3D紙基微流控分析器件測定藥物中抗壞血酸的研究

玄翠娟， 王 榮， 閆宏濤

(西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710127)

抗壞血酸(AA)是一種重要的生物分子[1]，它參與眾多生命過程，在人體中起著重要的作用，如膠原蛋白的形成、離子吸收、神經(jīng)傳遞和免疫反應(yīng)及抗氧化作用等[2]。在臨床中，AA已用于普通感冒、精神疾病、不孕不育等疾病的預(yù)防和治療[3]。在食品加工行業(yè)，AA作為抗氧化劑和必要的添加劑，廣泛應(yīng)用于食品和飲料中[4]。然而，AA的過量攝取會導(dǎo)致腹瀉、胃酸過多和腎臟結(jié)石，而飲食中AA的缺乏亦會導(dǎo)致壞血病[5]。因此，研究并建立一種簡單快速、現(xiàn)場實(shí)時(shí)測定AA的分析方法具有十分重要的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。

目前，AA的測定方法已報(bào)道的有分光光度法[6]、高效液相色譜法[7]、電化學(xué)法[8]和熒光法[9]等。但這些方法均需要特定儀器，難以進(jìn)行現(xiàn)場測定，尤其在偏遠(yuǎn)地區(qū)以及家庭衛(wèi)生保健等的應(yīng)用中有一定的局限性[5]。紙基微流控分析(μPADs)具有制作簡單，成本低，易于儲存和運(yùn)輸，使用方便等優(yōu)點(diǎn)，自2007年Martinez等[10]首次提出以來，引起了人們的極大關(guān)注[11]。已有許多μPADs的制作方法和測定方法的研究報(bào)道[12,13]，但鮮有對于μPADs分析過程中反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行控制的報(bào)道。

本文報(bào)道了一種可手動折疊的新型3D紙基微流控分析器件。采用不同的方法固化試劑于器件測定濾紙?；谡郫B器件濾紙以控制各步反應(yīng)時(shí)間，避免了試劑間的交叉影響。該紙基微流控分析器件具有制作簡單、靈敏，成本低廉，操作方便，適用于現(xiàn)場實(shí)時(shí)測定等特點(diǎn)。建立的方法應(yīng)用于藥物中AA的測定，獲得滿意結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；SONY DSC-W100數(shù)碼相機(jī)；V350型掃描儀(愛普生中國(上海)有限公司)。濾紙(Φ=9 cm，杭州新華雙圈定性濾紙)。

AA標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.005 mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.0440 g AA(天津登峰化學(xué)試劑廠)，溶解后定容于50 mL棕色容量瓶中，使用時(shí)，稀釋該標(biāo)準(zhǔn)溶液于一定濃度。Fe3+溶液(0.02 mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.5091 g Fe2(SO4)3(天津耀華化工廠)，以適量H2SO4和水溶解，定容于100 mL容量瓶中。1,10-菲羅啉溶液(Phen，0.05 mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.9911 g 1,10-菲羅啉(上海山浦化工有限公司)，溶解并定容于100 mL容量瓶中。NaF溶液(0.2 mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.84 g NaF，溶解后定容于100 mL容量瓶中。HAc-NaAc緩沖溶液(pH=5.0)：采用0.1 mol/L HAc和0.1 mol/L NaAc溶液配制，酸度計(jì)校正pH。正硅酸乙酯(天津科密歐化學(xué)試劑公司)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。水為二次蒸餾水。

1.2 溶膠-凝膠溶液的合成

分別移取2 mL正硅酸乙酯和2.5 mL無水乙醇于燒杯中，混合均勻，緩慢加入3%的Triton X-100溶液1 mL，充分?jǐn)嚢瑁辉偌尤? mL 0.1 mol/L HCl，連續(xù)攪拌直至形成澄清的溶液，室溫靜置2～3 h。將該溶膠-凝膠溶液密封保存于4 ℃冰箱中，備用[14]。

1.3 紙基微流控器件的制備及測定

3D紙基微流控器件制備及其實(shí)物照片分別如圖1A、1B所示。圖1A中所示a、b、c、d濾紙片上(8×8 mm)分別固定有Fe3+溶液、NaF溶液、HAc-NaAc緩沖溶液和1,10-菲羅啉溶液。具體步驟如下：分別準(zhǔn)確移取1.429 mL 1,10-菲羅啉溶液和0.571 mL溶膠-凝膠溶液，配制1,10-菲羅啉/溶膠-凝膠混合溶液(體積比5∶2)。接著，裁取如圖1A所示形狀的濾紙(8×8 mm)、疏水紙和基體紙片。分別移取25 μL Fe3+溶液、NaF溶液、HAc-NaAc緩沖溶液，以及25 μL 1,10-菲羅啉/溶膠-凝膠混合液滴加于a、b、c、d濾紙片上，待陰干后，按照圖中所示順序分別粘貼固定有Fe3+溶液、NaF溶液、HAc-NaAc緩沖溶液和1,10-菲羅啉/溶膠-凝膠混合液的濾紙于折疊的疏水基體紙片上，制備成3D紙基微流控分析器件。為了攜帶方便，并目視該器件測定過程顯色變化，器件整體固定于一透明玻璃盒內(nèi)(圖1A)。

