一種兩親性纖維素衍生物應(yīng)用于毛細(xì)管電泳分離的研究

周海龍， 黃迪惠， 周 平*

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

高分子聚合物在毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù)中發(fā)揮著重要作用，例如在毛細(xì)管凝膠電泳及無膠篩分毛細(xì)管電泳中以其作為篩分介質(zhì)，而在毛細(xì)管電色譜中則可用作固定相。另外，高分子聚合物常用于毛細(xì)管的共價(jià)、動(dòng)態(tài)或靜態(tài)涂層。兩親性高分子聚合物的鏈中同時(shí)含有親水和疏水兩種基團(tuán)，有些可表現(xiàn)出自組裝性能，在醫(yī)藥、水處理、化妝品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[1 - 4]。兩親性高分子聚合物因其在溶液中的獨(dú)特性質(zhì)也可用于CE分離，如Nakamura等利用聚(N-乙酰亞胺基)乙烯-聚(N-戊醇亞胺基)乙烯兩親性兩嵌段共聚物分離酚類化合物[5]，Li等以丙烯酰胺和硅烷制備了兩親性聚合物用于DNA片段的分離[6]，Hwang等將聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯兩親性三嵌段共聚物用于DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析[7]。

天然高分子化合物如纖維素、殼聚糖等通常具有生物相容性、生物可降解性、無毒、可再生和來源豐富等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此，基于天然高分子化合物制備兩親性聚合物及其自組裝納米膠束用作藥物載體的研究近年來備受關(guān)注[8]。本研究對(duì)纖維素進(jìn)行季銨化以及十二烷基化疏水改性，制備出新的兩親性纖維素衍生物，研究了其作為背景電解質(zhì)添加物對(duì)不同荷電性質(zhì)化合物的CE分離效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀(美國,貝克曼公司)，配備二極管陣列檢測(cè)器(DAD)；Mercury VX-300核磁共振儀(美國，瓦里安公司)；Vario EL Ⅲ元素分析儀(德國，艾力蒙塔公司)；F-4600熒光光度計(jì)(日本，日立公司)。

纖維素(棉短絨漿)由湖北化纖集團(tuán)有限公司(湖北襄樊)提供，通過粘度法測(cè)得其粘均分子量(Mη)為11.2×104g/mol。3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(CHPTAC，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司)；溴代十二烷、苯乙酮、水楊酸、p-氨基苯磺酸、p-硝基苯甲酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；苯丙酮、苯戊酮、磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺吡啶、乙酰水楊酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；苯丁酮(上海安耐吉化學(xué)有限公司)；苯己酮(日本TCI公司)。磷酸鹽緩沖溶液：分別配制25 mmol·L-1Na2HPO4和25 mmol·L-1NaH2PO4溶液，將二者按一定比例混合得到pH=7.0和pH=8.0的緩沖溶液。檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液：分別配制100 mmol·L-1檸檬酸溶液和200 mmol·L-1Na2HPO4溶液，然后將Na2HPO4溶液逐滴加入到100 mmol·L-1的檸檬酸溶液中，調(diào)至pH=3.0。不同pH的磷酸鹽緩沖溶液：分別配制15 mmol·L-1的H3PO4和Na2HPO4溶液，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，用NaCl調(diào)節(jié)各溶液離子強(qiáng)度為72 mmol·L-1。所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1十二烷基疏水改性季銨化纖維素的合成季銨化纖維素(QC)的合成參照文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行：將一定量的CHPTAC(CHPTAC與脫水葡萄糖基摩爾比為9∶1)逐滴加入到纖維素-NaOH/尿素水溶液中，攪拌反應(yīng)一定時(shí)間后，用HCl中和反應(yīng)液，反應(yīng)液用蒸餾水透析7 d后，冷凍干燥得到QC。十二烷基疏水改性季銨化纖維素(Dodecyl Modified Quaternized Cellulose,DMQC)通過對(duì)QC進(jìn)一步修飾獲得：將一定量的溴代十二烷逐滴加入到含1.0wt%QC 的NaOH溶液中，在溫度70 ℃ 條件下攪拌反應(yīng)6 h，用HCl中和反應(yīng)液，加入乙醇使DMQC沉淀，并用乙醇洗滌，冷凍干燥得到DMQC。

