渦旋輔助—液液萃取—?dú)庀嗌V法測(cè)定土壤中水和甲醇可提態(tài)五氯酚

于雄勝　柳勇　樓駿 　馮小莉　汪海珍　徐建明

摘 要 建立了渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜測(cè)定土壤中水和甲醇可提態(tài)五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）的方法。對(duì)渦旋轉(zhuǎn)速、液液體積比等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，即渦旋轉(zhuǎn)速為2000 r/min時(shí)PCP回收率最高，可達(dá)97.4%，重復(fù)性較好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.5%；衍生化溶液與正己烷的體積比為10∶4時(shí)PCP回收率為103%，RSD為0.7%。PCP提取測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1.25～4000 μg/L（R2=0.9999），方法檢出限在0.02 μg/L以下，測(cè)量范圍較寬，適合于痕量及微量PCP的分析。與傳統(tǒng)液液萃取和固相萃取相比，本方法采用渦旋輔助萃取后有機(jī)溶劑消耗量最低、操作步驟最少，且測(cè)定的PCP回收率最高，可達(dá)96.8%。4種不同類型土壤經(jīng)水提取一次和甲醇提取3次，在1和10 mg/kg PCP污染條件下，總回收率分別為89.5%～98.9%和88.7%～98.4%，說(shuō)明本方法滿足了不同類型土壤中水和甲醇可提態(tài)PCP在不同濃度范圍內(nèi)的提取測(cè)定要求。

關(guān)鍵詞 五氯酚； 渦旋輔助； 液液萃?。?水提態(tài)； 甲醇可提態(tài)； 土壤

1 引 言

五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）及其鈉鹽最初被用作殺菌劑、除草劑、除蟲劑以及木材防腐劑，在世界范圍內(nèi)廣泛使用。在我國(guó)，PCP還被長(zhǎng)期用于消滅稻田內(nèi)寄生血吸蟲的宿主釘螺[1]。PCP化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，且對(duì)生物體具有廣譜毒性和致突變性，被列為環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測(cè)的持久性有機(jī)污染物之一[2]。雖然包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家已禁止或限制使用PCP，但在某些血吸蟲回升地區(qū)繼續(xù)采用PCP除殺釘螺的現(xiàn)象仍然存在。如今，在水體以及土壤環(huán)境中還能檢測(cè)出微量或痕量PCP，對(duì)農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)以及人類健康構(gòu)成威脅[3]。

在對(duì)PCP分析檢測(cè)時(shí)，樣品的前期準(zhǔn)備（包括凈化和濃縮）至關(guān)重要[4]。溶液中PCP的傳統(tǒng)提取方法包括液液萃?。↙LE）[5]、固相萃?。⊿PE）[6，7]等。然而，LLE、SPE等方法需要耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑和樣品，需經(jīng)過濃縮后測(cè)定，整個(gè)操作程序復(fù)雜繁瑣；尤其是SPE方法在分析費(fèi)用上昂貴，目標(biāo)物也可能被吸附到柱子上，體系復(fù)雜時(shí)還容易堵塞柱子。近年，提取凈化方法趨向于向節(jié)省樣本、減少試劑消耗、降低環(huán)境污染、提高靈敏度、減少人工量的方向發(fā)展，由此建立了固相微萃取[8]、液相微萃取[9]以及由此衍生出的各種方法等。然而，微萃取也有一定弊端，如需使用一些特殊的裝置、試劑量太少，導(dǎo)致水分難以去除而對(duì)儀器有損害等。本研究借用微萃取思路對(duì)LLE方法進(jìn)行優(yōu)化，減少有機(jī)溶劑用量、保證脫水所需樣品用量，使之具有更廣譜的適用性。對(duì)于PCP的測(cè)定，常用的方法有氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器法 [10，11]、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]等。PCP經(jīng)衍生化后在氣相色譜的電子捕獲檢測(cè)器（ECD）上的靈敏度要高于液相色譜的紫外檢測(cè)器，又具有普遍性，常用于痕量PCP的分析。

