鈣離子通道β2亞基基因多態(tài)性與溫州地區(qū)漢族人群腦卒中的關(guān)聯(lián)性

王欣，陳婧，汪倩，林燕，牛宇欣，王曉歐，倪莉，杜兵，胡云良

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院　檢驗科，浙江　溫州　325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院　神經(jīng)內(nèi)科，浙江　溫州　325027；3.美國佛羅里達大學，佛羅里達州　32610；4.煙臺毓璜頂醫(yī)院　檢驗科，山東煙臺　264000）

鈣離子通道β2亞基基因多態(tài)性與溫州地區(qū)漢族人群腦卒中的關(guān)聯(lián)性

王欣1，4，陳婧1，汪倩1，林燕2，牛宇欣3，王曉歐1，倪莉1，杜兵1，胡云良1

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，浙江溫州325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江溫州325027；3.美國佛羅里達大學，佛羅里達州32610；4.煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗科，山東煙臺264000）

目的：探討鈣離子通道β2亞基（CACNB2）基因多態(tài)性與溫州地區(qū)漢族人群腦卒中的關(guān)聯(lián)性。方法：收集原發(fā)性高血壓患者413例、高血壓合并缺血性腦卒中患者418例、高血壓合并出血性腦卒中患者377例、正常對照355例。采取病例-對照相關(guān)分析方法，利用飛行時間質(zhì)譜分型技術(shù)對CACNB2基因6個SNP位點（rs11014166、rs10764319、rs7099380、rs7069292、rs2228645、rs2357928）進行分型。結(jié)果：原發(fā)性高血壓組、高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組rs7069292 CT基因型頻率及C等位基因頻率明顯高于正常對照組（CT基因型頻率分別為6.05% vs 1.97%，6.94% vs 1.97%，6.36% vs 1.97%，C等位基因頻率分別為3.03% vs 1.0%，3.47% vs 1.0%，3.18% vs 1.0%），差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。原發(fā)性高血壓組、高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組CT基因型及C等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。其余5個SNP位點各基因型頻率及等位基因頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。結(jié)論：CACNB2基因rs7069292多態(tài)性與溫州漢族人群原發(fā)性高血壓具有關(guān)聯(lián)性，T＞C變異可能影響CACNB2功能，易患高血壓。通過校正高血壓影響，T＞C變異與腦卒中不具關(guān)聯(lián)性。

鈣離子通道β2亞基基因；多態(tài)性；腦卒中；高血壓；漢族；溫州地區(qū)

腦卒中是一組由于腦組織局部缺血或/及出血造成腦組織損傷為主要臨床表現(xiàn)的疾病，在所有心血管疾病導致的死因中居于第二位［1］。根據(jù)中國心血管患者監(jiān)測（WHO MONICA方案）發(fā)表數(shù)據(jù)，我國腦卒中以每年8.7%的速率增長，每年新發(fā)病例260萬例［2-3］。有研究顯示我國原發(fā)性高血壓人群腦卒中的發(fā)生率較正常人群高5～30倍［4］，提示二者可能擁有共同的遺傳易感基因。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果證實高血壓的發(fā)生與鈣離子通道在基因水平的單核苷酸多態(tài)性特別是其α1和β亞基基因多態(tài)性有著極為重要的相關(guān)性［5］。鈣離子通道在由心肌和血管平滑肌收縮和舒張引起的血壓變化過程中起著極為重要的作用，其β2亞基通過與α1C亞基結(jié)合來調(diào)節(jié)鈣離子通道的電流強度、電壓依賴性、激活與失活特性［6］。本研究通過飛行時間質(zhì)譜法檢測鈣離子通道β2亞基（CACNB2）基因6個SNP位點基因多態(tài)性，分析各基因型頻率及等位基因頻率在溫州地區(qū)漢族人群中腦卒中患者發(fā)病的遺傳規(guī)律和特點，尋找與腦卒中具有關(guān)聯(lián)性的腦卒中易感性鈣離子通道基因多態(tài)性位點。