1.2.2臨界膠束濃度測(cè)定配制6.0×10-6mol·L-1芘的丙酮溶液，取該溶液0.5 mL置于離心管中，待丙酮完全揮發(fā)后，將5 mL不同濃度的DMQC水溶液加入上述含芘的離心管中。將這些溶液在室溫下平衡24 h后，使用熒光光度計(jì)測(cè)量熒光光譜(激發(fā)波長為337 nm)，以芘發(fā)射光譜中384 nm處的峰強(qiáng)度對(duì)DMQC的濃度作圖。臨界膠束濃度(CMC值)定義為熒光強(qiáng)度發(fā)生突變時(shí)所對(duì)應(yīng)的的聚合物濃度。

1.2.3電滲流測(cè)定熔融石英毛細(xì)管(河北永年光纖廠)內(nèi)徑75 μm，外徑365 μm，總長度為40 cm(有效長度30 cm)。測(cè)定電滲流(EOF)時(shí)，使用含DMQC的背景電解質(zhì)沖洗毛細(xì)管5 min，然后在+12 kV或者-12 kV電壓下預(yù)電泳5 min，將0.1 mg·mL-1的硫脲溶液在0.5 psi壓力下進(jìn)樣3 s，在 +12 kV或者-12 kV電壓下進(jìn)行分離，柱溫25 ℃。

1.2.4電泳分離條件電泳分離時(shí)所用毛細(xì)管及進(jìn)樣條件與測(cè)定電滲流時(shí)相同，電壓為-12 kV。針對(duì)不同分離對(duì)象時(shí)采用不同的緩沖溶液及DMQC濃度。每次電泳分離后，毛細(xì)管分別用1.0 mol/L NaOH溶液及去離子水在20 psi壓力下沖洗5 min,然后用背景電解質(zhì)溶液平衡3 min。除特別說明外，檢測(cè)波長為210 nm，柱溫為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

圖1 季銨化纖維素及十二烷基修飾季銨纖維素的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectra of QC and DMQC samples in D2O

2.1 DMQC的合成和表征

十二烷基改性季銨化纖維素的合成主要包括兩個(gè)步驟：首先，CHPTAC在堿性條件下與纖維素分子鏈中脫水葡萄糖基上的羥基反應(yīng)，生成季銨化纖維素；然后，溴代十二烷與脫水葡萄糖基中殘留羥基反應(yīng)，在纖維素長鏈上引入十二烷基得到DMQC。依據(jù)QC和DMQC的氮含量可以計(jì)算季銨基團(tuán)的取代度：DSQ=(162×NQC%)/(14-151.5×NQC%)[9,10]；十二烷基取代度：DSD=(14×DSQ÷NDMQC%-218.1)/169.3。所制備季銨化纖維素的季銨基團(tuán)取代度為0.37，DMQC的疏水取代度為0.62。

圖2 十二烷基修飾季銨纖維素的臨界膠束濃度Fig.2 Critical micelle concentration (CMC) value of DMQC in H2O at 25 ℃

圖1是QC和DMQC的1H NMR譜圖。譜圖中4.77 ppm的寬峰是D2O的共振信號(hào)峰，季銨基團(tuán)中的甲基質(zhì)子((CH3)3N+)的化學(xué)位移在3.16 ppm，其它質(zhì)子的共振信號(hào)峰位于3.27～4.36 ppm之間，與脫水葡萄糖基的質(zhì)子信號(hào)峰重疊。在DMQC的1H NMR圖譜中，可觀察到十二烷基(-O-CH2-(CH2)10-CH3)中十個(gè)亞甲基質(zhì)子的化學(xué)位移在1.24 ppm處，烷烴鏈上甲基質(zhì)子化學(xué)位移在0.84 ppm處。烷烴鏈中與纖維素相連的亞甲基質(zhì)子(-O-CH2-(CH2)10-CH3)的共振信號(hào)與脫水葡萄糖基的質(zhì)子信號(hào)峰重疊。

