nèi)將低氧艙模擬海拔高度由1600m逐漸增加到3000m高度，最終氧濃度為14.2%。在取材時(shí)NC組1只大鼠用做海馬定位實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練中HC組、NE組各有2只大鼠、HE組有3只大鼠溺亡。

實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，在Morris水迷宮中進(jìn)行定位航行試驗(yàn)的訓(xùn)練，共5天。從第1天開始，每天上午8:00—11:00定時(shí)訓(xùn)練，每天3次，每次訓(xùn)練間隔60s。訓(xùn)練時(shí)從第一、第二、第四象限依次（平臺(tái)設(shè)在第三象限）進(jìn)行，并將大鼠面向池壁放入水中，記錄120s內(nèi)尋找并爬上平臺(tái)的路線圖及所需要的時(shí)間（即潛伏期），允許在平臺(tái)上停留10s，加強(qiáng)記憶效果。如果大鼠在規(guī)定的試驗(yàn)時(shí)間120s內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引導(dǎo)至平臺(tái)，同樣允許在平臺(tái)上停留10s。第6天進(jìn)行定位航行測驗(yàn)，取3次潛伏期平均值作為其每一個(gè)訓(xùn)練時(shí)間段的潛伏期；在第6天下午進(jìn)行空間探索測驗(yàn)，即移去平臺(tái)，從同一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測定大鼠在120s內(nèi)游過的軌跡以及跨過平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。

1.3 取材

大鼠在 Morris水迷宮測驗(yàn)完畢后，禁食12h，按50 mg／kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，用剪刀斷髓處死后，小心剪開顱骨，取出右側(cè)海馬組織，放入2.5%戊二醛溶液中固定，備作電鏡制樣。取左側(cè)海馬組織，用錫箔紙包裹后立即置于液氮中，再轉(zhuǎn)入-80℃保存，以備提取總RNA，測定海馬組織中GAP-43、SYP、NCAM mRNA的表達(dá)量。

1.4 指標(biāo)測試

從戊二醛溶液中取出海馬組織，常規(guī)包埋、制片，用Tecnai 12型透射電鏡觀察海馬組織的超微結(jié)構(gòu)，攝片并存檔。透射電鏡切片的制備和觀察均在揚(yáng)州大學(xué)測試中心進(jìn)行。GAP-43、SYP、NCAM mRNA采用RT-PCR測定，先用Trizol（購自Life technologies）法從海馬組織中提取總RNA后，采用NanoDrop ND-3300微量分光光度計(jì)檢測260／280吸光度比值，判斷RNA純度和濃度。按照cDNA合成試劑盒（購自上海東洋紡生物科技有限公司）中說明書上的操作步驟，使用2720Thermal Cycler梯度PCR儀（美國）進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)結(jié)束后，在-20℃條件下保存。然后，使用SYBR Green Master（ROX）試劑盒（購自Roche Diagnostics），以cDNA 為 模 板，GAPDH 為 內(nèi) 參，用 ABI 7500RT-PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?50℃預(yù)處理2min，95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火60s共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。程序運(yùn)行結(jié)束后，將目的基因的Ct值與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量。GAP-43、SYP、NCAM和GAPDH的引物均由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成（表1）。

表1 本研究目的基因的引物序列一覽表Table 1 Primer Sequences for Target Genes

1.5 統(tǒng)計(jì)處理

2 研究結(jié)果

2.1 各組大鼠潛伏期的變化和穿越平臺(tái)次數(shù)的變化

通過對NC、HC、NE和 HE 4組進(jìn)行雙因素方差分析可知，長期的低氧暴露可使大鼠的潛伏期顯著增加（P＜0.05），穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著減少（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能使大鼠的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著增加（P＜0.05），低氧聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對縮短大鼠潛伏期、提高大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均沒有顯著的交互作用（P＞0.05，表2）。

表2 本研究各組大鼠潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的變化一覽表Table 2 The Changes of Llatency and Times of Cross Platform in Each Group of Rats