1　對象和方法

1.1研究對象

1.1.1病例組：于2010年3月-2011年8月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、鹿城區(qū)人民醫(yī)院等三所醫(yī)院收集795例高血壓合并腦卒中病例，其中高血壓合并出血性腦卒中組377例，男243例，女134例，平均年齡（61.43±11.33）歲；高血壓合并缺血性腦卒中組418例，男250例，女168例，平均年齡（63.82±11.40）歲。在上述單位體檢中心、門診收集原發(fā)性高血壓病例413例，男274例，女139例，平均年齡（62.52±9.42）歲。缺血性腦卒中所有病例的選取均符合2010年《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》診斷標準；出血性腦卒中所有病例的選取均符合2007年《中國腦血管病防治指南》診斷標準。排除標準為：排除瓣膜性心臟病、房顫、血液病、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等引起的腦卒中。原發(fā)性高血壓患者入選標準：符合2010年《中國高血壓防治指南》高血壓診斷標準：未治療前非同日3次測量，收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg者，或者血壓＜140/90 mmHg，但正在服用降壓藥者。排除標準：包括腎臟病變、內(nèi)分泌疾病引起的高血壓、嚴重糖尿病、周圍血管疾病、貧血、心力衰竭、嚴重肝功能障礙及其他不宜參加研究的患者。

1.1.2對照組：收集健康體檢者共355例作為對照組，男219例，女136例，平均年齡（61.78±9.88）歲。納入標準：收縮壓＜140 mmHg，舒張壓＜90 mmHg，并排除：①有心腦血管病或心腦血管病史者；②有腦卒中家族史者；③正在服用降壓藥或有過服用高血壓藥物史者、各種疾病所引起的低血壓者。所有病例通過詢問病史、檢測臨床生化相關(guān)指標，排除繼發(fā)性腦卒中、嚴重肝腎功能不全、腫瘤等疾病。同時問卷調(diào)查年齡、性別，測量身高、體質(zhì)量，并計算體質(zhì)量指數(shù)（BMI=體質(zhì)量/身高2）等資料。

1.2血標本采集與分析處理 采集研究對象空腹靜脈血5 mL，其中2 mL EDTA·Na2抗凝，于-70 ℃冰箱冷凍保存，準備抽提DNA。另留3 mL用于血脂常規(guī)四項［總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）］、空腹血糖（FBG）等項目測定，BECKMAN-COULTER SYNCHRON LX-20型全自動生化分析儀上采用原裝配套試劑檢測。

1.3實驗方法步驟

1.3.1DNA的制備：按Axyprep全血基因組DNA試劑盒說明書快速抽提全血基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物置-20 ℃冰箱保存。

1.3.2引物合成：全部引物（6對PCR擴增引物及6條延伸引物）均由SEQUENOM公司的軟件Assay Design 3.1程序設(shè)計，由北京擎科公司合成，見表1。1.3.3 PCR擴增及SNP分型：用多重PCR技術(shù)對所選的SNP位點的基因序列進行擴增（反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45個循環(huán)，72 ℃延伸5 min）。在上述擴增產(chǎn)物中加入SAP酶純化并加入ddNTP，通過單堿基延伸引物（約20 bp）來實現(xiàn)SNP位點的擴增。按SEQUENOM公司的Manual進行實驗操作。延伸完畢后，產(chǎn)物通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）基因分型技術(shù)，進行SNP分型。

1.4統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。Hardy-Weinberg平衡檢驗所抽樣本群體代表性，正態(tài)分布計量資料用±s表示，各組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

表1　CACNB2基因6個SNP位點的PCR引物及延伸引物（5’→3’）

2.1高血壓合并腦卒中組、原發(fā)性高血壓組與對照組多指標比較 與對照組比較，高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組及原發(fā)性高血壓組均出現(xiàn)TG、FBG偏高，而HDL-C降低（均P＜0.05）；高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組及原發(fā)性高血壓組3組間比較TG、FBG差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。4組間年齡、BMI、TC、LDL-C差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2　研究對象的基本指標比較

表2　研究對象的基本指標比較

與對照組比：aP＜0.05

組別　n　　年齡（歲）　BMI（kg/m2）　TC（mmol/L）　TG（mmol/L）　HDL-C（mmol/L）　LDL-C（mmol/L）　FBG（mmol/L）對照組　355　61.78± 9.88　23.76±1.87　5.33±1.05　1.58±1.20a　1.43±1.06a　3.07±1.54　5.49±1.29a原發(fā)性高血壓組　413　62.52± 9.42　24.21±2.54　5.40±1.56　2.33±1.35a　1.25±0.59a　3.06±0.84　5.85±1.54a高血壓合并缺血性腦卒中組　418　63.82±11.40　24.78±3.12　5.46±1.84　2.38±1.48a　1.22±0.52a　3.10±1.03　5.99±1.61a高血壓合并出血性腦卒中組　377　61.43±11.33　24.46±3.33　5.38±1.76　2.26±1.73a　1.21±0.55a　3.15±1.24　5.93±1.73aF 1.750　1.940　1.760　2.490　3.16　0.054　3.880 P 0.081　0.053　0.077　0.013　0.02　0.950　0.000