圖1 3D -μPAD制作過程示意圖(A)和整個(gè)器件的照片圖(B)Fig.1 Schematic of preparation procedure of 3D-μPAD(A) and photograph of the entire device(B)

圖2 AA的測定步驟示意圖Fig.2 Diagram of the assay procedure for determination of AA

該紙基微流控分析器件測定過程如圖2所示。采用注射器滴加一定量的AA標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品于固定有Fe3+的濾紙片上，反應(yīng)2 min后，再按照圖2所示順序依次折疊已固定有NaF溶液、HAc-NaAc緩沖溶液和1,10-菲羅啉/溶膠-凝膠混合溶液的a、b、c、d濾紙，20 min后(可目視顯色的變化)，以數(shù)碼相機(jī)拍照，并用Adobe Photoshop圖像處理軟件處理顏色信號，計(jì)算灰度值(Gray)。為了避免外界光照等環(huán)境因素對器件的影響，該器件置于黑色塑料袋中，于4 ℃密閉避光條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 測定原理

實(shí)驗(yàn)中，采用該3D紙基微流控分析器件進(jìn)行AA測定，是基于如下氧化還原和配位反應(yīng)：

(1) AA將Fe3+還原為Fe2+，即：

其中，H2A是AA的還原形式，DA為AA的氧化形式。

(2) 生成的Fe2+與1,10-菲羅啉(Phen)發(fā)生配位反應(yīng)得到橙紅色配合物

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.1.1Fe3+濃度的選擇實(shí)驗(yàn)考察了Fe3+濃度對測定的影響，結(jié)果如圖3所示。表明隨著Fe3+濃度的增大，體系灰度值(Gray)隨之增大。在Fe3+濃度為0.015 mol/L時(shí)，體系灰度值基本保持不變。Fe3+濃度太低時(shí)，AA不能被完全氧化，但Fe3+濃度過大時(shí)，過量的Fe3+自身顏色會干擾體系顯色測定。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇該測定體系Fe3+濃度為0.015 mol/L。

3.1.2NaF濃度的選擇實(shí)驗(yàn)中加入的NaF溶液以掩蔽反應(yīng)過量的Fe3+?？疾炝薔aF濃度對于測定的影響，結(jié)果表明NaF在0.05～0.3 mol/L濃度范圍內(nèi)，隨著NaF濃度逐漸增大，灰度值緩慢降低，濃度為0.2 mol/L時(shí)逐漸趨于穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中選擇加入0.2 mol/L NaF進(jìn)行測定。

3.1.31,10-菲羅啉與溶膠-凝膠溶液濃度比溶膠-凝膠法制備材料具有許多優(yōu)良的特性，如化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、化學(xué)惰性、高純度和均勻性；在紫外到紅外較寬的波長范圍內(nèi)具有較高的透明度；在水溶液或無水溶液中幾乎不發(fā)生溶脹[15，16]。通過控制操作過程可以在溶膠-凝膠無機(jī)基體中包埋許多有機(jī)、金屬有機(jī)和生物分子。實(shí)驗(yàn)比較了1,10-菲羅啉溶液及其溶膠-凝膠混合溶液對器件測定的影響，結(jié)果表明在相同1,10-菲羅啉濃度，兩種溶液的測定結(jié)果基本一致。但比較而言，采用1，10-菲羅啉/溶膠-凝膠混合溶液固定于測定器件具有較好的穩(wěn)定性。因此，實(shí)驗(yàn)選擇溶膠-凝膠方法固定1,10-菲羅啉，并探討了1，10-菲羅啉和溶膠-凝膠的濃度比對測定的影響，結(jié)果如圖4所示。表明隨著1,10-菲羅啉和溶膠-凝膠的體積比(0.5～4范圍內(nèi))逐漸增大，測定體系的灰度值先增大然后略有降低。這可能是由于1,10-菲羅啉和溶膠-凝膠體積比小時(shí)，即較小濃度的1，10-菲羅啉不能與反應(yīng)生成的Fe2+完全反應(yīng)；而當(dāng)兩者體積混合比較大時(shí)，過量的1，10-菲羅啉不能很好地混合包埋，對于測定有一定的影響。實(shí)驗(yàn)選擇1,10-菲羅啉和溶膠凝膠的體積比值為2.5。

圖3 Fe3+的濃度對AA測定的影響Fig.3 Effects of the concentration of Fe3+ on the detection of AA

圖4 1,10-菲羅啉和溶膠-凝膠體積比對AA測定的影響Fig.4 Effects of the volume ratio of 1,10-phenanthroline to sol-gel on the detection of AA