2.2 各組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的變化

圖1 本研究各組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的變化Figure 1 The Changes of Hippocampal Ultrastructure in Each Group of Rats

如圖1所示，NC組大鼠海馬突觸間隙清晰，突觸后膜致密物質(zhì)（PSD）厚度大，突觸前膜內(nèi)聚集有突觸小泡，線粒體數(shù)量多，結(jié)構(gòu)清晰；HC組大鼠海馬突觸數(shù)量少，突觸間隙模糊不清，突觸的界面較小，線粒體變形且結(jié)構(gòu)模糊。NE組大鼠海馬突觸數(shù)量多，突觸間隙清晰，突觸的界面曲度大，PSD厚度增大而明顯，突觸前膜內(nèi)聚集豐富的突觸小泡，線粒體數(shù)量增加，且結(jié)構(gòu)清晰。與NE組相比，HE組大鼠海馬內(nèi)突觸數(shù)量以及突觸小泡數(shù)量有所減少，PSD厚度減小，線粒體數(shù)量少，且結(jié)構(gòu)模糊不清。

2.3 各組大鼠海馬GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達(dá)的變化

對NC、HC、NE、HE 4組進(jìn)行單因素方差分析可知，長期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使大鼠海馬區(qū)GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），低氧暴露可使大鼠海馬區(qū) GAP-43、NCAM mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），SYP mRNA表達(dá)下降，但無顯著性差異（P＞0.05），低氧聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對提高GAP-43、SYP、NCAM mRNA的表達(dá)沒有顯著的交互作用（P＞0.05，表3）。

表3 本研究各組大鼠海馬GAP-43、SYP、NCAM、mRNA表達(dá)一覽表Table 3 Expression of Hippocampal GAP-43、SYP NCAM、mRNA in Each Group of Rats

3 分析與討論

3.1 低氧和運(yùn)動(dòng)對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

有研究表明，高原缺氧可使機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶能力下降，并導(dǎo)致機(jī)體的認(rèn)知功能障礙，且隨著海拔高度和缺氧程度的增加，其抑制能力增加［9］。而適量、規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉會(huì)顯著提高機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶能力［13，20］，過度負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)阻礙大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的形成和保持［4］。關(guān)于高原訓(xùn)練影響學(xué)習(xí)記憶能力的研究甚少，魏星研究發(fā)現(xiàn)，低氧和運(yùn)動(dòng)的雙重刺激，對大鼠的空間學(xué)習(xí)能力具有抑制作用，而對大鼠的空間記憶能力卻具有促進(jìn)作用［6］。為了進(jìn)一步探討高原訓(xùn)練中低氧和運(yùn)動(dòng)兩個(gè)因素對學(xué)習(xí)記憶能力的作用和交互作用，本研究采用交互設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案對大鼠進(jìn)行8周氧濃度為14.2%的低氧暴露或／和60min的無負(fù)重游泳訓(xùn)練，通過Morris水迷宮檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期的低氧暴露可使大鼠的潛伏期顯著延長（P＜0.05），穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著減少（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能使大鼠的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著增加（P＜0.05），低氧聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（模擬高原訓(xùn)練）對縮短大鼠潛伏期、提高大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)沒有顯著的交互作用（P＞0.05）。由此進(jìn)一步說明，長期的低氧暴露可以抑制機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶能力，而適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以提高機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶能力，雖然運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在一定程度上可以減輕低氧暴露所引起的學(xué)習(xí)記憶能力的抑制，但是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練并不能完全逆轉(zhuǎn)低氧暴露所造成的學(xué)習(xí)能力下降的現(xiàn)象。因此，長期居住在高原缺氧環(huán)境下的人們通過適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)鍛煉可減輕低氧環(huán)境對學(xué)習(xí)記憶能力的影響，對改善低氧環(huán)境下機(jī)體的認(rèn)知功能可能具有非常重要的作用。