2.2群體代表性檢驗 高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組及原發(fā)性高血壓組和對照組CACNB2 6個SNP位點基因型分布經(jīng)x2檢驗，P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明此4組研究對象具有群體代表性。

2.3CACNB2基因多態(tài)性質(zhì)譜分析 SNP的分型結(jié)果為：rs11014166位點的基因型為AA、AT和TT；rs10764319位點的基因型為CC、CT和TT；rs7099380位點的基因型為AA、AG和GG（見圖1-3）；rs7069292位點的基因型為CT和TT；rs2357928位點的基因型為AA、AG和GG；rs2228645位點的基因型為CC、CT 和TT。

圖1　rs7099380A/G的質(zhì)譜峰圖

2.4各組CACNB2基因6個SNP位點基因型及等位基因分布頻率比較 x2檢驗結(jié)果顯示：原發(fā)性高血壓組、高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組rs7069292 CT基因型頻率及C等位基因頻率明顯高于對照組（CT基因型頻率分別6.05% vs 1.97%，6.94% vs 1.97%，6.36% vs 1.97%；C等位基因頻率分別為3.03% vs 1.0%，3.47% vs 1.0%，3.18% vs 1.0%），差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；原發(fā)性高血壓組、高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組CT基因型及C等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。缺血性腦卒中組、出血性腦卒中組與原發(fā)性高血壓組其余5個SNP位點基因型頻率和等位基因頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3-4。

圖2　rs7099380A/A的質(zhì)譜峰圖

圖3　rs7099380G/G的質(zhì)譜峰圖

表3　4組間CACNB2各SNP位點基因型分布頻率的比較　n（%）

3　討論

腦卒中的高發(fā)病率、高病死率和高致殘率給社會、家庭和患者帶來沉重的負擔和巨大的痛苦。流行病學研究表明，腦卒中是遺傳易感性和環(huán)境因素共同決定的多基因遺傳性疾病，存在基因-基因、基因-環(huán)境間相互作用，又稱多因素疾?。?］。由于目前尚無治療腦卒中的理想方法，因此尋找腦卒中相關(guān)危險因素，并采取積極干預(yù)措施具有特別重要的意義。

表4　4組間CACNB2各SNP位點等位基因分布頻率的比較　 n（%）

近年來，腦卒中遺傳致病基因主要集中在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）基因、血管緊張素原（AGT）基因、載脂蛋白E（ApoE）基因、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因、FV基因、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因、心鈉素（ANP）基因等的研究［8-9］，雖然都證實與腦卒中的發(fā)病存在一定的相關(guān)性，但是其具體的作用機制仍不十分明確，還需要更進一步的科學研究。

目前已知的腦卒中危險因素中高血壓為腦卒中首要且獨立的危險因素，且收縮壓每增加10 mmHg，腦卒中發(fā)病相對危險增加49%；舒張壓每增加5 mmHg，腦卒中危險增加46%［10］。以上提示二者可能擁有共同的遺傳易感基因，故近年來有關(guān)腦卒中候選基因研究較多集中于與血壓調(diào)節(jié)和高血壓有關(guān)的基因。

電壓依賴型L型鈣離子通道（voltage depandent calcium channel，L-VDCC）是觸發(fā)心肌及血管平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)的最主要Ca2+通道，由α1C亞基、β亞基、α2δ亞基和γ亞基組成［11］。β亞基有4個亞型（β1-β4），只有β2唯一構(gòu)成心肌和血管平滑肌的L-VDCC，其與α1C亞基協(xié)同表達時，才能使電流逐級遞增［12］，改變通道的電壓依賴性，調(diào)節(jié)通道激活及失活動力學［13］。Grueter等［14］發(fā)現(xiàn)β2亞基Thr498的變異（Thr498Ala），能夠阻止CamKI I介導L-VDCC開放，從而影響Ca2+內(nèi)流所觸發(fā)的興奮-收縮耦聯(lián)而影響血壓變化。Buraei等［15］發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白通過與β亞基的結(jié)合來實現(xiàn)對鈣離子通道的調(diào)節(jié)，推測β亞基可能可以獨立執(zhí)行對鈣離子通道的調(diào)節(jié)。

