孟魯司特對嗜酸細胞胃腸炎幼鼠腸道炎癥的抑制作用

張曉燕，吳 斌，劉俊紅，盧建雙，黃歡歡，洪舒婷

業(yè)已證實，孟魯司特（montelukast，MK）是一種新型高選擇性半胱氨酰白三烯受體（cysteinyl leukotriene receptor，CysLTR）拮抗劑，能特異性與CysLT1R結(jié)合，抑制半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes，CysLTs）所致的血管通透性增加、平滑肌收縮，抑制炎癥遞質(zhì)和細胞因子的釋放，預(yù)防和抑制嗜酸性粒細胞（eosinophils，EOS）生長因子，如IL－3、IL－5、粒細胞集落刺激因子對 EOS等的促成熟作用，使外周血及器官局部EOS減少，減輕炎癥反應(yīng)［1］。近年來，臨床上嘗試將MK應(yīng)用于嗜酸細胞胃腸炎（eosinophilic gastroenteritis，EG）的治療。本研究采用卵白蛋白（ovalbumin，OVA）腹腔注射致敏聯(lián)合灌胃激發(fā)建立Sprague－Dawley（SD）幼鼠EG模型，觀察各組幼鼠腸黏膜炎癥損傷、EOS密度、肥大細胞（mast cell，MC）密度及 MC脫顆粒率變化，探討MK對EG幼鼠腸道炎癥的抑制作用，為臨床應(yīng)用MK治療EG提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級3周齡雌性SD幼鼠32只［許可證號：SCXK（滬）2007－0005，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司］，體質(zhì)量50～70g，采用不含雞蛋蛋白的飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（23±3）℃，濕度50%～70%。根據(jù)有否造模、是否使用MK干預(yù)兩因素兩水平，按2×2進行排列組合，將32只幼鼠隨機分成4組，分別為：造模＋未使用MK干預(yù)組（M1I0組）、造模＋使用 MK干預(yù)組（M1I1組）、未造模＋未使用MK干預(yù)組（M0I0組）和未造模＋使用MK干預(yù)組（M0I1組），每組8只。

MK（批號：J20070058，杭州默沙東制藥有限公司）；OVA（批號：A5503－1G，美國Sigma公司），大鼠OVA－IgE ELISA 試劑盒（批號：100826，美國R＆D公司）；數(shù)碼顯微鏡攝像系統(tǒng)（BX51，日本Olympus公司）；專業(yè)圖像分析處理軟件（Image－Pro Plus 6.0，美國 Media Cybernetics公司）。

1.2 方法

1.2.1 幼鼠EG模型建立及干預(yù)方法 參照文獻［2］建立EG模型，即采用低劑量OVA腹腔注射致敏聯(lián)合高劑量OVA灌胃激發(fā)建立EG幼鼠模型：在第0天給予每只幼鼠腹腔注射低劑量OVA和AL（OH）3混 懸液共 0.2mL［含 OVA 40μg，AL（OH）31mg］，在第2，4，7，9，11天腹腔注射低劑量 OVA 40μg（0.2mg／mL OVA溶液0.2mL）；在第 20，24，28，30 天給予高劑量 OVA 30mg（15mg／mL OVA 溶液2.0mL）灌胃激發(fā)。第20至30天，M0I1組和 M1I1組每天予10mg·kg－1·d－1MK灌胃給 藥 1 次，MK 干預(yù)劑量參 照文獻［3－4］。M0I0組和M1I0組同期予同等容量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 EG模型及 MK療效評價 在末次激發(fā)后18～24h處死幼鼠，無菌條件下剪開腹腔，留取空腸約1cm，分成2段，其中一段石蠟包埋，H－E染色后進行常規(guī)病理檢查和腸黏膜EOS計數(shù)；另一段速凍切片后進行腸黏膜MC觀察和計數(shù)（累計10個高倍視野內(nèi)MC總數(shù)及脫顆粒MC數(shù)）計算MC脫顆粒百分率：

通過觀察各組幼鼠腸黏膜病理改變、腸黏膜中EOS、MC計數(shù)及MC脫顆粒情況，對EG幼鼠模型及MK干預(yù)效果進行評估。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果以±s表示；采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。組間比較采用多樣本完全隨機設(shè)計方差分析，采用LSD法進行兩兩比較；采用析因方法分析各因素的效果。α＝0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 SD幼鼠空腸黏膜病理改變 M0I0組、M0I1組空腸腸黏膜形態(tài)基本完整，腸上皮完好，固有層無水腫、充血，未見炎癥細胞浸潤；M1I0組可見空腸腸黏膜破壞，小腸絨毛部分剝落，結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛上皮細胞局灶性脫落、壞死，固有層水腫、充血，大量炎癥細胞浸潤；M1I1組可見空腸腸黏膜破壞程度較輕，可見部分絨毛上皮細胞局灶性脫落、壞死，固有層輕度水腫、充血及炎癥細胞浸潤較M1I0組輕（圖1）。

圖1 各組SD幼鼠空腸黏膜病理變化（H－E ×200）Fig1 Groups of jejunum mucosa pathological changes in SD young rats（H－E ×200）

