染色體替換系的方案構建及評價

趙　瑩， 趙麗亞， 晁天柱， 張　蓉， 邢正弘， 陳國強， 肖君華

（1. 上海西普爾-必凱實驗動物有限公司， 上海 201203；2. 上海實驗動物研究中心， 上海 201203； 3. 東華大學生物科學與技術研究所， 上海 201620）

染色體替換系的方案構建及評價

趙瑩1，2， 趙麗亞1，2， 晁天柱3， 張蓉1，2， 邢正弘1，2， 陳國強1，2， 肖君華3

（1. 上海西普爾-必凱實驗動物有限公司， 上海 201203；2. 上海實驗動物研究中心， 上海 201203； 3. 東華大學生物科學與技術研究所， 上海 201620）

目的 為縮短復雜性狀相關基因精細定位時間，構建染色體替換系（CSSs），并對構建方案進行評價。 方法 以供體小鼠作為母本、受體C57BL/6小鼠作為父本進行雜交， 獲得N1代小鼠。將N1代雄性小鼠與C57BL/6雌性小鼠雜交， 獲得N2代小鼠。選擇N2代1號染色體非重組的雄性小鼠與C57BL/6雌性小鼠回交， 獲得N3代回交小鼠； 通過短串聯(lián)重復序列（STR）與單核苷酸多態(tài)性（SNP）對每代一定數(shù)量的子代進行遺傳分析， 依次回交10代， 選擇N10代1號染色體未重組的樣本， 雌雄交配， 挑選1號染色體為純合且來自供體品系的子代小鼠， 用于繁殖純合后代。通過基因芯片掃描鑒定替換系的純合度，并與期望值比較。 結果 根據(jù)構建的CSSs方案， 得到2個不同的CSSs， 通過基因芯片掃描得到的替換系純合度與期望值接近。 結論 構建的CSSs方案可完成（部分）近交系小鼠品系目標染色體替換， 供體品系背景基因組中99.59%以上已被受體C57BL/6小鼠替換，證明構建的CSSs方案可行。

染色體替換系（CSSs）； 方案構建； 評價； 非重組率

小鼠與人類共患許多受到遺傳調(diào)控的常見疾病，其中既有單基因參與調(diào)控的疾病，也有多基因參與調(diào)控的疾病，而多基因參與調(diào)控的疾病屬于復雜性狀。為了定位復雜性狀相關基因， 目前主要有三種方法： 第一，傳統(tǒng)方法，兩個品系通過回交N2代或雜交N2代初步鑒定相應的數(shù)量性狀基因座（QTL）［1］， 然后通過構建同類系鑒定相應QTL［2］。最后， 通過精細定位鑒定QTL。連鎖定位和同類系構建需要10～15代， 對于小鼠來說大概需要3～5年， 對于大鼠來說則需更長時間［3］。第二， 構建超大規(guī)模重組近交系（Recombinant inbred lines）， 將C57BL/6J、A/J、CAST/Ei、NOD/LtJ、NZO、WSB/Ei、PWK/Ph 與129S1/SvImJ等8個品系互相雜交20代以上［4］，形成上千個重組近交系，形成的重組近交系包含有來自8個近交系的基因。第三，染色體替換系（chromosome substitution strain， CSSs）［3］，CSSs主要是由一個受體品系與一個供體品系構建，CSSs的一條染色體來自供體品系，其余都是以受體品系為背景［3，5］，通過CSSs與受體品系有限的回交或雜交，比較CSSs與背景品系在感興趣表型的差異，從而鑒定相應染色體上的基因座。CSSs已經(jīng)用于鑒定幾個復雜性狀的QTL，例如，明暗場選擇、開放區(qū)域選擇、血清中甾醇類和血清中部分氨基酸的濃度都與1號染色體有關［6］； 肥胖和動脈粥樣硬化是由環(huán)境和遺傳因素引起的，發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣硬化相關的QTL有兩個，與體質(zhì)量有關的QTL有數(shù)十個，并找到三個與能量消耗有關的QTL和一個與食物吸收相關的QTL［7］； 睪丸癌是目前影響年輕男性健康的一種常見癌癥，已發(fā)現(xiàn)與睪丸癌有關的QTL定位于19號染色體［8］； 與焦慮有關QTL定位于1號、4號、6號、15號、17號染色體［9］； 與性發(fā)育有關的QTL定位于6號、13號染色體［10］； 與骨質(zhì)疏松有關的QTL定位于1號染色體［11］。不同數(shù)量性狀相關疾病的QTL位于不同染色體上。

