手性高效液相色譜—同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定土壤及蚯蚓中的六溴環(huán)十二烷對(duì)映體

田芹　佟玲　宋淑玲　王曉春　焦杏春　姜潤(rùn)飛

摘 要 采用高效液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-ID-MS/MS）建立了土壤和蚯蚓中手性α-，β-，γ-六溴環(huán)十二烷（HBCD）的分離分析方法。樣品添加d18-HBCDs作為同位素內(nèi)標(biāo)后提取，土壤樣品采用正己烷-二氯甲烷（1∶1， V/V）作萃取劑，加速溶劑萃?。ˋSE），硅膠固相萃取小柱凈化；蚯蚓樣品采用乙酸乙酯渦旋超聲提取，濃硫酸磺化后過硅膠小柱凈化。α-，β-，γ-HBCD各對(duì)映體的線性范圍為0.25～50 ng/mL；土壤中檢出限為0.00544～0.00766 ng/g，定量限為0.0173～0.0244 ng/g，在0.05和2.5 ng/g添加濃度的回收率為80.0%～95.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.7%～11.9%；在蚯蚓中，檢出限為0.0103～0.0148 ng/g，定量限為0.0328～0.0471 ng/g，在0.1和5.0 ng/g添加濃度的回收率為78.0%～94.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為6.1%～12.2%?？蓾M足實(shí)際樣品的測(cè)定要求。

關(guān)鍵詞 同位素稀釋； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 六溴環(huán)十二烷； 對(duì)映體； 土壤； 蚯蚓

1 引 言

六溴環(huán)十二烷（C12H18Br6，簡(jiǎn)稱HBCDs）是一種添加型阻燃劑，被廣泛應(yīng)用于聚苯乙烯泡沫、紡織品和電子產(chǎn)品等領(lǐng)域。研究表明，HBCDs為肝酶誘導(dǎo)劑，發(fā)育神經(jīng)毒劑和內(nèi)分泌干擾物[1]。在許多環(huán)境介質(zhì)中都被檢出，包括魚類[2]、鳥類[3]、灰塵[4]、土壤[5，6]、淤泥[7]、人體[8～10]，甚至北極地區(qū)[11]。HBCDs 的廣泛使用及其毒性已對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅，被斯德哥爾摩公約列為受審物質(zhì)。商品化的HBCD 產(chǎn)品主要由α-HBCD （10%～13%）、β-HBCD （1%～12%） 與γ-HBCD （75%～89%）[12]構(gòu)成。各異構(gòu)體結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其不同的環(huán)境行為及毒性風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)3種異構(gòu)體又是外消旋體，各對(duì)映體之間在環(huán)境和生物體內(nèi)也表現(xiàn)出不同的立體選擇性行為及毒性效應(yīng)。Du等[13]研究表明，斑馬魚選擇性富集（+）-α-HBCD 和（+）-γ-HBCD相應(yīng)的對(duì)映體。Zhang等[14]研究表明，（+）-α-，β-，γ-HBCD比相應(yīng)（-）-α-，β-，γ-HBCD對(duì)HepG2細(xì)胞毒性更大。因此，建立手性HBCDs在環(huán)境樣品中的分離分析方法，對(duì)于在對(duì)映體水平研究手性HBCDs的環(huán)境問題，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

目前，對(duì)HBCDs 異構(gòu)體的測(cè)定普遍采用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)[15，16]，傳統(tǒng)的非手性研究方法只能將一對(duì)對(duì)映體視作同一化合物進(jìn)行研究，同時(shí)在測(cè)定過程中，基質(zhì)化合物等因素對(duì)HBCDs的測(cè)定存在影響，而同位素稀釋法不僅能夠消除儀器波動(dòng)造成的系統(tǒng)差異影響，而且能補(bǔ)償樣品在前處理和檢測(cè)過程中基質(zhì)效應(yīng)。本研究利用手性液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法，建立了土壤和蚯蚓中α-，β-， γ-HBCD對(duì)映體的分離分析方法，不僅可以提供對(duì)映體的準(zhǔn)確信息，而且可以對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行準(zhǔn)確分析。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與樣品

Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；API4000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀及Analyst 1.5 數(shù)據(jù)采集軟件（美國(guó)AB應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；ASE200 加速溶劑萃取儀（美國(guó)Dionex公司）；PRO200勻漿器 （美國(guó)PRO公司）；KL512/509J型12位恒溫水浴氮吹儀（北京康林科技股份有限公司）；LABOROTA 4001-efficient（Heidoloph）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；硅膠固相萃取小柱 （3 mL， 500 mg， 德國(guó)CNW公司）；固相萃取裝置（Supelco公司）

