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    CALR基因突變?cè)诠撬柙鲋承阅[瘤中的臨床研究

    2015-10-16 20:00:48王彥麗戚光祖等
    關(guān)鍵詞:突變

    王彥麗 戚光祖等

    [摘要] 目的 探討經(jīng)典的斷裂點(diǎn)簇集區(qū)/Abelson白血病病毒(BCR/ABL)融合基因陰性骨髓增殖性腫(MPN)患者中鈣網(wǎng)蛋白(CALR)基因突變的發(fā)生率,分析CALR基因突變陽(yáng)性MPN的臨床特點(diǎn)。 方法 依據(jù)2008年WHO造血組織和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)2012年1月~2015年3月在臨沂市沂水中心醫(yī)院就診的72例臨床初診為“MPN”患者進(jìn)行診斷時(shí)采用直接測(cè)序法檢測(cè)CALR基因突變,采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(AS-PCR)檢測(cè)JAK2V617F突變。分析CALR基因突變陽(yáng)性MPN的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)。 結(jié)果 在22例真性紅細(xì)胞增多癥(PV)患者中16例攜帶有JAK2V617F突變(突變率為68%),未檢測(cè)出CALR基因突變;26例原發(fā)性血小板增多癥(ET)患者中12例攜帶有JAK2V617F突變(突變率為46%),8例檢測(cè)出CALR基因突變(突變率為31%),JAK2V617F突變陰性患者中CALR基因突變率為57%(8/14);23例原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者中11例攜帶有JAK2V617F基因突變(突變率為49%),8例檢測(cè)出CALR基因突變(突變率為35%),JAK2V617突變陰性患者中CALR基因突變?yōu)闉?7%(8/12)。72例患者中均未檢測(cè)到MPL515突變。 結(jié)論 CALR基因突變是JAK2V617突變陰性的MPN特異性分子標(biāo)志物。將CALR基因突變檢測(cè)納入MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)可以提高診斷的準(zhǔn)確性減少漏診率。

    [關(guān)鍵詞] 骨髓增殖性腫瘤; CALR基因;JAK2基因;突變

    [中圖分類號(hào)] R551.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2015)09(b)-0086-04

    BCR/ABL1融合基因陰性的骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative meoplasm,MPN)是一組起源于多能造血干細(xì)胞的惡性腫瘤,表現(xiàn)為骨髓細(xì)胞一系或多系過(guò)度增殖,包括真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia,PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocthemia,ET)、原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis,PMF),臨床上有發(fā)生動(dòng)靜脈血栓、髓外造血、骨髓纖維化、甚至向白血病轉(zhuǎn)化[1-2]。JAK2V617F突變見于97%的PV,50%~60%的ET及PMF患者[3]。MPL515基因突變可見于3%~5%的JAK2V617F突變陰性的ET及PMF患者[4]。自2005年JAK2V617F和MPL515突變相繼被發(fā)現(xiàn)并納入WHO診斷標(biāo)準(zhǔn),該突變的發(fā)現(xiàn)改變了MPN的診斷和分類,從分子的角度詮釋了MPN的發(fā)病機(jī)制。但仍有40%的ET及PMF患者未檢測(cè)到JAK2V617F基因突變,最近研究發(fā)現(xiàn)CALR見于JAK2V617F陰性的ET及PMF患者,本研究對(duì)臨床初診MPN患者進(jìn)行了JAK2V617F、CALR及MPL515基因突變分析,現(xiàn)報(bào)道如下:

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選擇2012年1月~2015年3月在臨沂市沂水中心醫(yī)院就診的72例初診MPN患者。其中PV23例,男11例,女12例,年齡38~72歲;ET26例,男12例,女14例,年齡25~80歲;PMF23例,男16例,女7例,年齡39~76歲。所有患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書。

    1.2 檢驗(yàn)指標(biāo)

    對(duì)患者臨床資料、骨髓和外周血涂片、骨髓活檢進(jìn)行分析,按照WHO造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(2008)進(jìn)行診斷。