DMQC是含有親水及疏水基團(tuán)的兩親性分子。在水溶液中，部分兩親性聚合物能通過自組裝形成以疏水基團(tuán)為核，親水鏈在外的球形核-殼膠束結(jié)構(gòu)[11]。與傳統(tǒng)表面活性劑類似，兩親性聚合物只有在濃度超過其CMC值時(shí)才會(huì)自組裝形成膠束結(jié)構(gòu)，當(dāng)膠束濃度低于其臨界膠束濃度時(shí)，聚合物以自由分子鏈的形式存在于水溶液中，因此CMC是兩親性聚合物表征的一個(gè)重要參數(shù)[12]。經(jīng)檢測(cè)，DMQC的CMC值約為1 000 μg·mL-1(圖2)。

2.2 電滲流

DMQC分子中含有季銨基團(tuán)可與毛細(xì)管內(nèi)壁產(chǎn)生靜電相互作用，改變毛細(xì)管內(nèi)壁的表面電荷性質(zhì)，從而引起EOF發(fā)生改變。纖維素分子鏈上疏水基團(tuán)的引入會(huì)改變其吸附性能，進(jìn)一步影響EOF。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了在背景電解質(zhì)中添加0～1 000 μg·mL-1的DMQC后所產(chǎn)生的EOF，結(jié)果如圖3所示。由圖3a可以看出，隨著DMQC濃度的增大，陰極電滲流(正向電滲流)被抑制，電滲淌度急劇下降。當(dāng)其濃度約為3 μg·mL-1時(shí)，EOF發(fā)生反向，成為陽極電滲流(反向電滲流)。隨著DMQC濃度的增大，陽極電滲流逐漸增大，當(dāng)濃度達(dá)到200 μg·mL-1時(shí)，陽極電滲流趨于穩(wěn)定。將DMQC濃度固定為300 μg·mL-1，考察了背景電解質(zhì)pH值對(duì)EOF的影響，結(jié)果如圖3b，在pH=3.0～12.0范圍內(nèi)，均能產(chǎn)生陽極EOF。由于纖維素衍生物具有較好的酸堿穩(wěn)定性，并且季銨基團(tuán)帶有正電荷，所以DMQC添加在背景電解質(zhì)中能在一個(gè)較寬的pH范圍內(nèi)提供陽極EOF，有利于應(yīng)用于不同對(duì)象的分離。

圖3 DMQC濃度(a)及背景電解質(zhì)pH(b)對(duì)電滲流的影響Fig.3 Effect of concentration of DMQC(a) and pH(b) on the EOF conditions:phosphate buffer,25 mmol·L-1 at pH=7.0 for(a) or 15 mmol·L-1 at pH=3.0-12.0 with constant ionic strength for(b);DMQC concentration for(b),200 μg·mL-1.each EOF value was from three measurements.

2.3 DMQC在CE中的應(yīng)用

圖4 DMQC用于芳香酸的分離Fig.4 The separation of aromatic acids using DMQC added in the background electrolyte 100 mmol·L-1 phosphate-citrate buffer，pH=3.0;DMQC concentration:200 μg·mL-1.peak identification:(1)salicylic acid(pKa=2.97),(2)p-aminobenzosulfonic acid(pKa=3.24),(3)p-nitrobenzoic acid(pKa=3.44),and(4)acetylsalicylic acid(pKa=3.4).

