L-天門冬氨酸分子印跡電極的制備與性能研究

谷靈燕， 申貴雋， 趙志偉

(大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連116622)

L-天門冬氨酸(L-Asp)普遍存在于生物的合成作用中，它是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體，同時具有改善心肌收縮功能、可降低血液中氮和二氧化碳的量、增強(qiáng)肝臟功能、消除疲勞等作用。目前，L-Asp的檢測方法主要有高效液相色譜法[1,2]、絡(luò)合滴定法[3]、氧化還原法[4]等。但是這些方法有的涉及貴重的儀器和復(fù)雜的操作，有的靈敏度不高。近年來，化學(xué)修飾電極應(yīng)用于藥物分析、食品檢測的電化學(xué)方法十分廣泛[5,6]。其中，分子印跡電極具有簡單、快速、成本低廉、選擇性好、抗干擾性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[7]。倪珺華等人[8]以L-Asp為模板分子，制備分子印跡聚苯胺，并將其作為電極式色譜柱的固定相，實(shí)現(xiàn)了對Asp對映體的識別。陳怡等人[9]以硫酸鏈霉素為模板分子，通過循環(huán)伏安電聚合在玻碳電極表面構(gòu)建出對STR具有選擇特異性的電化學(xué)傳感器。申貴雋等人[10]以硫酸特布他林為模板分子，制備了硫酸特布他林分子印跡電極。通常采用加交聯(lián)劑的方法來提高印跡膜的穩(wěn)定性，不用交聯(lián)劑的分子印跡技術(shù)及其直接測定L-Asp的電化學(xué)方法尚未見文獻(xiàn)報道。

本文以鄰苯二胺(OPD)為功能單體，L-Asp為模板分子，利用電化學(xué)聚合的方法在金電極表面修飾鄰苯二胺聚合膜(POPD)，用甲醇和乙酸的混合液洗脫模板分子，制備了L-Asp分子印跡電極。本研究省去了交聯(lián)劑的使用，通過OPD與玻碳電極不飽和鍵的加成作用來實(shí)現(xiàn)印跡膜的使用壽命。建立了一種測定保健品中L-Asp含量的電化學(xué)分析方法。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CHI600C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)：工作電極為金電極(天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司)或修飾電極，參比電極為Ag/AgCl電極(上海納锘實(shí)業(yè)有限公司)，對電極為鉑電極(天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；80-1型離心沉淀機(jī)(上海機(jī)械手術(shù)廠)；pHB-1型酸度計(上海宇隆儀器有限公司)；FA1604型分析天平(上海雷韻試驗儀器制造有限公司)。

L-天門冬氨酸(L-Asp，北京萬佳首化生物科技有限公司)；L-苯丙氨酸(L-Phe，中國惠興生化有限公司);L-色氨酸(L-Trp，中國惠興生化有限公司)；鄰苯二胺(OPD，湖北拓楚慷元醫(yī)藥化工有限公司)；NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(PBS)。所有試劑均為分析純，實(shí)驗用水為去離子水。

利君鈣牌天門冬氨酸鈣片(保健品，西安利君制藥有限責(zé)任公司)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1金電極預(yù)處理將Au電極在金相砂紙(3 000#)上打磨，然后在麂皮上依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末拋光，依次用無水乙醇和水充分超聲清洗。將處理后的電極置于1.0 mol/L的H2SO4中，以50 mV/s掃描速度，在-0.2～+1.6 V電位區(qū)間，用循環(huán)伏安(CV)法掃描直至穩(wěn)定[11]。將電極取出后用水沖洗干凈，保存在水中備用。

1.2.2分子印跡電極的制備將處理好的Au電極置于3 mmol/L OPD和1 mmol/L的L-Asp的PBS(pH=5.4)中，用CV法掃描25圈，掃描范圍為-0.2～+1.4 V，掃速為50 mV/s,得到修飾電極L-Asp/POPD/Au。聚合后的電極用體積比為7∶3的甲醇-乙酸混合洗脫液洗脫6 min，得到L-Asp分子印跡電極(MIP/Au)。非印跡電極(NIP/Au)除不加模板分子L-Asp外，其他條件和分子印跡電極完全相同。電極每次使用后，用模板洗脫液洗脫6 min后,冰箱中恒溫保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡敏感膜的聚合與表征

圖1為Au電極在L-Asp和OPD混合液中電聚合過程的CV曲線。從圖1可以看出，OPD的電聚合過程是不可逆過程，隨著掃描圈數(shù)的增加，峰電流不斷降低，表明Au電極表面逐漸形成致密絕緣的聚合膜(POPD)。在電聚合的過程中，初始聚合速度很快，生成的聚合膜較為疏松，L-Asp分子會嵌入到聚合膜中[12]，L-Asp分子中的氨基、羧基與OPD的氨基具有特定的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)。以[Fe(CN)6]3-為探針離子，于-0.1～+0.5 V電位范圍內(nèi)，以50 mV/s掃速，測定了裸Au電極、L-Asp/POPD/Au、MIP/Au的CV曲線，如圖2所示。圖2中，L-Asp/POPD/Au(曲線c)幾乎沒有峰電流，表明該印跡膜具有良好的絕緣性，阻礙了[Fe(CN)6]3-探針離子在電極表面的氧化還原反應(yīng)。當(dāng)洗脫L-Asp分子后，MIP/Au的峰電流增加，說明洗脫模板分子后的印跡膜留有孔穴，為探針離子提供了通道。印跡膜的存在一定程度上會阻礙探針離子的傳遞，因此裸Au電極的峰電流最大。

圖1 分子印跡膜的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammogram of molecularly imprinted membrane

圖2 不同修飾膜電極的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of different modified membrane electrode a.bare Au electrode;b.MIP/Au;c.L-Asp/POPD/Au.