本研究對(duì)溶液中PCP的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，基于渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜法測(cè)定了土壤中水和甲醇可提態(tài)PCP，其中水提態(tài)PCP是污染土壤中生物有效性和毒性最高的部分，易隨淋溶作用進(jìn)入地下水、河流等，造成水體污染[13，14]；甲醇可提取態(tài)代表易被有機(jī)質(zhì)等土壤組分吸附并固定的PCP[15]，二者同時(shí)測(cè)定更能全面反映其環(huán)境學(xué)意義。本方法減少了有機(jī)溶劑的用量，且有低的檢出限（LOD），為不同類型土壤中水和甲醇可提態(tài)PCP的準(zhǔn)確測(cè)定提供了方法選擇的依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

GC6890N氣相色譜儀（美國(guó)Agilent Technologies公司），配有ECD檢測(cè)器、7683B series自動(dòng)進(jìn)樣器、HP-5（30.0 m×320 μm， 0.25 μm）色譜柱等；MixMate渦旋儀（美國(guó)Eppendorf公司）；SK8210HP超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Mill-Q超純水儀（法國(guó)Millipore公司）；-9210K旋轉(zhuǎn)搖床（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Multifuge 3S離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）。

五氯酚（98%，美國(guó)Sigma公司）；正己烷和甲醇（色譜純，西班牙Scharlab公司）；丙酮（色譜純，Tida公司）；乙酸酐、K2CO3、H2SO4和無(wú)水Na2SO4（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）。

2.2 供試土壤

選取4種性質(zhì)差異較大的土壤為研究對(duì)象，分別為浙江水稻土、江西紅壤、黑龍江黑土以及河南潮土。土壤均采自0～20 cm表土層，風(fēng)干，過2 mm篩，基本理化性質(zhì)見表1。將以上4種土壤分別制備成1和10 mg/kg PCP污染土壤，即稱取4種土壤每種20 g各兩份于60 mL玻璃離心管中；吸取20和200 mg/L PCP的丙酮溶液各1 mL，分5次小心加入到裝有同種土壤的上述兩份離心管中，分別混合均勻，將離心管置于通風(fēng)櫥中將丙酮揮發(fā)完全，即成為PCP濃度為1和10 mg/kg 的污染土壤；不同土壤的制備過程相同。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制100和2000 μg/L的PCP-K2CO3標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mL，2000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、4.0和8.0 mL， 于10.0 mL介質(zhì)中，用0.5 mL乙酸酐衍生化后，加入4 mL正己烷萃取衍生化產(chǎn)物乙酸五氯苯酯，吸取部分有機(jī)相后，用無(wú)水Na2SO4干燥脫水并通過0.22 μm有機(jī)相濾膜，得濃度為1.25， 2.5， 5.0， 12.5， 25， 50， 100， 200， 500， 1000， 2000和4000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。endprint

2.3.2 土壤中水提態(tài)PCP的萃取測(cè)定 取PCP污染土壤2 g于 50 mL離心管中，加入超純水10 mL，于25℃下250 r/min振蕩60 min后，4000 r/min離心20 min，取上清液過0.45 μm有機(jī)相濾膜，按以下步驟測(cè)定水提態(tài)PCP：（1）純化 準(zhǔn)確吸取6 mL待測(cè)液于30 mL玻璃離心管中，加入0.5 mL 9 mol/L H2SO4充分酸化，使PCP全部以分子態(tài)存在（pH<4），再用6 mL正己烷渦旋振蕩2 min，使PCP進(jìn)入有機(jī)相，2500 r/min離心3 min后，吸除下層水相，上層正己烷相分別用0.2 mol/L K2CO3分兩次反萃，使PCP進(jìn)入K2CO3溶液中，合并兩次反萃溶液。（2）衍生化 在收集反萃液中，加入0.5 mL乙酸酐，搖動(dòng)玻璃離心管，釋放氣泡，25℃下200 r/min振蕩20 min，使PCP衍化生成乙酸五氯苯酯。（3）渦旋輔助萃取 衍生化后的溶液按優(yōu)化后的萃取條件加入適量正己烷進(jìn)行渦旋輔助萃取，以一定渦旋轉(zhuǎn)速萃取2 min。（4）脫水測(cè)定 2500 r/min離心3 min后，吸取上層有機(jī)相，用1 g無(wú)水Na2SO4干燥脫水，并過0.22 μm有機(jī)相濾膜后進(jìn)行測(cè)定。