小鼠1號染色體是目前復雜性狀研究成果最集中的染色體， 在已知的4 000多個QTL中， 有400多個被定位在1號染色體（informatics.jax.org）， 占總數(shù)的10%，雖然有如此多QTL被成功定位，但明確鑒定導致復雜性狀差異的基因卻只有20個左右［12］。其根本原因是小鼠遺傳資源的積累與研究導致了復雜性狀初步定位的蓬勃發(fā)展； 而另一方面，初步定位到QTL后對基因的精細定位卻舉步維艱［13］，因此構建染色體替換系非常重要。

1　材料與方法

1.1動物飼育

選擇C57BL/6作為受體品系，C3H/He、FVB/ N為供體品系。所有動物均為SPF級，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［SCXK（滬）2008-0016］。所有動物飼養(yǎng)于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［SYXK（滬）2008-0058］，動物實驗遵守1988年《實驗動物管理條例》。

1.2構建染色體替換系

以供體小鼠作為母本、受體C57BL/6品系小鼠作為父本進行雜交，獲得N1代小鼠。將N1代雄性小鼠與C57BL/6品系雌性小鼠雜交，獲得N2代小鼠。通過構建的STR與SNP分型方案鑒定N2代小鼠1號染色體的重組情況［14-16］，以雄性小鼠為分型對象，選擇1號染色體上所有位點都未重組的樣本； 將選擇到的雄性小鼠與C57BL/6品系雌性小鼠回交，獲得N3代回交小鼠； 依次回交10代［17］； 從而獲得2個不同的染色體替換系。對N10代染色體替換系雌雄小鼠分型，挑選1號染色體未重組的樣本，雌雄交配，鑒定其后代1號染色體的重組情況，選擇1號染色體為純合且來自供體品系的子代小鼠，即為得到的小鼠染色體替換系（圖1）。

圖1　構建染色體替換系方案Figure 1 The strategy for constructing CSSs

1.3基因組背景純度鑒定

選擇含有1 449個SNP位點的芯片， 通過基質(zhì)輔助激光吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術， 對2個CSSs N6代和N10代進行基因組背景純度鑒定，每個品系每個代數(shù)選擇一個樣本，共4個樣本，根據(jù)所得數(shù)據(jù)對該染色體替換方案進行評估，該步實驗由晶能生物技術有限公司完成。

1.4染色體替換系N2代的非重組率及替換系子代種群大小

在構建CSSs 過程中，每個品系需要保證有5～8只雄性傳代小鼠，才能在理想時間內(nèi)獲得數(shù)量足夠大的子代群體。通過構建的STR與SNP基因分型方法鑒定每個替換系的N2代小鼠1號染色體的重組情況，分型對象為雄性小鼠，選擇1號染色體上所有位點都未重組的樣本，非重組率為每個品系篩選出的樣本數(shù)占所有用于分型的樣本總數(shù)，替換系子代種群大小等于需要傳代的小鼠數(shù)量乘以2再除以非重組率。

1.5替換系子代小鼠體質(zhì)量稱量

從N1代到N10代， 對每個品系每代小鼠10日齡和20日齡子代小鼠稱重，考察體質(zhì)量隨代數(shù)的變化情況。

1.6統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1構建的2個染色體替換系及基因組背景純度

借助經(jīng)典遺傳學， 以供體做母本， 受體C57BL/6品系做父本，雜交得到N1子代，該N1代雄性小鼠的X染色體來自于供體，Y染色體來自于受體C57BL/6， 而N1代雌性小鼠的X染色體為雜合子，一條來自于供體， 一條來自于受體C57BL/6，因此N1代使用雄性小鼠傳代，即N1代雄性小鼠與受體C57BL/6品系回交，得到的N2代雄性小鼠的線粒體和X染色體都來源于受體C57BL/6背景，從N3代采用雄性小鼠或者雌性小鼠與受體C57BL/6回交傳代，得到子代的線粒體和性染色體都是來源于受體C57BL/6背景，最終達到替換1號染色體的目的。通過構建的CSSs方案， 目前已成功培育了2個染色體替換系，2個CSSs 分別為： C57BL/6.C3H/ He-Chr1、C57BL/6.FVB/N-Chr1（見圖2）。替換系的線粒體和性染色體完全來自C57BL/6，其1號染色體已被不同的供體品系替換，同時背景基因組的純度已達到期望值。