圖3 不同電極在鐵氰化鉀溶液中的差分脈沖伏安曲線Fig.3 Pulse voltammetric curves of different electrode in potassium ferricyanide solution 1.NIP/Au；2.MIP/Au of adsorption 10 min；3.MIP/Au of elution 2 min；4.bare Au electrode.

2.2 分子印跡電極和非分子印跡電極的對比

在K3[Fe(CN)6]溶液中，于-0.1～+0.5 V電位范圍內(nèi)，采用差分脈沖伏安(DPV)法(電位增量5 mV/s，振幅50 mV/s，脈沖周期0.2 s，脈沖寬度50 ms)對比MIP/Au和NIP/Au，如圖3所示。曲線4為裸Au電極，其峰電流最大。用洗脫液洗脫NIP/Au 6.0 min，其峰電流幾乎為0(曲線1)，表明探針離子無法到達(dá)電極表面，洗脫不會使印跡膜破壞。曲線3為分子印跡電極洗脫2 min后的DPV曲線。將洗脫后的MIP/Au置于10.0 mg/L的L-Asp溶液中10 min,得到曲線2，峰電流降低、探針離子的傳遞受到了阻礙，表明洗脫后的分子印跡電極上的“孔穴”對L-Asp有選擇性，并且有特定的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 實(shí)驗條件優(yōu)化

2.3.1模板洗脫時間在10 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中，采用DPV法考察模板分子的洗脫程度，結(jié)果表明K3[Fe(CN)6]的峰電流隨洗脫時間的增加而增大。當(dāng)洗脫時間為6.0 min時，峰電流不再變化，表明模板分子L-Asp 已經(jīng)完全洗脫。因此最佳時間為6.0 min。

2.3.2電聚合過程緩沖溶液的pH值PBS的pH對分子印跡膜的形成有重要影響，POPD在酸性條件下容易聚合，而在堿性條件容易遭到破壞[13]。在pH=4.5～6.5的范圍內(nèi)考察了pH的影響，利用不同pH條件下得到的分子印跡電極測相同濃度的L-Asp溶液，在pH=5.4時峰形最佳，因此選擇PBS的pH=5.4。

2.3.3單體與模板用量比單體與模板用量比較小時，不利于單體之間的聚合，過多單體又不利于洗脫，因此考察了L-Asp∶OPD的摩爾比分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶3、2∶1、3∶1、3∶2的情況，結(jié)果表明摩爾比為1∶3時峰形最佳。

2.4 工作曲線、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在最佳實(shí)驗條件下，用循環(huán)伏安法對不同濃度的L-Asp進(jìn)行定量測定，濃度1～50 mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系為：I(μA)=0.1294c-14.294，相關(guān)系數(shù)R2=0.9832，檢出限為0.5 mg/L，如圖4所示。

用MIP/Au電極對20 mg/L的L-Asp標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測定10次，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.4%，說明該修飾電極有較好的重現(xiàn)性。MIP/Au在室溫下于空氣中保存21 d，對20 mg/L的L-Asp標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)電流基本不變，說明該電極具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 分子印跡電極的選擇性試驗

以MIP/Au電極分別在PBS底液、20 mg/L的L-Asp、L-Trp、L-Phe介質(zhì)中，于-0.2～+1.4 V電位范圍以50 mV/s的掃速進(jìn)行CV法掃描，如圖5所示。圖5中，與緩沖溶液峰電流相近的依次是L-Phe、L-Trp、L-Asp。氨基酸的峰電流與緩沖溶液越接近，說明修飾電極對該種氨基酸的響應(yīng)值越差，表明MIP/Au電極對L-Asp具有良好的選擇性。

圖4 MIP/Au對不同濃度L-Asp的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic Voltammograms of MIP/Au electrod in different concentration’s L-Asp concentration of L-Asp：1-6：1，2，5，10，20，50 mg/L L-Asp.

圖5 MIP/Au在不同氨基酸中的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms of MIP/Au electrod in different amino acids solutions 1-4：L-Asp，L-Trp，L-Phe，PBS.

2.6 樣品分析及加標(biāo)回收實(shí)驗

在最佳實(shí)驗條件下，取利君鈣牌天門冬氨酸鈣片搗碎，加熱條件下，用PBS將其充分溶解，然后離心分離，取上清液配制10.0 mg/L的溶液進(jìn)行檢測，并進(jìn)行回收率實(shí)驗，結(jié)果見表1。實(shí)驗結(jié)果表明，該分子印跡電極用于測定L-Asp具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 樣品測定及回收率實(shí)驗

3 結(jié)論

基于鄰苯二胺的電化學(xué)聚合，制備了以鄰苯二胺為功能基體的L-天門冬氨酸分子印跡電極，該電極具有選擇性好、靈敏度高、電化學(xué)穩(wěn)定性好和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),表現(xiàn)出優(yōu)越的電化學(xué)性能。