外消旋體α-， β-， γ-六溴環(huán)十二烷（美國(guó)AccuStandard公司）； d18-六溴環(huán)十二烷（加拿大Wellington Laboratories 公司）； 13C-α-， β-， γ-六溴環(huán)十二烷（美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司）；甲醇、乙腈等試劑（色譜純，F(xiàn)isher公司）。

土壤樣品：分別取自北京、安徽和廣東的3份0～10 cm農(nóng)田表層土壤，自然陰干；蚯蚓：赤字愛勝蚓（Esenia fetida），購(gòu)自北京大環(huán)順鑫有機(jī)肥料廠，每條體重200～300 mg，環(huán)帶明顯的2月齡以上成熟蚯蚓。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Nucleodex β-PM手性色譜柱（200 mm×4.0 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（含5 mmol乙酸胺），梯度洗脫，優(yōu)化后的流動(dòng)相條件見表1。柱溫：室溫；流速：500 μL/min；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化方式，負(fù)離子模式檢測(cè)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式；離子噴射電壓（IS）：

4500 V；碰撞氣壓力（CAD）：55.16 kPa；氣簾氣壓力（CUR）：68.95 kPa；源內(nèi)氣體1壓力（GS1）：413.70 kPa；氣體2壓力（GS2）：344.75 kPa；霧化溫度（TEM）：300℃；其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

采用同位素稀釋技術(shù)進(jìn)行定量分析， 即用d18-HBCDs同位素內(nèi)標(biāo)定量，對(duì)定量?jī)?nèi)標(biāo)的回收率采用13C-HBCDs進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)計(jì)算。

HBCD及13C-HBCDs、d18-HBCDs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制： 分別量取α-，β-， γ-HBCD標(biāo)準(zhǔn)溶液， 用甲醇稀釋定容，配制成含3種異構(gòu)體各1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于

18℃條件下保存。使用時(shí)， 用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液， 配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。同法配制13C-HBCDs、d18-HBCDs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：用甲醇逐級(jí)稀釋?duì)?， β-， γ-HBCD儲(chǔ)備液， 得到單一對(duì)映體濃度分別為0.25，0.5， 2.5， 5， 25和50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中13C-HBCDs、d18-HBCDs單一對(duì)映體濃度均為5 ng/mL，于4 ℃下保存， 現(xiàn)用現(xiàn)配。endprint

2.4 樣品前處理

土壤：陰涼處自然晾干，粉碎后過40目篩。準(zhǔn)確稱取10 g樣品，加入5 g硅藻土混勻，放入22 mL ASE萃取池中，加入同位素稀釋定量?jī)?nèi)標(biāo)d18-HBCDs。以正己烷-二氯甲烷（1∶1， V/V）為提取劑，溫度100℃，壓力10 MPa，靜態(tài)提取5 min。萃取液40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸至近干，以2 mL正己烷溶解，過硅膠SPE小柱，用15 mL正己烷-乙酸乙酯（8∶2， V/V）洗脫，洗脫液在40℃水浴中氮?dú)獯到?，加?3C-HBCDs進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)，甲醇定容1 mL，待HPLC-MS/MS檢測(cè)。

蚯蚓：將蚯蚓樣品勻漿1 min，稱取5 g置于50 mL離心管中，加入同位素稀釋定量?jī)?nèi)標(biāo)d18-HBCDs。加25 mL乙酸乙酯渦旋提取3 min，超聲提取10 min，4000 r/min離心5 min，上清液過無水Na2SO4后轉(zhuǎn)入100 mL平底燒瓶中，另用25 mL乙酸乙酯按上述步驟重復(fù)提取殘留物，合并提取液于平底燒瓶中，45℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用10 mL正己烷溶解，濃H2SO4磺化凈化，濃縮約2 mL，過硅膠SPE小柱，步驟同土壤凈化。

3 結(jié)果與討論

3.1 手性HBCDs對(duì)映體分離條件優(yōu)化及出峰順序

依據(jù)文獻(xiàn)[13]，選擇乙腈-甲醇-水做流動(dòng)相體系，通過對(duì)流動(dòng)相組成比例的優(yōu)化，最終確定了流動(dòng)相組成比例，見表1。為了得到較高的靈敏度，加入甲酸和乙酸銨，5 mmoL乙酸銨被確定有較高的靈敏度，對(duì)映體的出峰順序依據(jù)文獻(xiàn)[12，13，17]確定， 典型色譜圖見圖1。