3.2 低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響

突觸可塑性是指突觸在一定條件下調(diào)整功能、改變形態(tài)和增減數(shù)目的能力，包括突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和突觸傳遞效應(yīng)的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，海拔6000m的低氧環(huán)境可使大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元PSD厚度明顯降低，PSD長度縮短，突觸間隙相應(yīng)地增加［3］。2周的間歇性低氧暴露，可使大鼠海馬神經(jīng)元核膜輕度破壞和線粒體輕微腫脹，而4周的間歇性低氧暴露，可使大鼠海馬神經(jīng)元核膜嚴(yán)重破壞、細(xì)胞腫脹和溶解［16］。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使大鼠海馬齒狀回的突觸數(shù)量以及線粒體數(shù)量明顯增加，促進(jìn)突觸結(jié)構(gòu)可塑性改變［15］。低氧和運(yùn)動(dòng)的雙重刺激可抑制大鼠海馬齒狀回新生細(xì)胞的發(fā)生，氧濃度越低抑制作用越大［6］，但洪平（2005）研究6周不同形式的低氧訓(xùn)練對大鼠海馬神經(jīng)元的影響發(fā)現(xiàn)，低住低練、高住低練和低住高練組的大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，只有高住高練組海馬神經(jīng)元受到輕度損傷，并認(rèn)為這是在持續(xù)性低氧的基礎(chǔ)上進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練加重了腦組織的缺氧所致［1］。

為了進(jìn)一步探討模擬高原訓(xùn)練對大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)可塑性的影響，本實(shí)驗(yàn)通過讓大鼠模擬高原訓(xùn)練8周，觀察大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，HC組大鼠海馬區(qū)突觸數(shù)量減少，突觸的界面變小，突觸間隙與線粒體變形且結(jié)構(gòu)模糊；NE組大鼠海馬區(qū)突觸數(shù)量增多，突觸的界面曲度增大，突觸間隙清晰，PSD厚度明顯增厚，突觸前膜內(nèi)突觸小泡數(shù)量增多，線粒體數(shù)量增加，且結(jié)構(gòu)清晰；與NE組相比，HE組大鼠海馬內(nèi)突觸數(shù)量以及突觸小泡數(shù)量有所減少，PSD厚度減小，線粒體數(shù)量少，且結(jié)構(gòu)模糊。從而進(jìn)一步說明，長期的低氧暴露可以降低海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以增加海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練雖然對低氧暴露大鼠海馬突觸的超微結(jié)構(gòu)的損傷有一定的保護(hù)作用，但并不能完全逆轉(zhuǎn)低氧暴露對大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)帶來的損傷。

3.3 低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對海馬GAP-43、SYP、NCAM表達(dá)的影響

