基于超高效液相色譜—質譜的藥物性肝損傷患者血清代謝組學研究

安卓玲　史忱　趙瑞　李鵬飛　劉麗宏

摘 要 利用超高效液相色譜與四級桿-軌道阱高分辨質譜儀聯(lián)用技術（UPLC-MS/MS）結合多變量統(tǒng)計分析方法，開展健康者與腫瘤藥物、中藥、他汀類降脂藥、抗菌藥引發(fā)肝損傷患者的血清代謝組學研究。血清樣本采用冰乙腈沉淀蛋白，HSS T3-C18色譜柱，水（含0.01%甲酸）與乙腈為流動相梯度洗脫，液相色譜串聯(lián)質譜分析測定?；诮】嫡吲c藥物性肝損傷初診病例代謝輪廓的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）以及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），尋找114個與藥物性肝損傷早期診斷密切相關的氨基酸類生物標志物，其中有38個代謝物在兩組間具有顯著差異（p<0.001）。對各組分離貢獻大的化合物進行串聯(lián)質譜分析，經Human Metabolome Database（HMDB）等數據庫檢索， 進行質譜信息匹配， 鑒定出與藥物性肝損傷相關的可能生物標志物苯丙氨酸和二甲基鳥苷。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜； 藥物性肝損傷； 血清； 代謝組學； 生物標志物

1 引 言

隨著新藥的廣泛應用以及聯(lián)合用藥的增多，藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）臨床常見且發(fā)病率有逐年上升趨勢[1～4]。藥物性肝損傷是指治療過程中使用治療劑量的藥物，機體受藥物及其代謝產物產生的毒性作用引起受藥機體肝臟損害，表現(xiàn)為肝細胞壞死、膽汁瘀積、脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化等各種肝病。臨床應用中各類藥物都有肝損傷的相關報道，以抗菌藥物、非甾體類抗炎藥、抗結核藥、抗腫瘤等藥物為主，中草藥與保健品的肝毒性發(fā)生率也有上升趨勢[5～8]。藥物性肝損傷是藥物本身對肝臟的損害，也可能是機體對藥物的特異質反應，原來沒有肝病的人群或以往就有肝病的患者都可能發(fā)生不同程度的肝臟損害[9，10]。據統(tǒng)計，約40%肝炎和25%急性肝衰竭都是由藥物引起的[11]，藥物性肝損傷在住院患者中的發(fā)病率為1%～5%，占急性肝損傷住院病例的10%[12]。因此，藥物性肝損傷指標的早期發(fā)現(xiàn)對于有效降低治療期間的用藥風險、保障患者的用藥安全至關重要。

目前，藥物治療過程中發(fā)生的肝損傷具有一定的隱匿性，易與基礎疾病癥狀混淆，臨床上缺乏用于藥物性肝損傷早期發(fā)現(xiàn)的敏感性和特異性小分子標志物，僅根據丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）等傳統(tǒng)指標， 聯(lián)合病理組織學檢查， 很難在肝損傷發(fā)生之前進行準確而及時的預警[13，14]。另外，現(xiàn)階段藥物性肝損傷的研究往往針對單一藥物的機制探討或回顧性分析，缺乏臨床常用藥物引發(fā)肝損傷的共性研究及共性判定指標，很難在相對獨立的研究結果中真正建立各類藥物肝損傷之間的聯(lián)系，嚴重阻礙了藥物性肝損傷的早期預警及防治[15，16]。代謝組學（Metabonomics）比單一靶標具有更好的預見性和可靠性，更有利于準確、有效地判定毒副作用程度，能夠尋找用于早期發(fā)現(xiàn)藥物性肝損傷的相關生物標志物，在疾病的早期發(fā)現(xiàn)、機制研究及藥物安全性評價等方面發(fā)揮重要作用[17～19]?；谒幬镄愿螕p傷研究中的難點問題，本研究率先采用LC-MS/MS技術開展健康者及臨床藥物肝損傷初診病例血清的代謝組學研究，探索內源性代謝物濃度變化與藥物性肝損傷之間的相關性，以臨床數據為基礎探索藥物性肝損傷相關的可能生物標志物。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UltiMate 3000 UPLC 系統(tǒng)（美國Thermo Scientific公司），配有雙三元液相色譜梯度泵系統(tǒng)（包含在線脫氣單元）、柱溫箱、DAD紫外檢測器及Chromeleon色譜系統(tǒng)控制軟件；Q EXACTIVE 四級桿-軌道阱高分辨質譜儀（美國Thermo Scientific公司），配有ESI源及Xcalibur數據系統(tǒng)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3-C18色譜柱 （10 cm × 2.1 mm， 1.8 μm）。SAVANT SPD121 P SpeedVac離心濃縮儀（美國Thermo Scientific公司）；Captiva 96 孔過濾板-0.2 μm（Agilent Technologies公司）。乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，德國Merck公司），實驗用純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2.2 樣品收集和制備