3.1.4樣品的加入量實(shí)驗(yàn)考察了樣品加入體積對測定的影響。結(jié)果表明，灰度值隨著樣品加入體積的增大而增大，90 μL后灰度值基本不變。樣品加入體積較小時(shí)，溶液不能完全潤濕并與濾紙固化試劑反應(yīng)(固定1，10-菲羅啉的濾紙上僅有少量試劑與所生成的Fe2+反應(yīng))，灰度值較??；而加入樣品體積太大，超出濾紙承載量，不利于測定。因此，選擇加入90 μL的樣品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.1.5反應(yīng)時(shí)間的影響如上所述，該測定體系反應(yīng)原理是AA先將Fe3+還原為Fe2+，然后生成的Fe2+與1，10-菲羅啉發(fā)生配合反應(yīng)得到橙紅色配合物。實(shí)驗(yàn)分別考察了Fe3+與AA，以及生成物Fe2+與1,10-菲羅啉反應(yīng)時(shí)間對測定的影響，結(jié)果如圖5所示。對于Fe3+與AA反應(yīng)，灰度值隨著反應(yīng)時(shí)間的增大而逐漸增大，2 min后基本趨于穩(wěn)定。反應(yīng)時(shí)間較短，AA不能被Fe3+完全氧化，灰度值較??；反應(yīng)時(shí)間太長，不利于快速測定。而對于生成物Fe2+與1,10-菲羅啉反應(yīng)時(shí)間對測定的影響而言，室溫下分別對100和300 μmol/L AA進(jìn)行了測定，灰度值變化趨勢完全一致。隨著反應(yīng)時(shí)間的增大灰度值急劇增大，在20 min后基本穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Fe3+與AA和生成物Fe2+與1,10-菲羅啉在室溫下反應(yīng)時(shí)間分別為2 min和20 min。

圖5 Fe3+與AA(A)和Fe2+與1,10-菲羅啉(B)反應(yīng)時(shí)間的影響Fig.5 Effects of reaction time between Fe3+ and AA(A),and Fe2+ and 1,10-phenanthroline(B)

圖6 分析器件的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of analytical device A.indoor environment;B.sealed in black plastic bag with desiccant at 4 ℃

3.2 器件的穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3D紙基微流控分析器件的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。分別在室內(nèi)自然環(huán)境和避光密閉環(huán)境保存下，對制備的紙基微流控器件進(jìn)行連續(xù)15 d測定，其灰度值的變化如圖6所示。表明在室內(nèi)保存時(shí)，可能是由于固定于濾紙上的Fe3+在空氣中易被還原所致，體系的灰度值呈明顯上升趨勢。而保存于4 ℃避光密閉環(huán)境中，測定體系的灰度值基本保持不變。結(jié)果表明該紙基微流控器件密閉保存于避光環(huán)境，器件穩(wěn)定性良好。

3.3 工作曲線及檢出限

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測定了一系列AA標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制校正曲線。結(jié)果表明，在7～550 μmol/L濃度范圍內(nèi)，測定的灰度值(y)與AA的濃度(x)呈線性關(guān)系。線性回歸方程為：y=0.0493x+25.104，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9942，檢出限(3σ/k)為6.1 μmol/L(n=10)。實(shí)驗(yàn)對250 μmol/L的AA標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定10次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%。

3.4 干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了維生素C藥品中常見輔助劑淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、β-環(huán)糊精等對AA測定的影響。結(jié)果表明，對于200 μmol/L AA的測定，在誤差不超過±5%時(shí)，25倍的淀粉、糊精、蔗糖、甘油，20倍的葡萄糖，5倍的β-環(huán)糊精，2倍的酒石酸和酒石酸鉀鈉，均不干擾測定。而實(shí)際藥品中這些物質(zhì)的含量均小于此，因此不會影響AA的測定。

3.5 樣品的測定

取10片維生素C片，計(jì)算得到維生素C片的平均質(zhì)量。將藥片研磨并混合均勻，準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于0.5片維生素C片質(zhì)量的粉末，溶于約40 mL二次蒸餾水中，離心過濾，濾液轉(zhuǎn)移于50 mL容量瓶中定容，備用。分別采用分光光度法和制備的3D紙基微流控分析器件對上述預(yù)處理樣品中AA的含量進(jìn)行測定，并進(jìn)行加入回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。表明3D紙基微流控分析器件測定結(jié)果與分光光度法基本一致。所建立的3D紙基微流控分析器件測定方法適用于樣品中AA含量的測定。

表1 維生素C藥品中AA的測定

aMean±SD(n=3).

4 結(jié)論

本文提出了一種可手動折疊的新型3D紙基微流控分析器件。該微流控分析裝置采用不同的方法固定測定試劑于器件a、b、c濾紙，從而避免了試劑間的交叉影響。測定中通過手動分別折疊，控制了各步反應(yīng)時(shí)間。應(yīng)用于藥物中AA的測定，獲得滿意結(jié)果。該方法簡單、快速、攜帶方便、成本低廉，適用于藥物及其它樣品中AA的現(xiàn)場實(shí)時(shí)測定。而且可基于該紙基微流控分析器件制備方法及具體測定要求，設(shè)計(jì)不同形狀的紙基微流控分析器件。