4-二甲胺偶氮苯磺酰氯柱前衍生高效液相色譜法測定人體尿液中肌氨酸

黃冰蘭， 李喜載， 黃麗英*， 林守二

(1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350004；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002)

目前，前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)的診斷是基于血液中前列腺癌特異抗原(Prostate-specific Antigen,PSA)的水平，但其靈敏度、特異性低，易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。因此，越來越多的學(xué)者開始質(zhì)疑PSA能否作為前列腺癌的標(biāo)志物[1,2]。肌氨酸是甘氨酸的甲基化衍生物，亦稱N-甲基甘氨酸，是肌肉和其他組織自然產(chǎn)生的氨基酸，很少出現(xiàn)在尿液中[3]。2009年，Sreekumar等報道肌氨酸可以作為前列腺癌的標(biāo)志物，它參與了前列腺癌的進展過程，是細胞惡變和轉(zhuǎn)移過程中含量顯著升高的一種代謝物，并且能在尿液中檢測出來。肌氨酸還可能作為前列腺癌治療中的特異性指標(biāo)，能幫助識別侵襲性的腫瘤[4,5]。因此，檢測人體尿液中肌氨酸的含量具有重要的臨床診斷意義和研究價值。

本研究以4-二甲胺偶氮苯磺酰氯(4-Dimethylaminoazobenzene-4′-sulfonyl Chloride,Dabsyl-Cl)作為肌氨酸柱前衍生試劑，并對衍生條件進行了優(yōu)化，利用高效液相色譜(HPLC)法測定尿液中肌氨酸的含量。該方法樣品處理簡單、分析時間短、靈敏度和準(zhǔn)確度高，為臨床診斷前列腺癌提供了一個安全、高效的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1260型自動進樣高效液相色譜儀(美國，安捷倫公司)，附二極管陣列檢測器(DAD)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；SZ-97型自動純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；BS 124S型分析天平(上海奕宇電子科技有限公司)；H1650-W型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；UltraBasic-7型精密pH計(美國，丹佛儀器有限公司)；Anke LXJ-B型自動脫蓋離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

肌氨酸(含量99%)、Na2HPO4·2H2O(色譜純，含量≥99%)、KH2PO4(含量≥99.5%，色譜純)，均購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；4-二甲胺偶氮苯磺酰氯(Dabsyl-Cl，含量>98%，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；Na2CO3、NaHCO3、乙腈(色譜純)，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；除特殊說明外，其他試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm)；流動相組成：9 mmol/L的pH=7.0磷酸鹽緩沖液-乙腈(60∶40,V/V)；流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長465 nm。

1.3 實驗方法

1.3.1肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化取100 μL肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL離心管中，加入100 μL NaCO3-NaHCO3緩沖溶液(pH=9.8)，再加入200 μL衍生試劑Dabsyl-Cl-乙腈(4 mmol/L),用渦旋振蕩器充分混勻2 min后，置于75 ℃恒溫水浴鍋保溫20 min，取出置于冰水浴中15 min終止反應(yīng)，10 000 r/min高速離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，用HPLC法平行測定3次，取峰面積平均值。

1.3.2尿液樣本的預(yù)處理和衍生化取人體尿液1 mL于10 mL具塞離心管中，加入5 mL甲醇超聲振蕩20 min沉淀蛋白，5 000 r/min離心15 min，取上清液100 μL于1.5 mL離心管，其他衍生方法和測定方法與1.3.1相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1衍生試劑的選擇肌氨酸本身無紫外-可見區(qū)吸收和熒光發(fā)射特征，通常需要與衍生試劑反應(yīng)生成具有可見區(qū)吸收的衍生產(chǎn)物，然后用紫外-可見分光光度法或熒光光度法進行檢測。目前報道的用于氨基酸柱前衍生的試劑有異硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、丹酰氯(Dansyl-Cl)、4-二甲胺偶氮苯磺酰氯(Dabsyl-Cl)等。PITC法樣品處理較復(fù)雜，需抽干除去剩余的試劑，且靈敏度較低[6]；FMOC-Cl法要用戊烷提取除去過量溶劑，操作繁瑣[7]；AQC法水解產(chǎn)物會干擾定量[8]；BSTFA法要求高的衍生溫度(100 ℃)和較長的衍生時間[9]；Dansyl-Cl法反應(yīng)活性較差，檢測靈敏度低，衍生產(chǎn)物不太穩(wěn)定[10]。與上述衍生試劑相比，Dabsyl-Cl的磺?；鶊F能與肌氨酸的氨基反應(yīng)生成在可見光區(qū)(λmax=465 nm)有較強吸收的衍生產(chǎn)物，產(chǎn)物在室溫下很穩(wěn)定，能保存一個月。該衍生方法操作簡單、快速、經(jīng)濟，且紫外檢測靈敏度高，檢測限可達到pmol數(shù)量級，因此Dabsyl-Cl是一種優(yōu)良的測定肌氨酸的衍生試劑[11]。本文選擇Dabsyl-Cl作為衍生試劑。

2.1.2衍生反應(yīng)溫度和時間的優(yōu)化根據(jù)文獻報道[12]，Dabsyl-Cl衍生反應(yīng)的溫度從室溫到80 ℃范圍內(nèi)。在室溫條件下，衍生反應(yīng)需要孵育過夜，而隨著衍生溫度的升高，孵育的時間只需15～30 min。De Mey等[13]研究表明，隨著反應(yīng)溫度的進一步升高，衍生產(chǎn)物的量反而減少。因此，在最佳的反應(yīng)溫度下，能獲得最高比例的衍生產(chǎn)物。為此考察了衍生溫度分別為55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃對衍生反應(yīng)的影響，其它實驗條件和方法同1.3.1。結(jié)果如圖1所示，本文選用75 ℃作為衍生反應(yīng)的溫度。同時考察了時間分別為5、10、15、20、25、30 min對衍生反應(yīng)的影響，如圖2所示，當(dāng)反應(yīng)時間為20 min時，衍生產(chǎn)物的量達到最大，再增加反應(yīng)時間，衍生產(chǎn)物的量基本不再改變，趨于穩(wěn)定。因此，本實驗選擇衍生時間為20 min。

