高效液相色譜法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼原料藥含量

嚴(yán)拯宇， 劉新穎， 王麗麗， 廖聲華

(中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京 211198)

甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)，商品名格列衛(wèi)(Glive)，是由瑞士Novartis公司研發(fā)的第一代酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)，并作為全球第一個(gè)獲得批準(zhǔn)的腫瘤發(fā)生相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑進(jìn)入臨床應(yīng)用。該藥于2001年5月被英國(guó)食品藥品管理局(U.S.Feod and Drug Adninstration,FDA)批準(zhǔn)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病，2003年被批準(zhǔn)用于治療胃腸道間質(zhì)瘤(Gastrointestinal Stromal Tunor,GIST)，治療效果得到廣泛認(rèn)可。目前，關(guān)于甲磺酸伊馬替尼的合成[1,2]及臨床應(yīng)用[3]的研究較多，而對(duì)于該藥質(zhì)量控制的研究并不多見，各國(guó)藥典均未收錄其原料和制劑的檢測(cè)方法?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼含量的方法中[4 - 7]，流動(dòng)相多添加三乙胺或離子對(duì)試劑辛烷磺酸鈉，流動(dòng)相難平衡，重現(xiàn)性差。

本文在參考文獻(xiàn)方法[8]的基礎(chǔ)上，建立了HPLC法測(cè)定原料藥中甲磺酸伊馬替尼含量的方法，并參照《中國(guó)藥典》(2010版)有關(guān)要求進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，證實(shí)該方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)，配置SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器(DAD)；BS124S型電子天平(德國(guó)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品(含量以干燥品計(jì)為99.6%)；甲磺酸伊馬替尼原料藥(批號(hào)：20140303，20140403，20140503)，已知雜質(zhì)：(1)4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)苯甲酸二鹽酸鹽；(2)N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺；(3)4-[(4-甲基-1-氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(4)4-[(4-甲基-1，4--氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(5)4-甲基-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-哌嗪-苯胺鹽酸鹽;(6)N-(5-甲氧基氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺;(7)4-[(4-甲基-4-氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(8)N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(3-吡啶基)-2嘧啶胺，均由中國(guó)藥科大學(xué)醫(yī)化所提供。乙腈(色譜純，美國(guó)默克公司)；辛烷磺酸鈉(色譜純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：取KH2PO46.8 g，加水溶解，用H3PO4調(diào)節(jié)pH至3.0，再加水至1 000 mL。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱(150×4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相A：0.05 mol·L-1PBS(pH=3.0)；流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫程序：0.0～20.0 min，95%～85%A；20.0～40.0 min，85%～70%A；40.0～50.0 min，70%～55%A；50.0～55.0 min，55%～55%A；55.0～56.0 min，55%～95%A；56.0～60.0 min，95%～95%A。柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。

1.3 溶液制備

1.3.1系統(tǒng)適用性溶液的制備根據(jù)本品的合成工藝，分析原料藥中可能引入的雜質(zhì)，包括起始原料、中間體及已知降解雜質(zhì)等多達(dá)8種(雜質(zhì)1、2、3、4、5、6、7、8)。分別精密量取上述8種已知雜質(zhì)及甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品適量，用稀釋劑(流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比為95∶5)稀釋，制成含已知雜質(zhì)2、3、4、7 濃度約為0.2 μg·mL-1、含已知雜質(zhì)1、5、6、8濃度約為0.3 μg·mL-1、含甲磺酸伊馬替尼濃度約為0.2 mg·mL-1的混合溶液。

1.3.2供試品及對(duì)照品溶液的制備取甲磺酸伊馬替尼原料藥適量，精密稱定，用稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含0.1 mg的溶液，作為供試品溶液。另取甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品適量，精密稱定，用稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.3.3有關(guān)物質(zhì)溶液的制備取甲磺酸伊馬替尼原料藥適量，加稀釋劑溶解后并用其稀釋制成濃度約為0.2 mg·mL-1的溶液，作為供試液；取該試液適量，用稀釋劑稀釋定量濃度為0.2 μg·mL-1的溶液作為對(duì)照溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇根據(jù)甲磺酸伊馬替尼供試品及8個(gè)已知雜質(zhì)的DAD光譜掃描結(jié)果，表明樣品在235 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，合成的起始原料、各步中間體及降解雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)按出峰順序分別為235、235、235、235、245、245、235、274 nm，為兼顧各峰，最終選擇測(cè)定波長(zhǎng)為235 nm。

2.1.2流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)中分別選取乙腈-PBS、乙腈-PBS-三乙胺、乙腈-PBS-辛烷磺酸鈉(不同比例)作為流動(dòng)相。以乙腈-PBS作為流動(dòng)相時(shí)，基線平穩(wěn)且分離度較好。流動(dòng)相中添加三乙胺后，峰形和分離度無明顯改善，但基線噪音有所增加；添加辛烷磺酸鈉后，添加離子與帶電分析物形成中性化合物，增加了在色譜柱上的保留。以上兩種添加劑的加入均增加了色譜系統(tǒng)的平衡時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)還考察了流動(dòng)相A的pH(2.5、3.0、3.5)對(duì)分離情況的影響。隨著pH的增加，各組分出峰時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)已知雜質(zhì)6與甲磺酸伊馬替尼主峰的分離度影響較大，且主峰拖尾情況也越嚴(yán)重。從分離度、峰形及色譜柱的使用壽命綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相A的pH為3.0。