以臨床病歷診斷及肝臟狀態(tài)相關的酶學指標為依據，嚴格執(zhí)行入組標準與排除標準，收集了21例健康者與24例藥物性肝損傷（6例抗腫瘤藥物、4例中藥、13例降脂藥及1例抗菌藥物）初診患者的血清樣本（見表1），具體信息詳見附錄1。取100 μL血清，加入300 μL冰乙腈沉淀蛋白，渦旋4 min，于4℃下10000 r/min離心10 min ，取上清液200 μL，置于離心濃縮儀，在36℃條件下，干燥60～90 min。以200 μL 2%乙腈復溶，經0.2 μm Captiva 96 孔過濾板過濾，待UPLC-MS分析。

2.3 色譜-質譜條件及樣品分析

色譜條件：A超純水（含0.01%甲酸），B乙腈；梯度洗脫：0～9 min，2%～60% B； 9～18 min，60% B；18～20 min，60%～100% B。柱溫：50℃；流速：0.25 mL/min，進樣量5 μL。

質譜條件： 全掃描； 離子化方式： 加熱ESI源HESI； 噴霧電壓： 3500V（+）/3300（-）； 鞘氣： 4.46 MPa（+）/0.68 MPa（-）； 輔助氣： 1.02 MPa（+）/無（-）； 離子傳輸管溫度： 320℃。

質量掃描范圍為m/z 100～1000，分辨率70000 FWHM，使用氣體均為氮氣，數據采集軟件使用Xcalibur數據系統(tǒng)。被測樣品通過正、負離子模式的UPLC-MS譜分析后，利用信息依賴的數據采集（Information dependent acquisition， IDA）功能，獲得相關代謝物的MS/MS譜。碰撞能量（CE）設定為30 eV或 10 eV。正離子模式選用背景離子鄰苯二甲酸酯類物質的相關離子（m/z 149.0233， 279.1591， 391.2843）進行自動校正。endprint

本研究將健康者血清樣本進行混合制得質控樣本（Quality control，QC），通過連續(xù)6針進樣平衡系統(tǒng)，保證系統(tǒng)的適應性。另外，QC作為實際樣本插入檢測序列中，以QC數據的PCA得分圖監(jiān)測方法的穩(wěn)定性。

2.4 數據處理

對上述健康者與藥物性肝損傷血清樣本進行UPLC-（±）ESIMS分析，通過R命令的數據轉換方法，刪除若干同位素離子與加合離子，完成峰識別、峰對齊、峰匹配和峰強度校正，最終獲得包括保留時間、質荷比與峰面積的二維數據陣。再將轉化獲得數據陣導入SIMCA-P軟件 （version 13.0， Umetrics AB， Ume， Sweden）進行數據處理，建立模式識別模型并提取差異變量，獲得對分組有貢獻的變量。通過高分辨MS譜、MS/MS譜、網上數據庫檢索以及代謝物的質譜裂解規(guī)律對差異代謝物即可能生物標志物的結構進行鑒定。數據庫主要包括：human metabolite database （http：//hmdb.ca/）；PubChem compound database （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；METLIN （http：//metlin.scripps.edu/）；KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/ligand.html）。

3 結果與討論

3.1 健康者與藥物性肝損傷臨床患者的病例信息與酶學指標

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析方法對組間生化結果進行比較。藥物性肝損傷患者血清的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）均有異常升高，其中中藥、他汀類降脂藥相關肝損傷的血清ALT與AST顯著增加（p<0.01），抗腫瘤藥的血清ALT有明顯增加（p<0.05）， 一例抗菌藥相關肝損傷AST與ALT顯著增加，超過3倍正常值上限。

