流式細(xì)胞技術(shù)檢測人異體血液回輸方法研究

河春姬，楊 聲，董 穎，張力思，景 晶，徐友宣，吳侔天

1 前言

異體血液回輸是指向人體內(nèi)輸入血型相同的異體血液的方法，例如，A型血的人輸入他人提供的A型血液。這一方法在20世紀(jì)初被確立下來，隨后，普遍應(yīng)用于臨床治療。由于異體血液回輸能夠迅速增加紅細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體氧氣運(yùn)輸，提高有氧運(yùn)動(dòng)能力，20世紀(jì)60年代，已有運(yùn)動(dòng)員通過使用血液回輸?shù)妊号d奮劑提高體育運(yùn)動(dòng)成績。在1988年漢城奧運(yùn)會(huì)上，血液回輸作為血液興奮劑正式被國際奧委會(huì)（IOC）列入禁用范圍。近年來，由于對(duì)促紅細(xì)胞生成素和血液替代品興奮劑檢測水平的不斷進(jìn)步，使得采用血液回輸方法作弊再度流行［8］。

一直以來，研究人員都沒有找到理想的方法來檢測興奮劑異體血液回輸，一是，用以往的臨床檢驗(yàn)技術(shù)無法區(qū)分是否輸入異體同型血液；二是，與受體紅細(xì)胞總數(shù)相比輸入的供體紅細(xì)胞比例很低，且紅細(xì)胞的數(shù)量和壽命隨著時(shí)間推移而縮減；再者，紅細(xì)胞屬于無核的終末分化的細(xì)胞，無法利用現(xiàn)有的遺傳學(xué)檢測技術(shù)根據(jù)核內(nèi)遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA）來鑒定其歸屬。

澳大利亞學(xué)者Nelson提出，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的血型血清學(xué)方法檢測運(yùn)動(dòng)員使用異體血液回輸，其原理是根據(jù)個(gè)體之間紅細(xì)胞血型抗原譜的差異，通過紅細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記方法，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測是否存在異體紅細(xì)胞［11，13，12］。2008年 ，Giraud、Arndt等 在 前 人 研 究 的 基 礎(chǔ) 上進(jìn)一步驗(yàn)證并發(fā)展了該方法［10，6］。

流式細(xì)胞術(shù)是集激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)等于一體的生物技術(shù)，可對(duì)流過光學(xué)或電子檢測器的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的多參數(shù)分析，近年在輸血醫(yī)學(xué)中有較廣泛的應(yīng)用。與普通紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)相比，流式細(xì)胞儀的最大特點(diǎn)是能夠根據(jù)不同的紅細(xì)胞抗原免疫熒光標(biāo)記，快速、靈敏、定量分析紅細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況，將異體紅細(xì)胞群區(qū)分開，并以圖形、數(shù)據(jù)形式直觀的將檢測結(jié)果呈現(xiàn)出來。

人類血型抗原是一個(gè)龐大的家族。1900年奧地利維也納大學(xué)卡爾·蘭德斯坦納發(fā)現(xiàn)了人類紅細(xì)胞ABO血型，從此揭開了血型的神秘面紗。國際輸血協(xié)會(huì)（ISBT）將目前已知并已證實(shí)的339個(gè)紅細(xì)胞血型抗原歸為33個(gè)血型系統(tǒng)、7個(gè)血型集合及2個(gè)血型系列。隨著新的血型抗原被發(fā)現(xiàn)，這些數(shù)字也不斷增長［4］。臨床異體輸血的原則是同型輸血，但通常只對(duì)血樣進(jìn)行ABO血型和Rh血型的檢驗(yàn)，即使是對(duì)其他血型有特殊要求，也幾乎不可能找到擁有完全相同紅細(xì)胞血型抗原的供者（同卵雙生除外）。當(dāng)人體接受了異體輸血后，體內(nèi)就會(huì)存在紅細(xì)胞表面抗原性狀表達(dá)不同的兩種紅細(xì)胞群，因此，若能證明不同紅細(xì)胞群的存在就能判斷是否異體輸血。

