基于CdTe量子點(diǎn)的熒光猝滅-恢復(fù)法測(cè)定L-半胱氨酸

李滿秀*, 任光明, 孫笑笑, 楊 艷, 丁 茹

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系,山西忻州 034000 )

L-半胱氨酸是20 種必需氨基酸中唯一含有活性巰基(-SH)的氨基酸，它具有一定生理功能，在醫(yī)藥、食品及化妝品行業(yè)中都有應(yīng)用。因此，研究L-半胱氨酸的測(cè)定方法具有現(xiàn)實(shí)意義。目前測(cè)定L-半胱氨酸有高效液相色譜法[1,2]、電位法[3,4]、熒光分析法[5]等。

量子點(diǎn)(QDs)作為一種新型熒光材料 ，具有激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，可調(diào)諧的發(fā)射波長(zhǎng)和抗漂白性等優(yōu)點(diǎn)，在定量分析中起著重要作用[6,7]。近幾年，基于量子點(diǎn)熒光猝滅-恢復(fù)技術(shù)建立的分析方法已有報(bào)道[8,9]，但用這種方法測(cè)定L-半胱氨酸的研究未見報(bào)道。本文以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，合成了水溶性的CdTe QDs，利用Ni2+對(duì)CdTe QDs熒光的猝滅，以及L-半胱氨酸使該體系熒光恢復(fù)的方法，建立了測(cè)定L-半胱氨酸的新方法，該方法操作簡(jiǎn)單，選擇性和靈敏度高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本，島津公司)；pHS-3B型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；78型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇金城國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司(上海))；循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；微量進(jìn)樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)。

L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取0.0121 g L-半胱氨酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),用水溶解配成1.0×10-3mol/L 儲(chǔ)備液,4 ℃冰箱保存,工作液用水稀釋現(xiàn)配。Ni2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取0.0291 g Ni(NO3)2·6H2O(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)用水溶解，配成1.0×10-3mol/L儲(chǔ)備液，測(cè)定時(shí)逐級(jí)稀釋；NaBH4(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，巰基乙酸(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)，碲粉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，CdCl2·2.5H2O (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 量子點(diǎn)合成方法[10]

稱取碲粉0.1276 g,NaBH40.0800 g,置于三頸瓶中，加入二次蒸餾水3 mL，用真空泵排盡空氣且用氮?dú)獗Ｗo(hù)，在冰水浴中和強(qiáng)磁力攪拌下進(jìn)行反應(yīng)，4 h后停止反應(yīng)，靜置10 min，上層為無色的NaHTe水溶液，下層為白色固體Na2B4O7·10H2O，NaHTe水溶液易被氧化，應(yīng)密封保存。

在三頸燒瓶中加入100 mL 1.25×10-3mol/L CdCl2溶液,通高純氮?dú)?0 min，加入巰基乙酸25 μL，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至11.2，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，迅速加入75 μL新制備的還原劑NaHTe。反應(yīng)液中Cd2+∶HTe-∶TGA 的摩爾比為1.00∶0.20∶2.40。在96 ℃水浴中回流3 h，即得水溶性CdTe QDs。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1Ni2+對(duì)CdTeQDs熒光猝滅的測(cè)定在一系列5 mL比色管中加入 0.6 mL CdTe QDs，然后依次加入不同濃度的Ni2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用pH=10.0的硼砂緩沖溶液定容，室溫下放置一段時(shí)間，于λex=400 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

1.3.2CdTeQDs熒光恢復(fù)法測(cè)定L-半胱氨酸在一系列5 mL比色管中加入 0.6 mL CdTe QDs，再加適量pH=10的硼砂緩沖溶液，加入一定量的Ni2+溶液，使其濃度為40×10-6mol/L，振搖后靜置15 min,再向其中加入不同濃度梯度的L-半胱氨酸溶液，然后用pH=10.0的硼砂緩沖溶液定容，放置30 min,于λex=400 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe Qds的光學(xué)性質(zhì)

圖1 CdTe QDs的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectrum of CdTe QDs

CdTe QDs的熒光光譜如圖1所示，固定激發(fā)波長(zhǎng)λex=400 nm，測(cè)得最大發(fā)射波長(zhǎng)λem=620 nm，從圖中可以看出熒光發(fā)射峰峰形對(duì)稱，說明合成的量子點(diǎn)有穩(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)。

2.2 Ni2+對(duì)CdTe QDs的熒光猝滅

在室溫下，往量子點(diǎn)中加入不同濃度的Ni2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH=10.0的硼砂緩沖溶液定容，測(cè)其熒光光譜。如圖2所示，隨著加入Ni2+加入量的增大，量子點(diǎn)的熒光猝滅程度不斷增大，且在2.0 ×10-7～ 4.5×10-5mol/L 范圍內(nèi)猝滅程度與Ni2+濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9992。量子點(diǎn)熒光猝滅的原因是由于量子點(diǎn)表面有大量的羧基和羥基官能團(tuán)，與Ni2+形成復(fù)合物并覆蓋在量子點(diǎn)的表面，并與量子點(diǎn)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生更多非輻射中心導(dǎo)致熒光猝滅。