2.2 專屬性試驗(yàn)

圖1 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

2.2.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按1.3.1項(xiàng)下方法配制系統(tǒng)適用性溶液，按1.2節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。理論塔板數(shù)按甲磺酸伊馬替尼計(jì)為135 500N/m，甲磺酸伊馬替尼峰與已知雜質(zhì)6、已知雜質(zhì)7的分離度(Rs)分別為2.5和3.7，表明系統(tǒng)的適用性滿足要求。色譜圖見圖1。

2.2.2強(qiáng)制降解試驗(yàn)取甲磺酸伊馬替尼供試品適量，經(jīng)高溫(95 ℃，1 h)、酸(加1.0 mL 1 moL·L-1HCl，室溫1 h)、堿(加1.0 mL 1 moL·L-1NaOH，室溫1 h)、氧化(加1.0 mL 6%H2O2，室溫1 h)、光照(4 500 Lx，48 h)破壞后，用稀釋劑定容，進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。在酸、堿和氧化破壞下甲磺酸伊馬替尼發(fā)生了降解，所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物與主峰分離度良好，并用DAD對(duì)主峰純度作出進(jìn)一步判斷，甲磺酸伊馬替尼的色譜峰是純的。說明所建方法專屬性良好。

圖2 甲磺酸伊馬替尼與降解產(chǎn)物的分離色譜圖Fig.2 Chromatograms of imatinib mesylate and its degradation products A.destroyed by acid;B.destroyed by alkali;C.destroyed by oxidation;D.destroyed by heating;E.destroyed by light;F.blank solvent.

2.3 線性關(guān)系考察

取甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品約20 mg(精密稱定)，置于25 mL容量瓶中，用少量稀釋劑溶解并稀釋至刻度，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加稀釋劑稀釋并定容，得到標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按1.2節(jié)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:y=7×107x-45674(r=0.9995)。結(jié)果表明，甲磺酸伊馬替尼在0.0168～0.1677 mg·mL-1范圍內(nèi)其濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4 定量限和檢測(cè)限

取1.3節(jié)下甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品溶液，用稀釋劑逐級(jí)稀釋后依法測(cè)定。以信噪比(S/N)=10計(jì)算，甲磺酸伊馬替尼定量限為11 ng·mL-1；以信噪比(S/N)=3計(jì)算，甲磺酸伊馬替尼檢測(cè)限為3.3 ng·mL-1。

2.5 精密度與重復(fù)性

取1.3節(jié)下甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.13%(n=6)，表明精密度良好。取甲磺酸伊馬替尼供試品(批號(hào)：20140303)適量，按1.3節(jié)下方法平行配制6份供試品溶液，依法測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算甲磺酸伊馬替尼含量。結(jié)果顯示平均含量為99.7%，RSD為0.35%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性

按1.3節(jié)下方法，將新鮮配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后分別進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為1.2%(n=8)，供試品溶液峰面積的RSD為0.20%(n=8)，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加標(biāo)回收率

取已知含量的甲磺酸伊馬替尼供試品(批號(hào)：20140303)適量，精密稱定(9份)，分別加入甲磺酸伊馬替尼對(duì)照品適量，配制其濃度分別為80%、100%、120%三個(gè)水平的供試品溶液。分別精密吸取20 μL，依法測(cè)定。以供試品加標(biāo)后實(shí)際測(cè)量值減去樣品測(cè)定值之差與加標(biāo)量的比值作為加標(biāo)回收率，得到方法的平均加標(biāo)回收率為98.9%(n=9)，RSD 為 0.67%，表明方法的回收率良好。

2.8 樣品測(cè)定

取干燥后的甲磺酸伊馬替尼供試品(批號(hào)：20140303，20140403，20140503)及對(duì)照品適量，精密稱定，按1.3節(jié)下方法分別制備含量測(cè)定溶液和有關(guān)物質(zhì)檢查溶液，進(jìn)行測(cè)定，并記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，按自身稀釋對(duì)照法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，3批樣品的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 3批樣品含量及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.9 非水滴定法與HPLC法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼含量比較

對(duì)于原料藥的含量測(cè)定，我們選擇非水酸堿滴定法，參照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄VII A電位滴定法的規(guī)定[9]，以冰乙酸∶醋酐(1∶8)為溶劑，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，電位法指示終點(diǎn)，滴定結(jié)果空白校正，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HPLC法進(jìn)行比較，對(duì)原料藥(批號(hào)：20140303，20140403，20140503)的含量進(jìn)行了檢測(cè)。非水滴定法測(cè)得的含量為99.4%、99.6%、99.6%；兩種方法測(cè)定結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本文所建立的分析甲磺酸伊馬替尼原料藥的HPLC方法，流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，平衡時(shí)間短，基線平穩(wěn)，可使甲磺酸伊馬替尼與其他8種已知雜質(zhì)全部有效分離，精密度和準(zhǔn)確度較高，專屬性較強(qiáng)，重現(xiàn)性較好，可用于甲磺酸伊馬替尼原料藥的含量測(cè)定。