本研究參考國外相同領(lǐng)域先進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)異體血液回輸?shù)臋z測方法進(jìn)行了適用性驗(yàn)證研究，以證明使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測異體血液回輸?shù)目煽啃院涂刹僮餍浴?/p>

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及樣品制備

本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為半年內(nèi)未接受過輸血的健康中國人12名，抽取靜脈血2.5ml，使用ABO血型檢測試劑檢測其ABO血型。其中A型血2人，B型血6人，O型血3人，AB型血1人，RhD血型均為陽性。

樣品制備人員將A、B、O血型相同且測定的8種血型抗原至少有2種不相同的單一血樣制備成體外混合血樣。混合血樣依據(jù)紅細(xì)胞數(shù)按一定比例混合，混合比例分別為95%／5%、97%／3%、98.5%／1.5%、99.5%／0.5%，各 比例混合血樣的例數(shù)分別為8例，8例，8例，10例。樣品制備人員將所有單一和混合血樣編號(hào)后發(fā)放給檢測人員進(jìn)行檢測分析。

2.2 儀器和試劑

本實(shí)驗(yàn)所用檢測儀器為美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的FC500型號(hào)流式細(xì)胞儀。使用抗體為瑞士DiaMed公司生產(chǎn)的單克隆抗體產(chǎn)品，以及SEROTEC公司生產(chǎn)的FITC熒光標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

用細(xì)胞穩(wěn)定液將EDTA抗凝的新鮮血稀釋后，加入單克隆抗體，使之與相應(yīng)的紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合，并用熒光素標(biāo)記的示蹤抗體標(biāo)記紅細(xì)胞表面抗原抗體復(fù)合物。使用流式細(xì)胞儀對(duì)紅細(xì)胞表面特定血型抗原的表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。通過對(duì)此方法檢測的特異性和靈敏度、信噪比和污染攜帶率、檢測樣品穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性等方面的檢測，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀檢測異體血液回輸方法的準(zhǔn)確性和可操作性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抗原檢測特異性和靈敏度

經(jīng)檢測，這46例血樣的檢測判定結(jié)果為：12例單一血樣全部被檢出單峰并被準(zhǔn)確判為陰性（表1）。8例95%／5%和8例97%／3%比例混合的血樣均被檢測出兩個(gè)以上雙峰，所有應(yīng)為混合雙峰的樣品均被準(zhǔn)確檢出；8例98.5%／1.5%比例混合的血樣在應(yīng)出現(xiàn)雙峰的樣品圖中能被識(shí)別為雙峰，但個(gè)別抗體雙峰分離效果不佳，需進(jìn)行抗體優(yōu)化程序后方能被判定為雙峰；10例99.5%／0.5%比例混合的血樣中，只有4例樣品被判斷為含2個(gè)以上雙峰，其他混合樣品由于混合比例低于抗體檢測限而無法判定（圖1）。

表1 本研究12個(gè)單一血樣8種血型抗原的表達(dá)情況一覽表Table 1 The Phenotypes of Eight Blood Antigens in Twelve Samples

3.2 儀器信噪比和污染攜帶率

3.2.1 儀器信噪比

以8種抗體在95%／5%混合紅細(xì)胞樣品中只加入熒光示蹤抗體時(shí)，表達(dá)區(qū)域的紅細(xì)胞數(shù)占已設(shè)定的紅細(xì)胞區(qū)域內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比作為噪音，以3倍噪音作為該抗體的檢測限（表2）。

圖1 本研究紅細(xì)胞c抗原表型柱狀圖Figure 1. Histograms of RBC Antigen c

表2 本研究8種抗體檢測的噪音和檢測限一覽表Table 2 Noise and Limit of Detection for Eight Blood Antigens

3.2.2 污染攜帶率

根據(jù)流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)要求，在完成一次樣品檢測后立即檢測一支純水空白管，記錄30s內(nèi)紅細(xì)胞設(shè)定區(qū)域內(nèi)檢測到的顆粒數(shù)（N），重復(fù)200次，將檢測到的顆粒數(shù)相加，用此數(shù)值除以紅細(xì)胞設(shè)定區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞收集總數(shù)（A），并與重復(fù)次數(shù)作比，乘以100%得到污染攜帶率（CR）。公式為：