利用1 449個高密度SNP基因芯片對2個染色體替換系N6代、N10代進行基因組純度鑒定，C57BL/6.C3H/He-Chr1背景基因組N6代和N10代純度分別為98.90%和99.65%，C57BL/6.FVB/N-Chr1背景基因組N6代和N10代純度分別為99.38%和99.59%（表1）。

圖2　兩個染色體替換系示意圖Figure 2 The diagram of two chromosome substitution strains

2.2染色體替換系N2代的非重組率及替換系子代種群大小

通過構建的STR與SNP基因分型方法對2個染色體替換系N2代小鼠進行分型，篩選出1號染色體未重組的樣本（表2）。發(fā)現(xiàn)近交系來源小鼠1號染色體的平均非重組率為17.7%。其中， C57BL/6. C3H/He-Chr1替換系的非重組率為15.5%， C57BL/6. FVB/N-Chr1替換系的非重組率為23.8%。自N1代起選用雄性小鼠傳代， 每代需5～8只小鼠傳代， 結合本方案中每個替換系N2代1號染色體非重組率的實際值， C57BL/6.C3H/He-Chr1與C57BL/6.FVB/N-Chr1替換系每代分別需要65～104只和42～68只個體。同時，N2代的非重組率及實際種群數(shù)量也為每個替換系后續(xù)回交繁殖群體數(shù)量的控制提供了依據(jù)。

表1　基因芯片檢測結果Table 1 The result of microarray detection

2.3各品系替換過程中子代的體質(zhì)量分析結果

每個染色體替換系每代10日齡和20日齡小鼠的平均體質(zhì)量和標準差如表3、表4。

C57BL/6.C3H/He-Chr1和C57BL/6.FVB/N-Chr1替換系的N1代10日齡與20日齡體質(zhì)量均高于其它代數(shù)的10日齡與20日齡體質(zhì)量，且有顯著差異（P＜0.05）。從N2代到N10代， C57BL/6.C3H/He-Chr1 和C57BL/6.FVB/N-Chr1替換系每代雄鼠與雌鼠的10日齡與20日齡體質(zhì)量基本處于一條直線上，無代數(shù)反應關系（P＞0.05）。

表2　各替換系N2代1號染色體的非重組率Table 2 The rate of non-recombination of N2 mice in each chromosome 1 substitution strain

表3　各品系替換過程中子代10 d的體質(zhì)量Table 3 The body weight for 10 days progeny mice in chromosome 1 substitution strains

表4　各品系替換過程中子代20 d的體質(zhì)量Table 4 The body weight for 20 days progeny mice in chromosome 1 substitution strains

2.4CSSs的方案評價

染色體替換過程中各代基因組背景純度的理論值可以由計算而得［10］，N1代可替換約50%的基因組，即N1代C57BL/6遺傳背景的純度理論值約為50%。以此類推， N2代到N10代C57BL/6遺傳背景的純度理論值分別為75.00%、87.50%、93.75%、96.88%、98.44%、99.22%、99.61%、99.81%、99.90%。N6代純度理論值已接近99%，并趨于穩(wěn)定， 因此選N6代與N10代進行純合度檢測。根據(jù)SNP基因芯片掃描結果， C57BL/6.C3H/He-Chr1替換系N6代與N10代的純合度分別為98.90%、99.65%，C57BL/6.FVB/N-Chr1替換系N6代與N10代的純合度分別為99.38%、99.59%。2個CSSs N6代的實際純合度均高于理論值98.44%，2個CSSs N10代的實際純合度與理論值99.90%接近，證明文中構建的染色體替換方案可行。

3　討論

在本研究中，主要關注CSSs的方案構建，通過供體與受體的雜交后代不斷與受體回交，采用STR與SNP遺傳位標鑒定子代的1號染色體重組情況，篩選出1號染色體未重組的樣本，在替換過程中首先解決線粒體、X染色體、Y染色體替換的難題，通過1號染色體的非重組率估計每個替換系子代的種群數(shù)量，并通過基因芯片掃描進一步評價該方案，CSSs系的構建需要大量的分型工作和飼養(yǎng)工作， 大概需要2～3年，以及大量的費用，但是一旦形成，它們對于公眾的染色體研究就是一個可持續(xù)和非常有價值的資源。到目前為止，文獻中報道［3］已經(jīng)構建的CSSs主要有： CSS C57BL/6J-chr （i）A/J，i代表1～21，CSS 129/Sv-chr19MOLF/Ei。