2.2 SD幼鼠空腸EOS密度 M0I0組、M0I1組幼鼠空腸黏膜內(nèi)僅偶見散在的EOS，且EOS結(jié)構(gòu)完整，無破碎；M1I0組空腸黏膜中有明顯的EOS浸潤、聚集，尤其是黏膜固有層內(nèi)較明顯；M1I1組空腸黏膜中仍有EOS浸潤、聚集，但較M1I0組明顯減少（圖2）。

圖2 各組SD幼鼠空腸黏膜中EOS表達（H－E ×400）Fig2 EOS expressed in jejunum mucosa of SD young rats（H－E ×400）

2.3 SD幼鼠空腸MC密度、MC脫顆粒率改變M0I0組、M0I1組空腸黏膜固有層偶見到散在的MC或者無MC，MC結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，無聚集、脫顆?，F(xiàn)象；M1I0組空腸黏膜內(nèi)大量MC聚集，固有層較多，胞質(zhì)顆粒呈紫紅色，胞核呈藍色，核形狀不規(guī)則呈橢圓形或分葉狀，伴胞膜破裂，輪廓不清，并向外排出紫紅色顆粒；M1I1組空腸黏膜內(nèi)MC聚集，固有層為主，部分伴胞膜破裂，輪廓不清，并向外排出紫紅色顆粒，但較M1I0組明顯減少（圖3）。

2.4 SD幼鼠空腸EOS密度、MC密度、MC脫顆粒率改變的析因方差分析結(jié)果

2.4.1 SD幼鼠空腸EOS密度的析因方差分析結(jié)果 建立OVA－EG模型可顯著增加幼鼠空腸黏膜中EOS密度，其引起幼鼠空腸黏膜中EOS密度增加的平均主效應(yīng)為12.8／高倍視野（high power field，HPF）；使用MK干預(yù)則可顯著降低幼鼠空腸黏膜中EOS密度，與未使用MK干預(yù)比較，其空腸黏膜中EOS密度降低的平均主效應(yīng)為－5.1／HPF（表1）。

圖3 各組SD幼鼠空腸黏膜中MC表達（甲苯胺藍染色 ×400）Fig3 MC expressed in jejunum mucosa of SD young rats（TBS ×400）

表1 各組SD幼鼠激發(fā)后EOS密度2×2析因設(shè)計結(jié)果Tab1 The EOS density of ANOVA two－way factorial in SD young rats after excited

2.4.2 SD幼鼠空腸 MC密度的析因方差分析結(jié)果 建立OVA－EG模型可顯著增加幼鼠空腸黏膜中MC密度，其引起幼鼠空腸黏膜中MC密度增加的平均主效應(yīng)為3.1／HPF；其空腸黏膜中 MC密度，與未使用MK比較，使用MK干預(yù)治療引起幼鼠空腸黏膜中MC密度降低的平均主效應(yīng)為－4.6／HPF（表2）。

表2 SD幼鼠激發(fā)后MC密度2×2析因設(shè)計結(jié)果Tab2 The MC density of ANOVA two－way factorial in SD young rats after excited

2.4.3 SD幼鼠空腸 MC脫顆粒率改變的析因方差分析結(jié)果 建立OVA－EG模型可顯著增加幼鼠空腸黏膜中MC脫顆粒率，其引起幼鼠空腸黏膜中MC脫顆粒率增加的平均主效應(yīng)為42.3%；使用MK干預(yù)則可顯著降低幼鼠空腸黏膜中MC脫顆粒率，與未使用MK干預(yù)比較，其空腸黏膜MC脫顆粒率降低的平均主效應(yīng)為－15.4%（表3）。

表3 各組SD幼鼠激發(fā)后MC脫顆粒率2×2析因設(shè)計結(jié)果Tab3 The rate of MC degranulation of ANOVA two－way factorial in SD young rats after excited

2.4.4 SD幼鼠空腸黏膜EOS密度、MC密度、MC脫顆粒率的析因方差分析結(jié)果 幼鼠空腸黏膜中MC脫顆粒率受到建立OVA－EG模型和使用MK干預(yù)兩個因素影響，F(xiàn)值分別為1 054.987，164.540，P值分別為0.000，0.000，建立 OVA－EG模型與使用MK干預(yù)之間存在交互作用（F＝162.373，P＝0.000），說明使用 MK干預(yù)可以降低建立OVA－EG模型引起的幼鼠空腸黏膜中MC脫顆粒率升高。在控制建立OVA－EG模型因素影響后，使用MK干預(yù)和未使用MK干預(yù)幼鼠空腸黏膜中MC脫顆粒率的邊緣估計均值及95%可信區(qū)間 （95%CI）分別為：32.4（30.5，34.2）%，48.8（47.0，50.7）%，組間因素檢驗，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

表4 幼鼠空腸黏膜EOS密度、MC密度、MC脫顆粒率的析因方差分析結(jié)果Tab4 The EOS density，MC density and MC degranulation rate of ANOVA factorial in jejunum mucosa of SD young rats