2.3.1分離芳香酸類物質(zhì)采用裸露毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離具有較低pKa值的芳香酸類化合物往往較為困難，因?yàn)樵诘蚿H條件下毛細(xì)管的電滲流淌度很小，而在高pH條件下又不能利用分析對(duì)象pKa值的差異。以水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、對(duì)硝基苯甲酸和乙酰水楊酸(pKa值分別為2.98、3.24、3.44、3.4)為例，在裸露毛細(xì)管中進(jìn)行分離時(shí)，1 h未出峰。在背景電解質(zhì)中添加DMQC后，四種芳香酸在8 min以內(nèi)就實(shí)現(xiàn)了基線分離，見圖4。根據(jù)被分析物pKa值推測(cè)在pH=3.0時(shí)出峰順序依次應(yīng)該為水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、乙酰水楊酸和對(duì)硝基苯甲酸。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)硝基苯甲酸和乙酰水楊酸的出峰次序與預(yù)計(jì)的相反，可能源于DMQC與乙酰水楊酸之間的疏水相互作用。

2.3.2分離磺胺類藥物Ng等[13,14]首次采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳研究了磺胺類藥物的分離，在研究中發(fā)現(xiàn)很難僅靠調(diào)節(jié)pH值實(shí)現(xiàn)磺胺類藥物的有效分離，而通過在緩沖溶液中添加β-CD，利用β-CD與苯胺基的作用可實(shí)現(xiàn)對(duì)磺胺類物質(zhì)的分離。也有報(bào)道在pH=2.1的極端條件可對(duì)磺胺類物質(zhì)實(shí)現(xiàn)電泳分離，此時(shí)磺胺類物質(zhì)均帶正電荷，但分離所需時(shí)間長[15]。圖5是采用DMQC作為背景電解質(zhì)添加物分離磺胺類藥物的電泳圖，在pH=7.5條件下，6種磺胺類藥物10 min以內(nèi)得到分離。

2.3.3分離中性物質(zhì)DMQC分子中含有疏水基團(tuán)，可能與分析對(duì)象發(fā)生相互作用，為此考察了其對(duì)中性分子的分離效果。以烷基苯酮同系物苯乙酮、苯丙酮、苯丁酮、苯戊酮和苯己酮為分離對(duì)象，丙酮作為參照物進(jìn)行電泳分離，其結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯?，丙酮、苯乙酮、苯丙酮共遷移，但是隨著烷基鏈長的增加，分析對(duì)象疏水性進(jìn)一步增強(qiáng)，苯丁酮、苯戊酮以及苯己酮的遷移時(shí)間逐漸變長。增加DMQC的濃度至其CMC值以上，分離效果沒有改善。盡管對(duì)這些中性分子只是實(shí)現(xiàn)了有限分離，但證明了添加DMQC除了改變電滲流的大小和方向外，還可以發(fā)揮類似膠束電動(dòng)色譜中膠束的作用，可以用于一些中性物質(zhì)的電泳分離。

圖5 DMQC用于磺胺類藥物的分離Fig.5 The separation of sulfa drugs using DMQC added in the background electrolyte 25 mmol·L-1 phosphate buffer,pH=7.5;DMQC concentration:200 μg·mL-1.peak identification:(1)sulfamethoxazole(pKa=5.6),(2)sulfadiazine(pKa=6.5),(3)sulfamerazine(pKa=7.1),(4)sulfamethazine(pKa=7.4),(5)sulfapyridine(pKa=8.4),and(6)sulfanilamide,pKa=10.4).

圖6 DMQC用于中性化合物的分離Fig.6 The separation of neutral compounds 25 mmol·L-1 phosphate buffer,pH=7.0;DMQC concentration:500 μg·mL-1.peak identification:t0 acetone,(1)acetophenone,(2)propiophenone,(3)butyrophenone,(4)valerophenone,and(5)hexanophenone.

3 結(jié)論

本文合成了新型纖維素衍生物十二烷基疏水改性季銨化纖維素，將其用作毛細(xì)管電泳背景電解質(zhì)的添加物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以在較寬的pH范圍(pH=3.0～12.0)內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的陽極電滲流，可以應(yīng)用于芳香酸和磺胺類藥物的快速分離，對(duì)中性化合物烷基苯同系物也有一定的分離作用。十二烷基疏水改性季銨化纖維素的加入不但可以調(diào)節(jié)電滲流的大小和方向，而且可以和分離對(duì)象發(fā)生疏水相互作用，用于不同荷電性質(zhì)化合物的毛細(xì)管電泳分離。