另外，有報道［18］利用亨廷頓舞蹈病的疾病修飾基因座評估CSSs， C57BL/6J-chr10A/J/NaJ（CSS10）與HdhQ111基因敲除小鼠C57BL/6J雜交，對F1子代檢測， 證實染色體替換系在體質(zhì)量上有明顯差異，HdhQ111基因敲除小鼠與肝和核內(nèi)包涵體形成中CAG基因穩(wěn)定性有關。另外Courtney 等［19］利用C57BL/6J-chr10A/J/NaJ（CSS14）染色體替換系來評估小鼠的內(nèi)在運動能力， 將QTL定位在14號染色體，并對C57BL/6J-chr10A/J/NaJ（CSS14）與C57BL/6J回交的F2代進行連鎖分析， 在14號染色體上找到多個相關QTL， 證明了CSSs可大大縮短基因定位時間。

在染色體替換過程中，假定各種染色體交換之間互不干擾，根據(jù)染色體長度，子代染色體的非重組率期望值公式為1/2e-d/100［3］， d表示染色體長度， 小鼠1號染色體長度約為112.5 cM， 則小鼠1號染色體的非重組率期望值為16%。但是各種染色體交換之間并不是完全無關，且各品系間遺傳背景也有差異，因此小鼠子代染色體的實際非重組率與期望值略有差異，捷克、美國及日本等科學家進行亞種間染色體替換的研究顯示，供體為A/J， 受體為C57BL/6的1號染色體實際非重組率為16%［2］。本方案中小鼠1號染色體的平均非重組率為17.7%，與文獻報道結果一致。

染色體替換系群由于僅僅對比一條染色體對性狀的貢獻，基因組其它基因調(diào)控因素被完全均一化，因此是研究微效基因獨特資源。因此，該類資源的研發(fā)可加速人類疾病相關基因的研究步伐，具有重大科學應用價值與良好社會效益。

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Construction and Evaluation of Chromosome Substitution Strains

ZHAO Ying1，2， ZHAO Li-ya1，2， CHAO Tian-zhu3， ZHANG Rong1，2，XING Zheng-hong1，2， CHEN Guo-qiang1，2， XIAO Jun-hua3
（1. Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal LTD.， CO， Shanghai 201203， China；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai 201203， China；3. Institute of Biological Sciences and Biotechnology， Donghua University， Shanghai 201620， China）

Objective To shorten the fine-structure mapping time， construct and evaluate the programme of chromosome substitution strains （CSSs） . Methods The rst step required making hybrids between C57BL/6 male mice and donor female mice. N1 hybrids male mice were backcrossed to host C57BL/6 female mice. Progeny with a non-recombinant chromosome derived from donor strain， in this case chromosome 1， were identified in this and subsequent backcrosses. N2 Male mice were backcrossed to host C57BL/6 female mice at each generation. A certain number of progeny per generation was screened with short tandem repeat （STR） and single nucleotide polymorphism （SNP）. These mice were backcrossed to host C57BL/6 at each generation until tenth generation. At the tenth backcross generation males and females with the non-recombinant chromosome derived from donor mice were intercrossed. Progeny of this intercross that were homozygous （homosomic） for chromosome 1 were used to propagate the homosomic strain. The homozygosity of CSSs was identified through scanning the whole genomic by microarray to compare with expected proportion. Results We have constructed two CSSs by the programme that had been constructed. The actual homozygosity of progeny with microarray was approaching the expected. Conclusion The constructed CSSs confirmed the replacement of target chromosome and over 99.59% chromosome segments from host C57BL/6. This breeding program to generate a CSSs panel proved to be feasible.

Chromosome substitution strains （CSSs）； Construct the programme； Discuss；Rate of non-recombination

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0478-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.010

2015-06-05

上海市科學技術委員會科研計劃項目（12140900400、13140900302）

趙瑩（1982-）， 女， 助研， 碩士， 從事群體遺傳學及藥物毒性安全評價研究。E-mail： 12414863@qq.com