計(jì)算所得結(jié)果符合儀器廠商推薦的污染攜帶率小于1%的要求，說明儀器連續(xù)進(jìn)樣檢測不同樣品不會(huì)因進(jìn)樣器污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

3.3 樣品穩(wěn)定性

在8例97%／3%混合的血樣和12例單一血樣中分別任意挑選1例，分別分裝在4個(gè)離心管中，冰箱4℃保存。在制備血樣的第1、5、14、28天分別對(duì)這兩例血樣進(jìn)行血型抗原檢測，測定血液樣品隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，經(jīng)過4周的冷藏存放，混合和單一血樣圖的鋒形及相對(duì)位置無顯著變化，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

3.4 操作穩(wěn)定性

在46例血樣中選出6個(gè)樣品，其中包含單一血樣和各比例混合血樣。將其分裝成3份，分別由3位檢測人員完成對(duì)血型抗原的檢測，驗(yàn)證不同操作者對(duì)檢測結(jié)果判定的一致性。結(jié)果顯示，3位檢測人員的檢測及判斷結(jié)果一致。

4 討論

4.1 方法驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的血型血清學(xué)方法對(duì)46例血樣進(jìn)行紅細(xì)胞血型抗原的檢測，其中，12例單一血樣的特異性驗(yàn)證結(jié)果全部為陰性，符合世界反興奮劑機(jī)構(gòu)關(guān)于興奮劑檢測方法的檢測結(jié)果應(yīng)滿足100%陰性率和0%的假陽性率的特異性要求［14］。

對(duì)方法靈敏度的驗(yàn)證結(jié)果顯示，3%及以上比例少量混合的紅細(xì)胞被檢出率達(dá)到100%。當(dāng)少量混合的紅細(xì)胞比例降低時(shí)，部分樣品某些抗原表達(dá)與非表達(dá)的紅細(xì)胞群分離效果不好，出現(xiàn)融合峰或拖尾峰影響判斷，此時(shí)進(jìn)行抗體優(yōu)化程序可以解決或改善峰形問題。而當(dāng)混合比例進(jìn)一步降低至0.5%少量混合時(shí)，除了峰形問題外，由于定量結(jié)果低于抗體檢測限而使混合血樣檢出率明顯降低。造成這一結(jié)果的原因可能有：1）紅細(xì)胞血型抗原密度和抗原性強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致其與抗體結(jié)合能力存在差異；2）每種抗體效價(jià)不同，檢測限也有高低，其檢出能力由檢測限值最高的抗體決定；3）這8種抗體分別為單克隆抗體IgM和IgG，由于抗體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合了IgM抗體的紅細(xì)胞更易聚集，造成單細(xì)胞懸液制備不完全，聚集的多細(xì)胞被檢測為單細(xì)胞，導(dǎo)致定量結(jié)果低于檢測限，因此，盡管有的檢測人員能夠從柱狀圖上觀察到微弱的雙峰，但由于測定到的混合比例低于檢測限而不能將其判定為陽性。此外，流式細(xì)胞儀狀態(tài)也會(huì)對(duì)檢測結(jié)果造成影響，導(dǎo)致少量混合的紅細(xì)胞信號(hào)無法被檢測人員識(shí)別。

噪音和污染攜帶率影響了流式細(xì)胞儀的檢測能力，通過每次上機(jī)檢測前對(duì)儀器的校正以及對(duì)噪音和污染攜帶率的計(jì)算，來評(píng)估儀器狀態(tài)。儀器噪音過大，會(huì)掩蓋微弱的雙峰信號(hào)，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的判定，而污染攜帶率過高則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，在檢測過程中對(duì)儀器狀態(tài)的確認(rèn)是必要的。定期的維護(hù)和保養(yǎng)可以減少儀器本身對(duì)結(jié)果的影響。