本研究通過對中國溫州地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓組與高血壓合并腦卒中組CACNB2基因多態(tài)性差異表達，尋找與腦卒中具有關(guān)聯(lián)性的腦卒中易感性鈣通道基因多態(tài)性位點。我們選取CACNB2基因可能有功能意義的6個SNP位點，包括第1選擇性轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域-1191C/T（rs10764319）、第2選擇性轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域內(nèi)含子的117383C/T（rs7069292）、119411A/G（rs7099380）、120036A/G（rs2357928）、第3內(nèi)含子的279193A/T（rs11014166）及第14外顯子的398766C/T（rs2228645）。

原發(fā)性高血壓組、高血壓合并缺血性腦卒中組、高血壓合并出血性腦卒中組rs7069292 CT基因型頻率及C等位基因頻率明顯高于對照組，攜帶CT基因型人群比TT基因型人群患高血壓病、高血壓合并腦卒中風險增加。rs7069292位于CACNB2基因的第2內(nèi)含子區(qū)域，該區(qū)域包含1個含CACNB2基因選擇性剪切的啟動子，其點突變可能致使在轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)選擇性剪切，進而影響基因的表達，引起蛋白質(zhì)功能發(fā)生變化，導致CACNB2與α1C結(jié)合發(fā)生改變，影響L-VDCC的功能，進而影響到血壓的變化。Antzelevitch等［16］發(fā)現(xiàn)CACNB2基因突變導致鈣離子通道主要功能喪失，進而影響鈣離子通道活性改變，引起血壓的變化。我們對CACNB2的功能研究也證實了含rs7069292 C等位基因的啟動子活性與含rs7069292 T等位基因的啟動子活性相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義［17］。通過校正高血壓病對腦卒中的影響，發(fā)現(xiàn)rs7069292基因多態(tài)性與腦卒中不具關(guān)聯(lián)性。

其余5個SNP位點結(jié)果顯示高血壓合并出血性腦卒中組、高血壓合并缺血性腦卒中組、原發(fā)性高血壓組的基因型頻率及等位基因頻率與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），提示rs11014166、rs10764319、rs7099380、rs2228645、rs2357928等位點變異與高血壓及腦卒中發(fā)病無相關(guān)性，可能不是高血壓及高血壓性腦卒中的遺傳易感性SNP位點。

當然，本研究不能排除由于樣本量少、抽樣誤差可能造成的影響，還需要進一步擴大樣本量，長期隨訪基因位點變異者，進一步進行研究驗證。

［1］方向華， 王淳秀， 梅麗萍， 等. 腦卒中流行病學研究進展［J］.中華流行病學雜志， 2011， 32（9）： 847-853.

［2］Zhao D， Liu J， Wang W， et al. Epidemiological transition of stroke in China: twenty-one-year observational study from the Sino-MONICA-Beijing Project［J］. Stroke， 2008， 39（6）: 1668-1674.

［3］Donnan GA， Fisher M， Macleod M， et al. Stroke［J］. Lancet，2008， 371（9624）: 1612-1623.

［4］張林峰， 楊軍， 武陽豐， 等. 我國人群中缺血性和出血性腦卒中發(fā)病的相對比例［J］. 中華內(nèi)科雜志， 2003， 42（2）： 94-97.

［5］Beitelshees AL， Navare H， Wang D， et al. CACNA1C gene polymorphisms， cardiovascular disease outcomes， and treatment response［J］. Circ Cardiovasc Genet， 2009， 2（4）: 362-370.

［6］Varadi G， Lory P， Schultz D， et al. Acceleration of activation and inactivation by the beta subunit of the skeletal muscle calcium channel［J］. Nature， 1991， 352（6331）: 159-162.

［7］易彥， 張華. 腦卒中患者ABCA1基因單核苷酸多態(tài)性檢測的意義［J］. 分子診斷與治療雜志， 2011， 3（3）： 188-191.

［8］Rubattu S， Giliberti R， Russo R， et al. Analysis of the genetic basis of the endothelium-dependent impaired vasorelaxation in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat: a candidate gene approach［J］. Hypertens， 2000， 18（2）: 161-165.