2.3.3 土壤中甲醇可提態(tài)PCP的萃取測(cè)定 取2.3.2節(jié)中水提取后的土壤，倒盡上清液后，用9 mol/L H2SO4調(diào)至pH<4，加入10 mL甲醇進(jìn)行超聲提?。?5℃，54 kHz，30 min），然后3000 r/min離心10 min，收集上清液。用相同的方法繼續(xù)提取兩次，收集各自提取液于30 mL離心管中，用氮?dú)獯蹈芍良s0.5 mL，再加入0.2 mol/L K2CO3溶液10 mL， 乙酸酐0.5 mL振蕩發(fā)生衍生化反應(yīng)，最后按2.3.2節(jié)步驟（3）、（4）操作。

2.4 色譜條件

載氣為氮?dú)猓魉?.0 mL/min。升溫程序：柱初始溫度80℃，保持1 min，以30℃/min升溫到220℃，繼續(xù)以5℃/min升溫到230℃，保持3 min，最后以30℃/min升溫到250℃，保持1 min； 進(jìn)樣口溫度為250℃，ECD溫度為300℃。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，外標(biāo)法定量[11]。每個(gè)樣品分析時(shí)間為11.8 min。

2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0和Microsoft Office Excel 2013軟件進(jìn)行圖表編輯。圖表中，PCP回收率數(shù)據(jù)表示為算數(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析采用LSD法；所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均以α=0.05為顯著水準(zhǔn)，采用小寫字母標(biāo)注顯著性。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶液中PCP的萃取條件優(yōu)化

3.1.1 渦旋時(shí)間和轉(zhuǎn)速的影響

先比較了渦旋時(shí)間對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)在1～5 min范圍內(nèi)回收率沒有顯著差異，與文獻(xiàn)[4]的研究結(jié)果一致。為便于操作，所有渦旋時(shí)間都設(shè)定為2 min。之后考察了渦旋轉(zhuǎn)速（500、1000、1500、2000、2500和3000 r/min）對(duì)萃取率的影響。實(shí)驗(yàn)表明，隨著渦旋轉(zhuǎn)速的增大，回收率升高，重復(fù)性變好，500和2000 r/min時(shí)回收率分別為70.5%和97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.1%和0.5%；渦旋轉(zhuǎn)速大于2500 r/min后，回收率降低，重復(fù)性也變差，3000 r/min時(shí)回收率為79.2%，RSD為5.6%（圖1）。

究其原因，渦旋轉(zhuǎn)速達(dá)到3000 r/min時(shí)，溶液急劇旋轉(zhuǎn)，大量溶液濺到離心管蓋上，引起回收率降低；而轉(zhuǎn)速太低時(shí)，兩種液相不能充分混合，也導(dǎo)致回收率偏低。本研究選擇2000 r/min。

3.1.2 液液體積比的影響 研究了衍生化溶液與正己烷體積比（10∶6、10∶4、10∶3、10∶2、10∶1），對(duì)衍生化溶液萃取效率及穩(wěn)定性的影響。由表2可知，各萃取比下回收率在99.3%～111%之間，RSD在0.1%～2.2%之間，萃取的穩(wěn)定性隨著體積比的增大呈現(xiàn)出變差的趨勢(shì)。綜合而言，衍生化溶液-正己烷=10∶4（V∶V）時(shí)萃取測(cè)定的PCP回收率較高（103%），重復(fù)性較好（RSD為0.7%），且便于操作。