人體血量約為4～5L，其中，循環(huán)血量約占總血量的4／5。有研究顯示，循環(huán)系統(tǒng)血紅蛋白增加5%可以提高運(yùn)動(dòng)能力［9］，輸血量太少則達(dá)不到增加血紅蛋白量進(jìn)而提高有氧耐力的目的。由于異體輸血伴隨感染、溶血、血液粘稠、疾病傳播等高風(fēng)險(xiǎn)因素，采用極少量輸入多個(gè)供血者血液的可能性較小，因而，此方法的檢測靈敏度能夠滿足興奮劑檢測的需要。通常紅細(xì)胞在人體內(nèi)的壽命約120天，這意味著，在異體輸血后，理論上最多可以有長達(dá)3至4個(gè)月的檢測窗口期能夠檢測到異體血液回輸。相比傳統(tǒng)興奮劑只有幾天的檢測窗口期來說，該方法能夠大大提高興奮劑檢查的效率。

用細(xì)胞穩(wěn)定液稀釋的混合血樣在冷藏條件下至少可存放4周，以此模擬運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行異體輸血后一段時(shí)間體內(nèi)不同紅細(xì)胞群的比例關(guān)系。在4周內(nèi)，不同操作人員對(duì)相同樣品測得的混合紅細(xì)胞群比例無明顯變化，說明此方法穩(wěn)定性好，可操作性高。

4.2 陽性判定

根據(jù)世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）對(duì)于免疫抗原法檢測興奮劑的要求，異體血液回輸陽性判定的標(biāo)準(zhǔn)為：在1份血樣中，當(dāng)有2個(gè)或2個(gè)以上特定紅細(xì)胞抗原存在多于1種表型時(shí)，判定為異體血液回輸陽性（AAF）；當(dāng)只有1個(gè)特定紅細(xì)胞抗原存在多于1種表型時(shí)，判定為可疑（ATF）［14］。正常情況下，每個(gè)人體內(nèi)所有紅細(xì)胞抗原的表達(dá)是唯一的，即要么表達(dá)，要么不表達(dá)，當(dāng)體內(nèi)某種紅細(xì)胞抗原同時(shí)存在表達(dá)與不表達(dá)的情況時(shí)（如圖1a），即存在兩種不同的紅細(xì)胞群，提示有異體輸血。當(dāng)然上述判定還需要排除嵌合體血型情況。

嵌合體血型多發(fā)生在異型輸血、異卵雙生、雙精受精和異型骨髓移植后。異型輸血、異型骨髓移植屬于獲得性嵌合（人工嵌合），異卵雙生、雙精受精是遺傳嵌合，屬于先天性嵌合。先天性嵌合，指在胚胎或妊娠時(shí)期形成的嵌合。先天性嵌合分兩種情況，一種是由于妊娠早期異卵雙生子之間存在血管交叉吻合，一方的造血干細(xì)胞經(jīng)由吻合的血管通路進(jìn)入到另一方體內(nèi)，在獲得性免疫耐受的基礎(chǔ)上，不同來源的造血干細(xì)胞分別產(chǎn)生兩群不同表型的紅細(xì)胞。另一種是在受精過程中，由2個(gè)卵細(xì)胞和2個(gè)精子相互結(jié)合而產(chǎn)生四倍體，四倍體受精卵繼續(xù)分裂就可能產(chǎn)生多種不同來源的細(xì)胞系。嵌合體現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致血型遺傳不符合經(jīng)典遺傳規(guī)律。此外，某些疾病也會(huì)導(dǎo)致嵌合體現(xiàn)象［2，3，5］。因此在采用本方法檢測發(fā)現(xiàn)異體血液回輸陽性時(shí)，運(yùn)動(dòng)員需進(jìn)行嵌合體血型鑒定，以排除先天性嵌合情況。