3.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

土壤：考察了正己烷-丙酮、正己烷-二氯甲烷、乙腈對(duì)土壤中HBCDs的ASE提取效果。結(jié)果表明，正己烷-二氯甲烷（1∶1，V/V）的回收率較好，乙腈提取回收率較低，而正己烷-丙酮提取出雜質(zhì)較多。不同萃取溫度（80℃，100℃和120℃）對(duì)回收率影響不大，但100℃時(shí)效果稍好。循環(huán)萃取2次回收率與循環(huán)3次相差不大。選擇正己烷-二氯甲烷（1∶1，V/V）作為萃取劑，100℃循環(huán)萃取2次。

蚯蚓：考察了乙酸乙酯、二氯甲烷對(duì)蚯蚓中手性HBCDs的提取效果。結(jié)果表明，這兩種溶劑對(duì)HBCDs的提取回收率都可達(dá)到要求，但是二氯甲烷在下層，離心后操作不方便，本研究選擇乙酸乙酯作提取溶液。

蚯蚓樣品的提取液含有血水、脂肪，顏色較深，直接過硅膠小柱，凈化效果很差，雜質(zhì)較多。本研究在過柱前先對(duì)提取液進(jìn)行了磺化，除去90%以上的脂類化合物和色素[18]，樣品溶液也變得干凈清澈。在待測(cè)組分的保留時(shí)間處均無雜質(zhì)干擾，HBCDs異構(gòu)體也未發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。因此，本研究采用以濃H2SO4磺化結(jié)合硅膠小柱凈化的方式凈化蚯蚓樣品。土壤樣品直接采用硅膠SPE小柱凈化。

3.3 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限

運(yùn)用所建立的HPLC-MS/MS方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定并建立校準(zhǔn)曲線。線性回歸分析結(jié)果表明，HBCDs的各個(gè)對(duì)映體在0.25～50 ng/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.999。方法檢出限以線性最低點(diǎn)0.25 ng/mL分別添加到10 g土壤和5g蚯蚓中，平行7份，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（S），檢出限以3.14 S（p=0.99）計(jì)算，定量限以10 S計(jì)算，結(jié)果見表3。

3.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

方法的準(zhǔn)確度通過空白添加回收率評(píng)估。在空白樣品中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到土壤中含各對(duì)映體濃度分別為0.05和2.5 ng/g的加標(biāo)樣品，蚯蚓中含各對(duì)映體濃度分別為0.1和5 ng/g的加標(biāo)樣品，進(jìn)行回收率測(cè)定。每個(gè)添加水平重復(fù)6次，計(jì)算重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，獲得方法的精密度（表4）。各對(duì)映體在土壤中不同濃度的添加回收率為80.0%～95.9%，RSD在5.7%～11.9%之間；在蚯蚓中不同濃度的添加回收率為78.0%～94.4%，RSD在6.1%～12.2%之間。同位素定量?jī)?nèi)標(biāo)d18-HBCDs各對(duì)映體回收率在69.2%～102.0%之間，RSD<14.3%。本方法精密度好，準(zhǔn)確度高。

3.5 實(shí)際樣品分析

采用本方法測(cè)定了3份實(shí)際土壤樣品和1份蚯蚓樣品，實(shí)驗(yàn)過程中d18-HBCDs同位素定量?jī)?nèi)標(biāo)的回收率為65.3%～104.0%，實(shí)際樣品中HBCDs的檢測(cè)結(jié)果見表5，典型色譜圖見圖2。從檢測(cè)結(jié)果可知，取自北京和安徽1#、3#農(nóng)田土壤樣品和4#蚯蚓樣品未檢出目標(biāo)化合物，沒有受到HBCDs的污染；而取自廣東的2#土壤樣品檢出 了（±）-αHBCD、（±）-β-HBCD和（±）-γ-HBCD，2#樣品可能受到廣東清遠(yuǎn)

4 結(jié) 論

建立了高效液相色譜同位素稀釋-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析土壤和蚯蚓中α-，β-， γ-六溴環(huán)十二烷3對(duì)對(duì)映體的方法，本方法能有效消除土壤和蚯蚓中的基質(zhì)干擾，保證分析檢測(cè)的準(zhǔn)確性；方法的靈敏度高，可以滿足實(shí)際樣品的測(cè)試需要。

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