［9］Szolnoki Z， Somogyvari F， Kondacs A， et al. Evaluation of the interactions of common genetic mutations in stroke subtypes［J］. Neurol， 2002， 249（10）: 1391-1397.

［10］ Okrainec K， Pilote L， Platt R， et al. Use of cardiovascular medical therapy among patients undergoing coronary artery bypass graft surgery: results from the ROSETTA-CABG registry［J］. Can J Cardiol， 2006， 22（10）: 841-847.

［11］ Benitah JP， Alvarez JL， Gomez AM. L-type Ca2+current in ventricular cardiomyocytes［J］. J Mol Cell Cardiol， 2010， 48 （1）: 26-36.

［12］ Lacerda AE， Kim HS， Ruth P， et al. Normalization of current kinetics by interaction between the alpha1 and beta subunits of the skeletal muscle dihydropyridine-sensitive Ca2+channel［J］. Nature， 1991， 352（6335）: 527-530.

［13］ Gollasch M， Ried C， Liebold M， et al. High permeation of L-type Ca2+channels at physiological Ca2+: homogeneity and dependence on the alpha 1-subunit［J］. Am J Physiol，1996， 271（3 Pt 1）: C842-C850.

［14］ Grueter CE， Abiria SA， Dzhura I， et al. L-type Ca2+channel facilitation mediated by phosphorylation of the beta subunit by CaMKII［J］. Mol Cell， 2006， 23（5）: 641-650.

［15］ Buraei Z， Yang J. The β subunit of voltage-gated Ca2+channels［J］. Physiol Rev， 2010， 90（4）: 1461-1506.

［16］ Antzelevitch C， Pollevick GD， Cordeiro JM， et al. Loss-offunction mutations in the cardiac calcium channel underlie a new clinical entity characterized by ST-segment elevation，short QT intervals， and sudden cardiac death［J］. Circulation，2007， 115（4）: 442-449.

［17］ 孫倩， 王欣， 黃穎， 等. CACNB2基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性研究［J］. 中華醫(yī)學遺傳學雜志， 2013， 30（3）：340-344.

（本文編輯：吳健敏）

Association between CACNB2 gene polymorphism and stroke of ethnic Han Chinese in Wenzhou region

WANG Xin1，4， CHEN Jing1， WANG Qian1， LIN Yan2， NIU Yuxin3， WANG Xiaoou1， NI Li1， DU Bing1， HU Yunliang1. 1.Department of Clinical Laboratory， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou， 325027； 2.Department of Internal Neurology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 3.University of Florida， USA Florida， 32610； 4.Department of Clinical Laboratory，Yuhuangding Hospital， Yantai， 264000

Objective: To explore the association between genetic polymorphism of CACNB2 and stroke of ethnic Han Chinese in Wenzhou region. Methods: Four hundred and thirteen cases of essential hypertension （EH）， 418 cases of high blood pressure with ischemic stroke， 377 cases of high blood pressure with hemorrhagic stroke and 355 normal controls were analyzed via cross-sectional case-control. Six SNP loci of genotypes of rs11014166， rs10764319， rs7099380， rs7069292， rs2228645， rs2357928 of CACNB2 were typed by MALDI-TOFMS. Results: Compared to the control， the frequency of the CT genotype and allele frequency C of rs7069292 in high blood pressure group， high blood pressure with ischemic stroke group and high blood pressure with hemorrhagic stroke group were significantly higher （the frequency of the CT genotype 6.05% vs 1.97%，6.94% vs 1.97%， 6.36% vs 1.97%， allele frequency C 3.03% vs 1.0%， 3.47% vs 1.0%， 3.18% vs 1.0%， P＜0.05）. There was no significant difference in the other 5 SNPs， P＞0.05. Conclusion: There is significant association between polymorphisms of CACNB2 and people with essential hypertension （EH） in Wenzhou region. T＞C may be a factor that affected the gene expression of CACNB2 and lead to high blood pressure. Mutation of T＞C has no relevance with stroke by correcting the influence of high blood pressure.

CACNB2 gene； polymorphism； stroke； hypertension； Han Chinese； Wenzhou

R743

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.003

2014-04-11

浙江省自然科學基金資助項目（LY12H09003）；溫州市重大科研基金資助項目（Y20070038）。

王欣（1987-），女，山東淄博人，檢驗師，碩士。

胡云良，教授，碩士生導師，Email：hyl@wmu.edu.cn。