    1.3 方法

    CALR基因突變分析:用血液基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit,生產(chǎn)商:Qiagen公司)提取骨髓細(xì)胞基因組DNA,CALR9號(hào)外顯子PCR擴(kuò)增引物(生產(chǎn)商:Invitrogen公司;使用濃度:5.0 pmol/μL;貯存條件:干粉于-20℃保存,工作液于4℃保存;有效期:-20℃為1年,4℃為半年),設(shè)計(jì)序列:引物名稱:CALR-X9-Fwd,引物序列:FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT;引物名稱:CALR-X9-Rev,引物序列:TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR體系包括DNA 50~100 ng,2×Taq PCR Master Mix(TIANGEN公司產(chǎn)品)15 μL,正反向引物各0.5 μL,加去水離子補(bǔ)足體系至30 μL。反應(yīng)條件:98°C預(yù)變性3 min,98°C變性10 s,63°C退火30 s,72°C延伸30 s,共29個(gè)循環(huán),72°C延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用片段分析軟件Genemapperid V4.1進(jìn)行分析,分析示例見圖1。

    2 結(jié)果

    2.1 72例MPN患者臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)

    根據(jù)2008年WHO分型診斷標(biāo)準(zhǔn),PV 22例、ET 26例、PMF 23例、MPN-u 1例。所有患者均接受常規(guī)治療至隨訪結(jié)束,患者均存活。在8例CALR突變的ET患者血小板計(jì)數(shù)高于JAK2突變陽(yáng)性患者(表1);8例CALR突變的PMF患者中7例為男性,發(fā)病年齡較小,且呈現(xiàn)出較低的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平(表2)。

    2.2 JAK2V617F、CALR及MPL515基因突變檢測(cè)結(jié)果

    22例PV患者中16例攜帶有JAK2V617F突變(突變率為68%),未檢測(cè)出CALR基因突變;26例ET患者中12例攜帶有JAK2V617F突變(突變率為46%),8例檢測(cè)出CALR基因突變(突變率為31%),JAK2V617F突變陰性患者中CALR基因突變率為57%(8/14);23例PMF患者中11例攜帶有JAK2V617F突變(突變率為49%),8例檢測(cè)出CALR基因突變(突變率為35%),JAK2V617突變陰性患者中CALR基因突變?yōu)闉?7%(8/12)。在72例患者中均未檢測(cè)到MPL515突變。