2.3 L-半胱氨酸對(duì)猝滅后體系的熒光恢復(fù)

選擇最佳Ni2+的猝滅體系，在體系中加入不同濃度的L-半胱氨酸，量子點(diǎn)熒光得到了恢復(fù)，且隨著L-半胱氨酸濃度的增大，恢復(fù)程度不斷增大，如圖3所示。加入的L-半胱氨酸能與量子點(diǎn)表面復(fù)合物中Ni2+發(fā)生螯合作用，使原來覆蓋在量子點(diǎn)表面的復(fù)合物分解，量子點(diǎn)表面負(fù)電荷增加，周圍分子定向極化率提高，量子點(diǎn)表面得到恢復(fù)，因此CdTe熒光強(qiáng)度得以恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)表明加入L-半胱氨酸前后熒光強(qiáng)度的比值(F/F0)與其濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9990。

圖2 Ni2+對(duì)CdTe QDs的熒光猝滅 Fig.2 Fluorescence spectra of Ni2+ quenched CdTe QDs 1-7:cNi2+:0,2,6,10,18,30,45 μmol/L，respectively.

圖3 L-半胱氨酸對(duì)CdTe QDs的熒光恢復(fù)Fig.3 Effects of concentrations of L-cystine on fluorescence of CdTe QDs 1-7:cL·cystine:0,6,10,20,30,40,50 μmol/L,respectively.

2.4 溫度的影響

在溫度分別為25 ℃和32 ℃考察了溫度的影響。結(jié)果表明，溫度升高，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度減弱，但Ni2+的濃度與熒光強(qiáng)度猝滅程度仍然呈良好的線性關(guān)系，因此在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中保持溫度為25 ℃。

2.5 緩沖溶液及pH的影響

圖4 pH對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH on the fluorescence intensity

為獲得較好的猝滅效果和恢復(fù)效果，研究了不同緩沖溶液的影響。分別以硼砂緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液和磷酸鹽緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)，測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硼砂緩沖溶液的效果最佳。進(jìn)一步考察了不同pH的硼砂緩沖溶液對(duì)熒光恢復(fù)的影響，pH=10.0的反應(yīng)體系情況最佳，結(jié)果見圖4。

2.6 量子點(diǎn)和Ni2+濃度的影響

當(dāng)體系的熒光強(qiáng)度很強(qiáng)的時(shí)候，少量Ni2+的加入，熒光猝滅程度小，導(dǎo)致分析的靈敏度低；當(dāng)體系的熒光較弱時(shí)，少量Ni2+的加入，熒光猝滅程度較大，靈敏度高，但線性范圍窄。為了兼顧靈敏度和線性范圍，本實(shí)驗(yàn)使用的CdTe QDs溶液濃度為2.5×10-4mol/L(以Cd2+計(jì))，Ni2+濃度為40 μmol/L。

2.7 共存物質(zhì)的影響

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)多種共存物質(zhì)進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，當(dāng)允許誤差為±5%，L-半胱氨酸的濃度為30 μmol/L時(shí)，各共存物質(zhì)的允許量(μmol/L)如下:Ca2+、Na+、Zn2+(200)，Mg2+、K+(160)，Ba2+、Al3+(120)，F(xiàn)e3+(20),苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸(200)，精氨酸、色氨酸、賴氨酸(160)，酪氨酸(200)，葡萄糖、淀粉(140)。

2.8 工作曲線、精密度與檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下獲得L-半胱氨酸濃度與CdTe QDs 體系熒光恢復(fù)強(qiáng)度之間的關(guān)系。L-半胱氨酸在6.0×10-6～5.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與量子點(diǎn)熒光恢復(fù)程度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為:F/F0=0.0159c+0.998(c:μmol/L)，r=0.9990，方法檢出限(S/N=3)為2.1×10-6mol/L，對(duì)1.0×10-5mol/L L-半胱氨酸溶液進(jìn)行10次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%。

2.9 樣品分析

取1 mL市售果汁于50 mL容量瓶中，用水定容;取2 g市售蜂蜜于燒杯中溶解，再轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用水定容。按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定蜂蜜和果汁樣品中L-半胱氨酸的含量并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 樣品分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本文在水相中合成CdTe QDs,利用CdTe QDs熒光猝滅-恢復(fù)技術(shù),建立了一種測(cè)定L-半胱氨酸的新方法。方法操作簡(jiǎn)單,選擇性和靈敏度高,適用于果汁等樣品中L-半胱氨酸的測(cè)定,有較好的實(shí)用價(jià)值。