3.2 藥物性肝損傷的血清代謝組學研究

3.2.1 血清代謝輪廓分析 采用UPLC-MS/MS方法對24例藥物性肝損傷（6例抗腫瘤藥物、4例中藥、13例降脂藥及1例抗菌藥物）血清樣本進行樣本的分離與數據采集。在正、負離子檢測模式下，健康者與藥物性肝損傷患者的總離子流色譜圖（TIC，total ion chromatography）見圖1，兩組具有明顯差異，并且從正、負離子檢測模式下的同一樣本TIC圖可以初步看出兩種離子檢測模式的互補性，生物樣本中眾多代謝物得到了很好的分離，保留時間在27 min以內。本方法適合于代謝組學對于代謝物全面性、完整性的要求，滿足大樣本檢測分析的要求。

3.2.2 潛在生物標志物的鑒定 對數據進行正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis， OPLS-DA）分析，并使用偏最小二乘法判別分析（Partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA）模型進行置換驗證（Permutation test），從而避免相應模式的過度擬合，確保數據模型模型的可靠性。正離子檢測模式下血清樣本的OPLS-DA結果見圖2A，交叉驗證顯示預測能力Q2Y=0.706，46%的變量 [R2（X）] 可用于解釋79.5%的組間差異[R2（Y）]。負離子檢測模式下血清樣本的OPLS-DA結果見圖2B，Q2Y=0.83，45.8%的變量 [R2（X）] 可用于解釋88%的組間差異[R2（Y）]。置換驗證結果中R2Y（綠色三角）與真實模型的R2Y值共同構成的回歸線截距分別為0.186，經100次建模獲得的Q2Y（藍色方塊）與真實模型的Q2Y值共同構成的回歸線截距≤ 0.05，如圖3所示。以上結果表明， 在正、負離子檢測模式下，血清樣本的多變量數據模型符合參數標準，可有效、可靠地應用于可能生物標志物的篩選。

結合OPLS-DA模型中變量的VIP值，S-plot 載荷圖，帶Jack-knifed 置信區(qū)間的載荷圖和原始變量輪廓圖，對差異變量進行篩選和可靠性驗證，并通過均值t-檢驗刪除兩組間沒有顯著性差異（p>0.05）的變量。本研究共尋找114個與藥物性肝損傷早期診斷密切相關的生物標志物，其中有38種代謝物在兩組間具有顯著差異（p<0.001）。通過高分辨MS、MS/MS譜分析、網上數據庫檢索結合代謝物結構的質譜裂解特征，推斷可能生物標志物的結構，詳見附錄2，已鑒定出兩個可能生物標志物的結構，包括苯丙氨酸和二甲基鳥苷，如表2所示。

3.3 可能生物標志物的生物學意義

二甲基鳥苷是RNA的降解產物，有研究發(fā)現(xiàn)， 實驗動物猴的肝癌模型尿液中二甲基鳥苷濃度增加是tRNA甲基轉移酶活性與能力高度表達的結果[20]，但尚未有研究發(fā)現(xiàn)二甲基鳥苷與藥物性肝損傷之間的關聯(lián)。另外，肝臟是芳香族氨基酸的主要代謝場所，肝臟的氨基酸代謝減弱、肝細胞壞死及蛋白質分解加強會導致氨基酸在肝細胞中的濃度增高[21～24]。本研究中二甲基鳥苷與苯丙氨酸在藥物性肝損傷患者血清中的濃度異常增高，提示其可能為藥物性肝損傷相關的可能生物標志物，并且氨基酸與核苷代謝通路可能是藥物性肝損傷的重要代謝途徑。

4 結 論

本研究運用正、負離子檢測模式的UPLC-MS/MS 技術結合多變量統(tǒng)計分析方法進行了臨床藥物性肝損傷患者血清的代謝組學研究，已鑒定出兩個在肝損傷初診患者與健康人血清中存在顯著性差異的可能生物標志物結構，分別為苯丙氨酸和二甲基鳥苷。今后的研究將繼續(xù)對可能生物標志物的結構進行鑒定，并深入闡述其生物學意義，為藥物性肝損傷的早期發(fā)現(xiàn)提供依據。

References

1 Rangnekar A S， Fontana R J. Minerva Gastroenterol. Dietol.， 2011， 57（2）： 213-229endprint

2 Matsumoto K. Rinsho Byori.， 2011， 59（12）： 1117-1122

3 Suk K T， Kim D J. Clin. Mol. Hepatol.， 2012， 18（3）： 249-257

4 Corsini A， Ganey P， Ju C， Kaplowitz N， Pessayre D， Roth R， Watkins P B， Albassam M， Liu B， Stancic S， Suter L， Bortolini M. Drug Saf.， 2012， 35（12）： 1099-1117

