高效液相色譜-二極管陣列檢測法同時測定糖果中11種脂溶性著色劑

李 瑋*， 艾連峰， 魏欣欣， 馬育松， 陳瑞春， 郭春海

(河北出入境檢驗檢疫局，河北石家莊 050051)

脂溶性著色劑如蘇丹橙G、甲基黃、對位紅、柑桔紅2號、蘇丹紅G、蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅱ、蘇丹Ⅲ、蘇丹紅7B、蘇丹紅B和蘇丹Ⅳ等屬于偶氮類染色劑(結(jié)構(gòu)式見圖1)，主要用于潤滑油以及生化毒理學(xué)研究中的著色，不包括在我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T2760-2011)內(nèi)，因此禁止用于食品。但由于這類染色劑色澤鮮艷、著色穩(wěn)定、價格低廉，所以常被非法添加到有色食品中。研究表明，這類物質(zhì)通過食品進(jìn)入人體后會干擾人體正常代謝功能，重者可能致畸、致癌。因此對這類物質(zhì)測定方法的研究具有現(xiàn)實意義。

目前，對糖果中色素的研究報道較少[1 - 3]，尤其對糖果中蘇丹紅等著色劑的報道還是空白。多數(shù)文獻(xiàn)報道是針對辣椒及制品、肉制品和禽蛋的研究，包括薄層色譜法[4]、液相色譜法[5 - 11]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12 - 14]和氣相色譜-質(zhì)譜法[15]。由于糖果中主要成分為蔗糖、果糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖等，與辣椒、肉、禽蛋差別較大，因此亟需研究適用于糖果中著色劑的檢測方法。本研究根據(jù)糖果的特性，樣品直接用乙酸乙酯提取，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)測定。該方法易操作、回收率穩(wěn)定，有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，能滿足食品中多種禁用脂溶性著色劑的檢測要求，可作為一種常規(guī)分析手段在大多數(shù)實驗室中推廣應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)，配二極管陣列檢測器(DAD)；Hitachi離心機(jī)(日本,Hitachi公司)；LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國，Heidolph公司)；Milli-Q 超純水器(美國，Millipore公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：柑桔紅2號購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，蘇丹橙G、甲基黃、對位紅、蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅱ、蘇丹Ⅲ、蘇丹紅7B、蘇丹紅B、蘇丹紅Ⅳ，均購自Dr.Ehrenstorfer公司。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取11種著色劑各0.0100 g于100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃避光保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液以甲醇稀釋配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將其稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜純(Fluka公司)。實驗用水均為Milli-Q高純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：A為甲醇，B為乙腈，C為水。梯度洗脫程序：0～10 min，A從50%降至10%，B從25%升至80%；10～15 min，A從10%升至90%，B從80%降至0；15～20 min，A從90%升至100%；20～30 min，A保持100%；30～30.1 min，A從100%降至50%，B從0升至25%；30.1～35 min 保持A 50%，B 25%。檢測波長：400 nm,500 nm,525 nm;進(jìn)樣量為50 μL；柱溫：35 ℃。

1.3 樣品前處理

稱取5.00 g已粉碎混勻的試樣于50 mL離心管中，加5 mL水渦旋至溶解，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋提取2 min，以4 000 r/min離心8 min，然后吸出乙酸乙酯層到雞心瓶中，下層再用10 mL×2乙酸乙酯重復(fù)提取，合并3次乙酸乙酯層。將收集的洗脫液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容至1 mL，渦旋震蕩后過0.22 μm濾膜后，進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

11種著色劑均為脂溶性化合物，分別試驗了乙酸乙酯、甲醇、乙腈和正己烷等有機(jī)溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈和甲醇的提取效率較低，回收率只有30%～40%；正己烷提取的溶液較混濁且對環(huán)境污染較大；最終選擇乙酸乙酯為提取溶劑，其回收率達(dá)到80%以上，且經(jīng)濟(jì)環(huán)保安全，便于下一步濃縮。

糖果中主要成分為蔗糖、果糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖等水溶性物質(zhì)，選用有機(jī)溶劑作為提取劑還可以起到凈化效果，除去水溶性物質(zhì)的干擾，提取液蒸干定容后可直接用儀器檢測，節(jié)省了凈化步驟，大大提高了檢測效率。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了Cloversil C18柱(150×4.6 mm,5 μm，美國維康)對11種著色劑的分離效果和色譜峰形，發(fā)現(xiàn)蘇丹Ⅳ和蘇丹紅B不能完全分離；而用Inertsil ODS-3 C18柱(250×4.6 mm，5 μm，日本島津)可使待測物在柱上得到較好的保留從而得到理想的分離效果。