4.3 紅細(xì)胞血型抗原

血型是血液系統(tǒng)的一種遺傳多態(tài)性。傳統(tǒng)的血型概念指的就是紅細(xì)胞血型，是指能以抗體來分類的紅細(xì)胞抗原表型。紅細(xì)胞血型抗原是紅細(xì)胞表面的化學(xué)構(gòu)型，其形成的物質(zhì)基礎(chǔ)是紅細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)及結(jié)合到脂質(zhì)和蛋白質(zhì)上的糖分子。根據(jù)生化特性不同，紅細(xì)胞血型抗原可分為兩類，一類是由糖分子結(jié)構(gòu)決定的血型抗原，如ABO、Hh，Lewis，P，I等血型；另一類是由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定的血型抗原，如 Rh，MNS，Kell，Kidd，JK等血型。人類血型抗原由血型基因決定，同時(shí)受調(diào)控基因或修飾基因控制，具有個(gè)體差異性和種族差異性。

WADA對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)檢測異體血液回輸?shù)姆椒ㄖ猩婕暗降募t細(xì)胞血型抗原的選擇未做明確規(guī)定，一般以紅細(xì)胞血型抗原表型在人群中表達(dá)的比例作為選擇依據(jù)，在人群中表達(dá)型和不表達(dá)型均占有一定比例的血型抗原可作為候選抗原。表3列出了不同研究、賽事及機(jī)構(gòu)選擇的血型抗原種類和數(shù)量?？梢钥闯?，盡管各研究根據(jù)人群表達(dá)情況不同，選擇的血型抗原有所差異，但是都包括本文研究的這8種基本的血型抗原。

表3 不同研究選擇的紅細(xì)胞血型抗原一覽表Table 3 Choice of Blood Antigens in Different Research

本研究選擇了8種公認(rèn)的在人群中有適當(dāng)比例分布的血型抗原進(jìn)行中國人樣本的檢測分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受試的11名中國人中最多有3人存在ABO血型及其他8種血型抗原表型完全一致的情況。換句話說，假如這3個(gè)人相互之間進(jìn)行異體輸血，且排除了紅細(xì)胞血型抗原密度的個(gè)體差異時(shí)，將不能被檢測為陽性。理想狀態(tài)下，能夠檢測的候選紅細(xì)胞血型抗原種類越多，檢測的假陰性率就越低，但對(duì)于大樣本量的實(shí)際興奮劑檢測工作來說，可操作性較差。因此，科學(xué)地選擇紅細(xì)胞抗原種類進(jìn)行檢測，可以有效提高興奮劑檢測效率。李晟瑋［1］對(duì)Rh、Kell、Duffy、Kidd、Lewis、P、MNS和Luth等系統(tǒng)中的21個(gè)候選血型抗原進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其中 Leb、E、Jka、Jkb、M、C、e、c等血型抗原更適合于檢測中國人群異體血液回輸，并發(fā)現(xiàn)增加檢測血型抗原的數(shù)量，能夠有效減少異體輸血檢測假陰性發(fā)生的概率。意大利的Donati等人也有類似報(bào)道，他們發(fā)現(xiàn)，在8種基本血型抗原的基礎(chǔ)上增加另外5種（e，s，K，Lea，Leb）血型抗原后，能夠提高混合血樣的檢出率［7］。然而，在實(shí)際興奮劑檢測工作中，實(shí)驗(yàn)室檢測人員無法得知所檢測樣品的運(yùn)動(dòng)員個(gè)人信息，這為根據(jù)不同種族運(yùn)動(dòng)員選擇不同血型抗原的個(gè)性化的檢測手段的實(shí)施帶來一定難度。因此，在近兩屆奧運(yùn)會(huì)異體血液回輸?shù)呐d奮劑檢測中，都只選擇了這8種基本血型抗原進(jìn)行檢測。

5 小結(jié)

利用流式細(xì)胞技術(shù)能夠很好的檢測和區(qū)分小比例混合后血液中存在的不同紅細(xì)胞群，有效檢測運(yùn)動(dòng)員非法使用異體回輸血液興奮劑。目前，這一方法已通過了世界反興奮劑機(jī)構(gòu)和中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)認(rèn)可，并已應(yīng)用于常規(guī)檢測和奧運(yùn)會(huì)等大型賽事的異體血液回輸興奮劑檢測中。

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