2.1.3衍生反應(yīng)pH的優(yōu)化Dabsyl-Cl衍生反應(yīng)需要在堿性條件中進行[14]。分別考察了pH為7.0、8.0、9.0、9.4、9.8、10.2、10.6、11.0、12.0對衍生反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)體系的pH為9.8時反應(yīng)最佳。這與Jansen等[14]報道對于一級、二級氨基酸的衍生反應(yīng)的最佳pH在8.5～9.0范圍內(nèi)，以及Maseda等[15]報道四氫大麻酚和大麻二酚最佳反應(yīng)pH為10.5相類似。

2.1.4衍生試劑與肌氨酸比例的優(yōu)化Dabsyl-Cl的用量對衍生反應(yīng)的衍生率有較大的影響[16]。用量太少，衍生反應(yīng)不能反應(yīng)完全，衍生試劑過多，不僅造成浪費，而且會產(chǎn)生雜質(zhì)峰干擾被測物質(zhì)。本文考察了Dabsyl-Cl與肌氨酸濃度比分別為1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1對衍生結(jié)果的影響。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)Dabsyl-Cl與肌氨酸的比例為4∶1時，衍生產(chǎn)物峰面積達到最大值。繼續(xù)增加衍生試劑的量時，衍生產(chǎn)物峰面積基本沒有變化，趨于平穩(wěn)。因此，選擇Dabsyl-Cl與肌氨酸的最佳比例為4∶1。

圖1 衍生反應(yīng)溫度對衍生反應(yīng)的影響Fig.1 Effects of reaction temperature on derivative reaction

圖2 衍生反應(yīng)時間對衍生反應(yīng)的影響Fig.2 Effects of reaction time on derivative reaction

圖3 衍生反應(yīng)pH值對衍生反應(yīng)的影響Fig.3 Effects of reaction pH on derivative reaction

圖4 衍生試劑用量對衍生反應(yīng)的影響Fig.4 Effects of Dabsyl-Cl amount on derivative reaction

2.2 對照品溶液和尿液樣品的HPLC分析

在最佳衍生條件下進行色譜分析，得到肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和人尿液衍生后的色譜圖，見圖5。衍生試劑和肌氨酸衍生物的保留時間分別為4.3 min、5.6 min，根據(jù)保留時間判斷， 2號色譜峰初步判斷為肌氨酸。圖6分別顯示了對標(biāo)準(zhǔn)品和尿液樣品保留時間為5.6 min的色譜峰進行DAD檢測后得到的光譜圖， UV光譜圖形狀相似，出現(xiàn)2個峰，峰位置分別為278 nm和465 nm。根據(jù)光譜圖的形狀和吸收峰的位置，進一步確定樣品中2號色譜峰為肌氨酸。

圖5 肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和尿液的色譜圖Fig.5 Chromatograms of standard sarcosine and urine derivative with Dabsyl-Cl

圖6 肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和尿液樣品2號色譜峰的紫外吸收光譜Fig.6 UV absorption spectra of derivatives of sarcosine standard and human urine sample

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍、檢測限和定量限配制系列肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進行衍生及色譜分析，平行測定3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，肌氨酸在0.002～4.00 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，峰面積(A)與濃度(c)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：A=4551.90c+17.47，相關(guān)系數(shù)為0.9998。檢測限(S/N=3)為0.70 nmol/L，定量限(S/N=10)為2.33 nmol/L。

2.3.2方法的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性取已知肌氨酸濃度的尿液樣品，分別加入高、中、低三個水平的肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加濃度分別作三次平行實驗，考察方法的準(zhǔn)確度。本方法測定的加標(biāo)回收率在95.69%～107.79%之間，表明本方法有較好的準(zhǔn)確度(表1)。同時考察了方法的精密度和穩(wěn)定性，相對標(biāo)準(zhǔn)偏(RSD)差分別為0.33%、4.80%。表明本方法有較好的重復(fù)性。

表1 尿液中肌氨酸的回收率(n=3)

2.3.3實際樣品測定疾病組尿液樣本來自于2014年7月至8月就診于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院、福建省立醫(yī)院的10名前列腺癌患者的晨尿。健康對照組尿液樣本來自于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康體檢中心體檢正常的10名男性的晨尿。使用所建立的方法對收集到尿液樣本進行檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，前列腺癌患者尿液中肌氨酸含量明顯高于健康男性。

表2 前列腺癌患者與健康男性尿液中肌氨酸的含量的分析結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

肌氨酸作為前列腺癌潛在的標(biāo)志物，在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演著非常重要的角色。目前相比于腫瘤基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，腫瘤代謝組學(xué)的研究還較少，重視腫瘤代謝組學(xué)有助于更好地發(fā)現(xiàn)腫瘤新的診斷和治療方法。本文建立了以4-二甲胺偶氮苯磺酰氯為柱前衍生試劑，用高效液相色譜法測定人體尿液中肌氨酸含量的方法。通過研究影響衍生反應(yīng)的4個重要因素，確立了最佳反應(yīng)條件。該方法為未來前列腺癌的研究提供新的思路，并有望應(yīng)用到前列腺癌標(biāo)志物肌氨酸的簡單、靈敏快速檢測，為前列腺癌的診斷和治療，提供無創(chuàng)檢測新方法，同時能為其它Dabsyl-Cl衍生反應(yīng)提供參考。