熒光素-Fenton體系熒光法測(cè)定中草藥抗氧化活性

趙二勞*, 王迎進(jìn), 賈 楠， 趙三虎, 范建鳳

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州 034000)

自由基理論認(rèn)為，生物機(jī)體疾病的發(fā)生發(fā)展與衰老是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，它與自由基導(dǎo)致的機(jī)體細(xì)胞氧化損傷密切相關(guān)[1]?！H是目前已知的機(jī)體內(nèi)活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基[2]。它可以通過(guò)電子轉(zhuǎn)移等反應(yīng)，使機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)和核酸等氧化損傷，引起機(jī)體組織細(xì)胞壞死或突變，導(dǎo)致機(jī)體衰老或發(fā)生腫瘤等諸多疾病[3 - 4]。因此，尋求自由基清除劑成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[5]，而中草藥的天然、豐富及低毒更受人們的青睞。

本文利用Fenton體系產(chǎn)生·OH，它能迅速氧化熒光素使其熒光猝滅，加入抗氧化劑使與熒光素作用的·OH量減少，導(dǎo)致體系熒光猝滅程度降低，據(jù)此建立了熒光法篩選抗氧化劑的新體系。應(yīng)用該方法測(cè)定了金銀花、黃芪、甘草、葛根、菊花、黃柏、蒲公英、夏枯草和山楂9種中草藥提取物的抗氧化活性，方法簡(jiǎn)便、可靠和實(shí)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

RF-5301 PC熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

熒光素溶液：3.25 × 10-2mmol/L；FeSO4溶液：2.64 mmol/L；H2O2：0.024%；抗壞血酸溶液：1.94 mmol/L；硫脲溶液：4.10 mmol/L；NH3-NH4CI緩沖溶液：pH=10.5。實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

所用中草藥均購(gòu)于當(dāng)?shù)厮幍辍?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的確定在10 mL比色管中，依次加入0.3 mL NH3-NH4CI緩沖溶液(pH=10.5)，0.5 mL 濃度為3.25×10-2mmol/L熒光素溶液，2.0 mL濃度為 2.64 mmol/L FeSO4溶液，2.0 mL濃度為0.024%H2O2，二次蒸餾水定容至刻度，搖勻。反應(yīng)10 min后，熒光掃描確定其最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

1.2.2·OH的測(cè)定取兩支10 mL比色管，按1.2.1節(jié)的方法加入試劑(一支加Fenton試劑，一支不加)，以實(shí)驗(yàn)確定的發(fā)射波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)，分別測(cè)定加與不加Fenton試劑體系的熒光強(qiáng)度為F、F0，并計(jì)算△F=F0-F，則可間接求得·OH產(chǎn)生量。

1.2.3抗氧化劑對(duì)·OH清除率的測(cè)定按文獻(xiàn)方法[5]測(cè)定抗氧化劑對(duì)·OH清除率，其計(jì)算公式為：S=(Fs-F)/(F0-F)×100%。式中：S為對(duì)·OH的清除率；加入抗氧化劑Fenton體系熒光強(qiáng)度為Fs，F(xiàn)、F0意義同1.2.2。

1.2.4中草藥提取物抗氧化性的測(cè)定稱(chēng)取粉碎過(guò)40目篩的中草藥金銀花、黃芪、甘草、葛根、菊花、黃柏、蒲公英、夏枯草和山楂等各2.0 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加入60 mL 60%乙醇溶液，浸泡1 h后，在溫度40 ℃、超聲波功率320 W的條件下，提取40 min，提取液過(guò)濾定容至100 mL。此溶液相當(dāng)于1 mL 提取液中含有20 mg中草藥溶出物[6]，即20 mg/mL。取0.2 mL按1.2.3方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜

以490 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在400～650 nm范圍內(nèi)掃描熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖1。由圖1可知，熒光素最大發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm。其熒光峰為曲線1，被·OH氧化后熒光峰為曲線3，加入抗氧化劑后體系熒光峰為曲線2。顯然，曲線1與曲線2之差△F1表示體系產(chǎn)生·OH的量；曲線2與曲線3之差△F2表示加入抗氧化劑使體系熒光猝滅降低的量，△F2與△F1之比，則反映抗氧化劑對(duì)·OH的清除能力。實(shí)驗(yàn)以λex/λem= 490/515 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra 1.Fluorescein+buffer;2.Fluorescein+buffer+Fe2++H2O2+sntioxidant;3.Fluorescein+buffer+Fe2++H2O2.

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1酸度與緩沖溶液用量考慮到熒光素在酸性介質(zhì)中基本不發(fā)熒光或熒光很弱，而堿性介質(zhì)中發(fā)強(qiáng)熒光，熒光強(qiáng)度隨pH的增大而增大，當(dāng)pH10時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，并基本保持不變[7 - 9]，故選擇pH=10.5的緩沖溶液?？疾炀彌_溶液用量對(duì)體系△F的影響，在0.1～0.3 mL的范圍內(nèi)，△F隨用量增大而增大，用量大于0.3 mL后，△F呈減少趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)選作緩沖溶液用量為0.3 mL。

2.2.2試劑用量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3.25×10-2mmol/L熒光素溶液適宜用量為0.5 mL， 2.64 mmol/L FeSO4溶液適宜用量為2.0 mL，0.024%H2O2適宜用量為2.0 mL。

2.2.3反應(yīng)時(shí)間按實(shí)驗(yàn)方法操作，每隔2 min測(cè)一次熒光強(qiáng)度，8 min內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的增加而下降，8～20 min內(nèi)，熒光強(qiáng)度基本不變，實(shí)驗(yàn)選取反應(yīng)10 min后測(cè)定。

圖2 硫脲與抗壞血酸對(duì)·OH的清除率Fig.2 Scavenging percentage on ·OH of ascorbin acid (1) and thiourea (2)

2.3 抗氧化劑清除·OH的能力

抗壞血酸與硫脲是常用的抗氧化劑。在熒光素-Fenton體系中，分別加入不同量的抗壞血酸溶液(1.94 mmol/L)和硫脲溶液(4.10 mmol/L)，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定并計(jì)算清除率，以驗(yàn)證本方法的有效性，結(jié)果如圖2?？梢?jiàn)抗壞血酸和硫脲用量與其對(duì)·OH的清除率有明顯的量效關(guān)系，表明該方法可用于篩選抗氧化劑。同時(shí)實(shí)驗(yàn)測(cè)得9份2.5 mL硫脲溶液對(duì)·OH平均清除率S=28.81%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.56%，表明本實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好。

2.4 中草藥的抗氧化活性

按1.2.4實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定9種中草藥提取物對(duì)·OH的清除率，每種中草藥平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，所測(cè)9種中草藥均具有·OH清除能力，即具有抗氧化活性，相對(duì)而言，甘草、菊花、金銀花、葛根和山楂抗氧化活性更強(qiáng)。

表1 中草藥對(duì)·OH的清除率(n=3)

3 結(jié)論

建立了一種測(cè)定中草藥抗氧化活性的熒光分析新體系，應(yīng)用該方法測(cè)定了金銀花等9種常見(jiàn)中草藥的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)表明，該方法簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定可靠，具有較強(qiáng)的實(shí)用性，可用于抗氧化劑的篩選。同時(shí)實(shí)驗(yàn)也表明，甘草、菊花、金銀花、葛根和山楂等中草藥具有較強(qiáng)的抗氧化活性，說(shuō)明這些草藥中抗氧化物質(zhì)含量較高，具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。