    3 討論

    CALR為Ca2+結(jié)合蛋白復(fù)合體,主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(edoplasmic reticulum,ER)腔內(nèi)。CALR基因定位于染色體19p13.2~p13.3,包含9個(gè)外顯子,大小為4.2 kb,其編碼的CALR由高度保守近似球形結(jié)構(gòu)的N端(1~180氨基酸殘基)、參與ER內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存的酸性c端(291~400氨基酸殘基)及中間富含脯氨酸而形成的具伸出式結(jié)構(gòu)的P端(181~290氨基酸殘基)。3個(gè)結(jié)構(gòu)域均具有各自特殊的功能,N端及P端主要發(fā)揮分子伴侶的作用,C端的作用主要為調(diào)節(jié)ER中的Ca2+濃度,保持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài),CALR基因缺失將減少ER內(nèi)Ca2+的儲(chǔ)存量。CALR C端的終點(diǎn)為ER滯留信號(hào)(KDEI)肽,KDEL可使CALR從高爾基體回到ER,阻止其分泌至ER外,具有靶向定位作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CALR突變呈陽(yáng)性MPN患者骨髓細(xì)胞中突變型CALR大部分定位于ER內(nèi)[6]。同時(shí),CALR介導(dǎo)的Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可影響多種細(xì)胞功能,包括巨核細(xì)胞分化成熟及血小板的形成、整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、增殖及吞噬作用、介導(dǎo)傷口愈合及纖維化。早期研究證實(shí)BCR/ABL1陰性MPN患者存在JAK2V617突變。Kampfl等[6]和Nangalia等[7]采用外顯子測(cè)序的方法在JAK2/MPL陰性的大部分標(biāo)本中檢測(cè)到CALR第9個(gè)外顯子突變。并對(duì)大樣本健康人群進(jìn)行CALR目標(biāo)基因檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康個(gè)體對(duì)照組、淋巴系腫瘤、急性白血病及實(shí)體腫瘤中均未見CALR基因突變。結(jié)果提示CALR基因突變?yōu)镴AK2及MPL基因突變陰性的ET及PMF的特異性分子標(biāo)志物。因CALR基因突變均位于第9個(gè)外顯子,本研究采用直接檢測(cè)第9個(gè)外顯子的方法在JAK2基因突變陰性的ET患者中檢測(cè)到CALR突變率為57%;23例PMF患者中8例檢測(cè)出CALR基因突變(突變率35%);研究表明,CALR基因突變不會(huì)發(fā)生在PV患者中,本組22例患者中均未檢測(cè)到CALR基因突變也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。2014年,Tefferi等[8]檢測(cè)了576例ET患者中,CALR的突變率為15%;Rumi等[9]檢測(cè)了745例患者,CALR的突變率為24%;Chi等[10]檢測(cè)了289例患者,CALR的突變率為9%;Kim等[11]檢測(cè)CALR突變率為12.6%。本實(shí)驗(yàn)中ET患者CALR的突變率為31%,在JAK2/MPL陰性的ET患者中突變率57%,而國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道436例亞洲人CALR基因突變情況,CALR基因的突變率為22.7%,在JAK2/MPL陰性的ET患者中,其突變率為52.7%,本實(shí)驗(yàn)與國(guó)內(nèi)報(bào)道相符。Rumi等[12]對(duì)CALR 突變呈陽(yáng)性ET患者研究發(fā)現(xiàn),極少數(shù)患者的CALR突變的等位基因負(fù)荷>75%,該結(jié)果推測(cè)ET的發(fā)生可能為雜合子克隆逐步積累,最終在骨髓中占據(jù)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì),特異性刺激巨核細(xì)胞導(dǎo)致。本研究顯示CALR 突變患者均為雜合子。本研究中PMF患者CALR基因突變(突變率35%),與Langabeer等[13]報(bào)道的25%~35%的突變率相似。研究發(fā)現(xiàn)CALR突變與其臨床表現(xiàn)和預(yù)后有重要的相關(guān)性。在ET和PMF患者中,CALR基因突變PMF患者較JAK2突變者血小板計(jì)數(shù)更高、年齡更小、血紅蛋白更低,白細(xì)胞計(jì)數(shù)更低,PMF患者具有更好的生存率[14],本研究中患者也具有以上臨床特點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)生CALR和JAK2突變者發(fā)生心血管事件的概率是13.4%和30.1%,10年血栓癥累計(jì)發(fā)生率分別為5.1%和14.5%。在PMF患者中,Tefferi等[8]在254例標(biāo)本中篩查了一些與MPN相關(guān)的基因突變,發(fā)現(xiàn)他們與CALR突變沒(méi)有顯著的分子或遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)。Tefferi等[15]也報(bào)道在PMF患者中,發(fā)生1型CALR突變者比2型突變者有更好的預(yù)后。由本組實(shí)驗(yàn)可以看出,CALR是MPN中較易發(fā)生突變的基因,可將CALR突變檢測(cè)納入MPN診斷的常規(guī)指標(biāo)。在臨床上可以遵循以下思路考慮對(duì)MPN的診斷[16-20]:①由于CALR突變不發(fā)生在PV的患者,所以它不能用來(lái)篩查PV或PV后骨髓纖維化的疑似患者;②CALR、JAK2和MPL突變是互相排斥的,對(duì)已知發(fā)生了JAK2 或MPL突變的患者無(wú)需篩查CALR突變;③由于MPL突變率在三者中最低,對(duì)ET或PMF的疑似病例,應(yīng)先行JAK2V617突變篩查,若陰性再行CALR突變篩查,CALR陰性則行MPL突變篩查。盡管CALR基因突變等為疾病的診斷提供了較為特異的分子指標(biāo),但仍有10%的ET和PMF患者需要結(jié)合骨髓病理檢查結(jié)果加以診斷。

    綜上所述,CALR基因突變是JAK2V617F突變陰性的MPN特異性分子標(biāo)志物。將CALR基因突變檢測(cè)納入MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)可以提高診斷的準(zhǔn)確性減少漏診率。CALR基因突變的檢測(cè)有助于JAK2V617F突變陰性的MPN的鑒別診斷,對(duì)CALR基因突變功能的進(jìn)一步研究可望找到JAK2V617突變陰性MPN的分子治療靶標(biāo)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2015-06-12 本文編輯:蘇 暢)

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