5 Robles M， Toscano E， Cotta J， Lucena M I， Andrade R J. Curr. Drug. Saf.， 2010， 5（3）： 212-222

6 Senousy B E， Belal S I， Draganov P V. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol.， 2010， 7（10）： 543-556

7 Agúndez J A， Lucena M I， Martínez C， Andrade R J， Blanca M， Ayuso P， García-Martín E. Expert. Opin. Drug. Metab. Toxicol.， 2011， 7（7）： 817-828

8 GAO Xu-Dong， FAN Yan-Hua. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi.， 2009， 17（6）： 478-480

高旭東， 樊艷華. 中華肝臟病雜志， 2009， 17（6）： 478-480

9 XU Xin， QU Cai-Qin. Medical Recapitulate. 2008， 14（5）： 747-749

徐 鑫， 屈彩芹. 醫(yī)學綜述， 2008， 14（5）： 747-749

10 SUO Qi-Rong. China clinical practical medicine， 2010， 4（5）： 171-172

所齊嶸. 中國臨床實用醫(yī)學， 2010， 4（5）： 171-172

11 Denk H. Verb. Diseh. Ges. Pathol.， 2002， 86： 120-125

12 Meier Y， Cavallaro M， Roos M， Pauli-Magnus C， Folkers G， Meier P J， Fattinger K. Eur J Clin Pharmacol.， 2005， 61： 135-143

13 GAO Xu-Cong， CHAI Zhen-Hai， ZHANG Zong-Peng. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology， 2012， 26 （5）： 692-696

高緒聰， 柴振海， 張宗鵬. 中國藥理學與毒理學雜志， 2012， 26 （5）： 692-696

14 YANG Jiao， L Wen-Liang. Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， 2012， 21（12）： 1359-1363

楊 佼， 呂文良. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志， 2012， 21（12）： 1359-1363

15 Woodhead J L， Howell B A， Yang Y， Harrill A H， Clewell H J 3rd， Andersen M E， Siler S Q， Watkins P B. J. Pharmacol. Exp. Ther.， 2012， 342（2）： 529-540

16 Hawkins M T， Lewis J H. Expert. Opin. Drug. Metab. Toxicol.， 2012， 8（12）： 1521-1530

17 Nicholson J K， Everett J R， Lindon J C. Expert. Opin. Drug. Metab. Toxicol.， 2012， 8（2）： 135-139

18 Sreekumar A， Poisson L M， Rajendiran T M， Khan A P， Cao Q， Yu J， Laxman B， Mehra R， Lonigro R J， Li Y， Nyati M K， Ahsan A， Kalyana-Sundaram S， Han B， Cao X， Byun J， Omenn G S， Ghosh D， Pennathur S， Alexander D C， Berger A， Shuster J R， Wei J T， Varambally S， Beecher C， Chinnaiyan A M. Nature， 2009， 457（7231）： 910-914

19 Nicholson J K， Connelly J， Lindon J C， Holmes E. Nat. Rev. Drug. Discov.， 2002， 1（2）： 153-161

20 Lakings D B， Waalkes T P， Borek E， Gehrke C W， Mrochek J E， Longmore J，Adamson R H. Cancer Res.， 1977， 37（1）： 285-292

21 QIN Huan-Long. Parenteral & EnteralNutrition， 2004， 11（4）： 249-252

秦環(huán)龍. 腸外與腸內營養(yǎng)， 2004， 11（4）： 249-252

22 WU Ying， ZHENG Jin-Hui， LI Jing， GAO Ru. Chinese Medical Research & Chinical.， 2005， 3（1）： 38-40

武 英， 鄭錦輝， 李 晶， 高 茹. 中國醫(yī)學研究與臨床， 2005， 3（1）： 38-40

23 JIANG Chao-Hui， LIU Xue-Lian. International Journal of Digestive Diseases.， 1992， 12（2）： 68-71

姜朝暉， 劉學廉. 國外醫(yī)學消化系疾病分冊， 1992， 12（2）： 68-71

24 FENG Xiao-Ping， JIANG Ying， HUANG Mei-Ying. Amino acid & Biotic Resources.， 1994， （1）： 17-19

馮小平， 蔣 瀅， 黃美英. 氨基酸雜志， 1994， （1）： 17-19endprint