3 討 論

LTs是過敏反應(yīng)中重要的炎癥介質(zhì)，與過敏性疾病密切相關(guān)的為 LTB4、LTC4、LTD4，其中，LTC4、LTD4因含有半胱氨酰殘基，故稱為CysLTs。CysLTs主要由EOS、嗜堿性粒細胞和 MC釋放，CysLTs作用于CysLTR，引起氣道重塑和氣道高反應(yīng)；LTs可與其他多種炎性介質(zhì)相互作用，選擇性促進Th2型細胞因子如IL－4等的產(chǎn)生，誘導(dǎo)上皮細胞產(chǎn)生嗜酸性粒細胞趨化因子，加重組織的EOS炎癥［5］。在CysLTR中，將能夠被經(jīng)典半胱氨酰白三烯受體拮抗劑（cysteinyl leukotriene receptor anta－gonist，CysLTRA）如 MK、扎魯司特所拮抗的稱為CysLT1R，而對MK等不敏感者稱為CysLT2R。CysLTRA與CysLT1R特異性結(jié)合，阻斷CysLTs在過敏反應(yīng)中的作用，可以有效抑制EG的過敏反應(yīng)，為EG的治療提供一種新的途徑。CysLTRA副作用少、耐受性好，且對哮喘的治療有明顯的效果，近年來部分臨床醫(yī)生嘗試將其應(yīng)用于EG的治療。Quack等報道其所在醫(yī)院1例確診為EG的17歲女生采用強的松治療時臨床癥狀反復(fù)，后將強的松劑量增加至20mg／d，同時聯(lián)合 MK 10mg／d治療，癥狀消失后將激素減量并在6周內(nèi)停用，單用MK治療2年，臨床癥狀完全消失，各項血液檢查及內(nèi)鏡檢查均正常［6］。本組中，M1I0組幼鼠在OVA致敏激發(fā)后出現(xiàn)輕度豎毛，毛發(fā)失去光澤，活動減少，大便為成形稀便，其空腸腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，小腸絨毛部分剝落，結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛上皮細胞局灶性脫落、壞死，固有層水腫、充血，大量炎癥細胞浸潤；M0I0、M0I1組幼鼠在激發(fā)前后一般情況無明顯變化，毛發(fā)有光澤，無豎毛現(xiàn)象，活動如常，運動敏捷，大便成形；使用MK干預(yù)治療后，M1I1組幼鼠與沒有干預(yù)的EG模型組幼鼠比較，其豎毛減少，活動增加，大便明顯成形，且幼鼠空腸腸黏膜破壞程度減輕，僅見部分絨毛上皮細胞局灶性脫落、壞死，固有層輕度水腫、充血，炎癥細胞浸潤有所改善。這表明MK可以改善OVA致敏激發(fā)所致的臨床癥狀及腸道炎癥損傷。

目前對于CysLTRA治療EG的機制尚無明確、統(tǒng)一的結(jié)論。Wan等采用OVA致敏建立的EG的BALB／c小鼠模型，探討 MK在EG動物模型中的治療作用及可能的機制。干預(yù)組小鼠采用MK干預(yù)治療后，其毛發(fā)萎縮、腹瀉、活動減少、虛弱等臨床癥狀幾乎得到完全緩解，體質(zhì)量較模型組明顯增高（P＜0.01），外周血EOS濃度、IgE和LTD4水平較模型組明顯降低（P＜0.01），胃腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)幾乎正常或僅有輕度損傷，故筆者認(rèn)為：MK可能通過降低外周血IgE、LTD4以及EOS水平來達到治療 EG 的目的［7］。本研究結(jié)果也顯示，M1I0組SD幼鼠經(jīng)OVA激發(fā)后腸道黏膜中EOS密度、MC密度及MC脫顆粒率增加，M1I1組SD幼鼠經(jīng)MK干預(yù)后腸黏膜EOS密度、MC密度及MC脫顆粒率較M1I0組明顯降低，說明MK干預(yù)可顯著減少腸黏膜中EOS、MC浸潤及MC脫顆粒。析因設(shè)計的方差分析顯示：MK干預(yù)是腸黏膜EOS密度、MC密度及MC脫顆粒率改變的主要原因之一。這一結(jié)果提示，與未用MK干預(yù)治療的造模組比較，MK干預(yù)能夠明顯改善EG所致的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，抑制胃腸道炎癥反應(yīng)，達到治療EG的目的，可能與MK能抑制腸黏膜局部EOS、MC浸潤及MC脫顆粒有關(guān)。

綜上所述，MK可能通過減少EG動物幼鼠腸黏膜EOS浸潤、MC聚集及MC脫顆粒，從而改善OVA所致的腸道黏膜結(jié)構(gòu)損傷，減輕腸道充血、水腫，最終抑制EG所致的腸道炎癥反應(yīng)，達到治療EG的目的。因此，CysLTRA在臨床治療EG等變態(tài)反應(yīng)性疾病中具有廣闊的應(yīng)用前景。但本次研究只基于動物模型。在臨床治療中，如何選擇CysLTRA的起始劑量、長期維持劑量和療程的長短等問題目前尚無定論，故還需要大量的臨床研究加以證實及完善。

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