研究證實(shí)，GAP-43是神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)生長及再生、突觸形成和重建的標(biāo)志性物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性中起重要作用［25］；SYP是突觸小泡蛋白，并可作為突觸傳遞的標(biāo)志物參與神經(jīng)元的傳輸［24］；而NCAM與突觸結(jié)構(gòu)維持、模式重建有密切關(guān)系［23］。因此，GAP-43、SYP、NCAM 是反映海馬突觸可塑性的重要分子標(biāo)志物。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)對氧極為敏感，很容易發(fā)生缺氧性損傷，而GAP-43、NCAM可能是神經(jīng)系統(tǒng)損傷后自我修復(fù)再生的重要因子［18，22］。有研究證實(shí)，慢性間歇缺氧引起腦損傷時(shí)GAP-43的表達(dá)瞬時(shí)升高，這種瞬時(shí)升高可能是由于缺氧刺激未受損的腦神經(jīng)元代償性地增加GAP-43的合成，促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)元再生與修復(fù)（注:以前人們一直認(rèn)為腦發(fā)育成熟后其神經(jīng)元失去再生能力，但最近Nagavi等科學(xué)家們證實(shí)了多種生物的腦組織內(nèi)，甚至在具有高級神經(jīng)功能的新皮質(zhì)中有神經(jīng)元再生現(xiàn)象）；但隨著缺氧的進(jìn)行，海馬神經(jīng)元損傷加重，抑制了海馬神經(jīng)元GAP-43的合成，導(dǎo)致GAP-43的表達(dá)逐漸降低［18］。慢性間歇性缺氧可使大鼠海馬區(qū)SYP的表達(dá)顯著降低［11］，缺氧缺血性腦損傷大鼠海馬神經(jīng)元SYP蛋白含量及mRNA表達(dá)均下降［19］，而SYP的表達(dá)直接引起突觸量化的改變，進(jìn)而改變突觸可塑性。但是，長期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對海馬GAP-43、SYP、NCAM的影響，由于實(shí)驗(yàn)對象的不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全相同。長期、適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅可以促進(jìn)正常大鼠海馬內(nèi)GAP-43、SYP和NCAM蛋白表達(dá)上調(diào)，而且可以促進(jìn)衰老小鼠海馬GAP-43以及衰老大鼠海馬NCAM是mRNA和蛋白的表達(dá)增加，促進(jìn)了空間學(xué)習(xí)記憶的形成和保持［4，8-10，17］。在對腦損傷的小鼠進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞／祖細(xì)胞移植的同時(shí)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐芘_(tái)運(yùn)動(dòng)可以增加腦神經(jīng)生長因子和GAP-43mRNA的表達(dá)，使移植細(xì)胞分化成神經(jīng)元顯著增多［21］，且適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也可以增加腦缺血大鼠海馬區(qū)SYP含量或mRNA的表達(dá)［2，27］，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。另有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動(dòng)鍛煉能夠通過增加睡眠剝奪大鼠海馬GAP-43蛋白的表達(dá)來顯著改善長時(shí)間睡眠剝奪引起的記憶障礙，但是睡眠剝奪和有氧運(yùn)動(dòng)鍛煉均不能改變突觸蛋白1、SYP和PSD-95蛋白的表達(dá)［20］。然而，低氧聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對海馬GAP-43、SYP、NCAM表達(dá)的作用和交互作用目前尚未見到研究報(bào)道。

本研究采用交互設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案對大鼠進(jìn)行8周14.2%的低氧暴露或／和60min的無負(fù)重游泳訓(xùn)練后，檢測了大鼠海馬區(qū) GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達(dá)。對NC、HC、NE、HE 4組進(jìn)行雙因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，長期的低氧暴露可使大鼠海馬區(qū)GAP-43、NCAM mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），SYP mRNA表達(dá)下降，但無顯著性差異（P＞0.05），長期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使大鼠海馬區(qū) GAP-43、SYP和 NCAM mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），在低氧條件下進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對于提高GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達(dá)沒有顯著的交互作用（P＞0.05）。由此可見，長期的低氧暴露或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)大鼠海馬區(qū)GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達(dá)變化與突觸超微結(jié)構(gòu)的變化以及學(xué)習(xí)記憶能力變化相一致。說明長期的低氧暴露或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過引起海馬GAP-43、SYP和NCAM mRNA表達(dá)的下調(diào)或上調(diào)，抑制或增強(qiáng)海馬突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，可能是影響學(xué)習(xí)記憶能力的重要機(jī)制。

4 結(jié)論

1.長期的低氧暴露可抑制學(xué)習(xí)記憶能力，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠增加學(xué)習(xí)記憶能力，雖然運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在一定程度上可以改善低氧暴露大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但并不能完全逆轉(zhuǎn)低氧暴露所造成的學(xué)習(xí)能力下降。

2.長期的低氧暴露或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)大鼠海馬區(qū)GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達(dá)變化與突觸超微結(jié)構(gòu)的變化以及學(xué)習(xí)記憶能力變化相一致。長期的低氧暴露或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過下調(diào)或上調(diào)海馬GAP-43、SYP和NCAM mRNA的表達(dá)，抑制或增強(qiáng)海馬突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，可能是影響學(xué)習(xí)記憶能力的重要機(jī)制。

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