[

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在1.25～200 μg/L、200～4000 μg/L以及1.25～4000 μg/L范圍內(nèi)，待測(cè)液中PCP濃度（CPCP，μg/L）與色譜峰積分面積（A）有很好的線性關(guān)系，具有較寬的線性范圍。其回歸方程分別為： A=9.9665CPCP + 22.879（R2=0.9998）； A=9.9627CPCP-113.92（R2=0.9999）；A=9.5857CPCP-1.7667（R2=0.9999）。方法的LOD以信噪比3倍計(jì)為0.02 μg/L。說(shuō)明方法靈敏度高，適合于痕量及微量PCP的分析。

3.3 土壤中PCP的提取測(cè)定

3.3.1 反萃取回收率的驗(yàn)證

He等[16]研究表明，紅壤有機(jī)質(zhì)含量一般較低，在不同類型土壤中對(duì)PCP的吸附容量較小。因此，選取江西紅壤為測(cè)試土壤，制備干凈紅壤提取液并加標(biāo)至100 μg/L，萃取

后的有機(jī)相用10和6 mL K2CO3溶液分兩次反萃取，驗(yàn)證純化步驟中PCP的反萃取回收率。結(jié)果表明，第一次回收率為96.9%，RSD為1.2%；第二次回收率為4.4%，RSD為9.4%；兩次總回收率為100.9%，且有好的重復(fù)性（RSD為0.9%），可見兩次足以將PCP反萃取完全（表3）。

3.3.2 渦旋輔助萃取回收率的驗(yàn)證 同3.3.1節(jié)制備干凈紅壤提取液并加標(biāo)到100 μg/L，驗(yàn)證渦旋輔助萃?。╒ALLE）步驟中PCP的回收率，并與LLE、SPE方法比較。LLE方法參照環(huán)保部591-2010標(biāo)準(zhǔn)[5]，回收率為91.4%，RSD為2.6%；SPE方法參照文獻(xiàn)[6]，回收率為83.3%，RSD為5.2%； VALLE方法回收率達(dá)96.8%，RSD為3.8%（圖2）。相比于LLE、SPE方法，endprint

VALLE方法有機(jī)溶劑消耗量最低、操作步驟最少，且回收率最高。尤其是，渦旋輔助可以縮短提取時(shí)間[17]，并減小處理間人為操作的不穩(wěn)定性。

3.3.3 水和甲醇可提態(tài)PCP的提取測(cè)定 采取水和甲醇連續(xù)提取的方法，結(jié)合之前摸索出的最佳提取條件，在不同類型土壤（水稻土、紅壤、黑土、潮土）以及不同污染條件（1， 10 mg/kg）下驗(yàn)證渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜法在PCP測(cè)定中的可靠性。由圖3可見，4種土壤在1 mg/kg PCP污染條件下總回收率為89.5%～98.9%，10 mg/kg PCP污染條件下總回收率為88.7%～98.4%；1 mg/kg PCP污染土壤回收率重復(fù)性優(yōu)于10 mg/kg PCP污染土壤。不同類型土壤總的回收率在1 mg/kg PCP污染條件下有顯著差異（P<0.05），而10 mg/kg PCP污染條件下無(wú)顯著差異；不同污染條件下水稻土和黑土的總回收率最高，潮土最低，但總回收率均符合要求，說(shuō)明用水提取1次以及甲醇提取3次可將PCP提取完全。不同類型土壤中PCP的水提取比例有顯著差異（P<0.05），水提取比例呈現(xiàn)出從水稻土到潮土逐漸升高的趨勢(shì)。這主要是因?yàn)?，PCP在水中的溶解度受pH值影響較大[18]，隨著土壤pH值的升高，水提取比例也逐漸上升；粒徑含量大小也會(huì)影響土壤對(duì)PCP的吸附，其中較高的粘粒含量下土壤對(duì)PCP吸附作用增強(qiáng)[19]，導(dǎo)致水提取態(tài)比例呈降低趨勢(shì)（潮土除外），這與文獻(xiàn)[10]的研究結(jié)果一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，渦旋輔助-液液萃取-氣相色譜法滿足了不同類型土壤中不同形態(tài)PCP在不同濃度范圍內(nèi)的提取測(cè)定，為水和甲醇可提態(tài)PCP的準(zhǔn)確測(cè)定提供了方法選擇的依據(jù)。