大多數(shù)文獻(xiàn)中使用的流動相為甲醇-水或乙腈-水兩種體系。實驗分別考察了在不同梯度洗脫方式下上述兩種體系作為流動相對11種著色劑色譜行為的影響，蘇丹紅B和蘇丹Ⅳ結(jié)構(gòu)相近，出峰時間相近，用乙腈洗脫不能分離，因此選擇洗脫能力稍弱的甲醇；柑桔紅2號和蘇丹紅G出峰時間相近，乙腈洗脫能力較強(qiáng)，因此峰形較窄，有利于二者分離。因此選擇甲醇-乙腈-水體系，采用1.2梯度洗脫方式使目標(biāo)化合物均得到了較好的分離，且受雜質(zhì)干擾較少。

2.3 檢測波長的選擇

利用二級管陣列檢測器在250～650 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明：蘇丹橙G和二甲基黃吸收光譜相近，最大吸收波長在380～410 nm左右；對位紅、蘇丹紅G、蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅱ、蘇丹Ⅲ和蘇丹紅B的吸收光譜相近，最大波長在470～510 nm；柑桔紅2號、蘇丹紅7B和蘇丹Ⅳ的最大吸收波長在510～530 nm范圍內(nèi)。綜合考慮后選取400 nm作為蘇丹橙G和甲基黃的檢測波長；500 nm為對位紅、蘇丹紅G、蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅱ、蘇丹Ⅲ和蘇丹紅B的檢測波長；525 nm為柑桔紅2號、蘇丹紅7B和蘇丹Ⅳ的檢測波長。在最優(yōu)儀器條件下，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖和加標(biāo)樣品色譜圖分別見圖2和圖3。

圖2 11種脂溶性著色劑的色譜圖(50 ng/mL)Fig.2 Chromatograms of 11 fat-soluble colorants (50 ng/mL) 1.Sudan orange G;2.Dimethyl yellow;3.Para red;4.Citrus red 2;5.Sudan red G;6.SudanⅠ;7.SudanⅡ;8.Sudan Ⅲ;9.Sudan red 7B;10.Sudan red B;11.Sudan Ⅳ.

圖3 添加樣品的色譜圖(10 μg/kg)Fig.3 Chromatograms of spiked samples(10 μg/kg) 1.Sudan orange G;2.Dimethyl yellow;3.Para red;4.Citrus red 2;5.Sudan red G;6.SudanⅠ;7.SudanⅡ;8.Sudan Ⅲ;9.Sudan red 7B;10.Sudan red B;11.Sudan Ⅳ.

2.4 線性范圍和定量限

按實驗方法對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，11種著色劑的質(zhì)量濃度(X,mg/L)均在0.02～1.0 mg/L范圍內(nèi)與對應(yīng)峰面積(Y)呈線性關(guān)系，其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作液，直至獲得每種化合物信噪比(S/N)=10，確定為該化合物的定量限(LOQ)，由表1可見，11種著色劑的定量限均為10 μg/kg。

表1 11種著色劑的檢測波長、保留時間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)和定量限(LOQ)

(續(xù)表1)

CompoundWavelength(nm)tR(min)Regression equationLinear range(mg/L)rLOQ(μg/kg)Citrus red 252512.90Y=0.1242X+0.4.290.02-1.00.999910Sudan red G50013.20Y=0.2313X+1.29060.02-1.00.999710SudanⅠ50013.60Y=0.1622X+1.27300.02-1.00.998810SudanⅡ50018.90Y=0.1500X+0.98080.02-1.00.999810SudanⅢ50021.38Y=0.2487X+0.75020.02-1.00.999910Sudan red 7B52525.53Y=0.2371X+0.90910.02-1.00.999810Sudan red B50026.85Y=0.2133X+0.55400.02-1.00.999910Sudan Ⅳ52527.22Y=0.2367X+0.65090.02-1.00.999910

2.5 回收率和精密度

實驗中所用糖果樣品均為從市場購買的彩色水果糖、棒棒糖。選擇不含11種脂溶性著色劑的糖果，進(jìn)行10、20、40 μg/kg三個添加水平的回收試驗，每一水平測定10次，測定結(jié)果見表2。11種化合物的平均回收率為79.6%～97.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.66%～6.76%。

表2 11種著色劑的加標(biāo)回收率和精密度(n=10)

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-二極管陣列法檢測糖果中蘇丹橙G、甲基黃、對位紅、柑桔紅2號、蘇丹紅G、蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅱ、蘇丹Ⅲ、蘇丹紅7B、蘇丹紅B和蘇丹Ⅳ11種脂溶性著色劑的分析方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后直接檢測，節(jié)省了凈化步驟，大大提高了檢測效率。方法簡單、快速、靈敏，同時利用保留時間和光譜圖對待測物進(jìn)行定性和定量分析，提高了方法的準(zhǔn)確度，避免了假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，定量限達(dá)到10 μg/kg，為糖果中違法添加各種禁用著色劑的監(jiān)督檢驗提供技術(shù)支撐。