References

1 Liu Y， Li F B， Xia W， Xu J M， Yu X S. Chemosphere， 2013， 91（11）： 1547-1555

2 Zheng W W， Wang X， Yu H， Tao X G， Zhou Y， Qu W D. Environ. Sci. Technol.， 2011， 45（11）： 4668-4675

3 Zheng W W， Yu H， Wang X， Qu W D. Environ. Int.， 2012， 42（SI）： 105-116

4 Farhadi K， Farajzadeh M A， Matin A A， Hashemi P. Cent. Eur. J. Chem.， 2009， 7（3）： 369-374

5 Water Quality-determination of Pentachlorophenol by Gas Chromatography. National Standards for Environmental Protection of the People′s Republic of China. 591-2010

水質(zhì)五氯酚的測(cè)定氣相色譜法. 中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn). 591-2010

6 YANG Qiu-Hong， CHENG Xiao-Yan， YANG Ping， QIAN Shu， DAN De-Zhong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（8）： 1208-1212

楊秋紅， 程小艷， 楊 坪， 錢 蜀， 但德忠. 分析化學(xué)， 2011， 39（8）： 1208-1212

7 ZHOU Rui-Juan， DUAN Lian， SUN Xiao-Jie， WU Cai-Ying， XING Jun. Chem. J. Chinese Universities， 2010， 31（10）： 1945-1948

周瑞娟， 段 煉， 孫曉杰， 吳采櫻， 邢 鈞. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 31（10）： 1945-1948

8 Morales R， Ortiz M C， Sarabia L A. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 403（4）： 1095-1107

9 Li X Y， Xue A F， Chen H， Li S Q. J. Chromatogr. A， 2013， 1280： 9-15

10 SUN Lei， JIANG Xin， ZHOU Jian-Min， WANG Dai-Zhang， KONG De-Yang， TAO Run-Xian. Chinese J. Anal. Chem.， 2003， 31（6）： 716-719

孫 磊， 蔣 新， 周健民， 王代長(zhǎng)， 孔德洋， 陶潤(rùn)先. 分析化學(xué)， 2003， 31（6）： 716-719

11 Hayat T， Ding N， Ma B， He Y， Shi J C， Xu J M. J. Environ. Qual.， 2011， 40（6）： 1722-1729

12 He Y， Xu J M， Wang H Z， Wu Y P. Environ. Pollut.， 2007， 147（2）： 343-349

13 Subramanian B， Namboodiri V， Khodadoust A P， Dionysiou D D. J. Hazard. Mater.， 2010， 174（1-3）： 263-269

14 ZHU Xiao-Ping， LI Xiao-Min， Li Yong-Tao， LIN Zhong， CAI Yan-Fei， DONG Jun. J. Agro-Environ.Sci.， 2011， （11）： 2218-2224

朱小平， 李曉敏， 李永濤， 藺 中， 蔡燕飛， 董 軍. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， （11）： 2218-2224

15 Xu T， Lou L P， Luo L， Cao R K， Duan D C， Chen Y X. Sci. Total Environ.， 2012， 414： 727-731

16 He Y， Xu J M， Wang H Z， Zhang Q C， Muhammad A. Chemosphere， 2006， 65（3）： 497-505

17 LENG Geng， LU Gui-Bin， CHEN Yong， YIN Hui， DAN De-Zhong. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（11）： 1752-1757

冷 庚， 呂桂賓， 陳 勇， 尹 輝， 但德忠. 分析化學(xué)， 2012， 40（11）： 1752-1757

18 Xing L Q， Liu H L， Giesy J P， Yu H X. Sci. Total Environ.， 2012， 441： 125-131

19 He Y， Xu J M， Wang H Z， Ma Z H， Chen J Q. Environ. Res.， 2006， 101（3）： 362-372endprint